HBsAg进入体外培养的人绒毛膜滋养层细胞的初步研究

目的检测HBsAg进入体外培养的人绒毛膜滋养层细胞的情况,为HBV宫内传播机制研究提供理论依据。方法用胰蛋白酶(0.25%)-DNase Ⅰ(0.15 U/ml)联合消化法,获取纯度较高的人绒毛膜滋养层细胞。将状态良好的对数生长期人绒毛膜滋养层细胞分为6组,HBsAg-anti-HBs 复合物组(Ⅰ),热灭活的HBsAg、HBeAg、anti-HBc均阳性血清和高滴度anti-HBs阳性血清共同孵育物组(Ⅱ), 热灭活的HBsAg、HBeAg、anti-HBc均阳性血清组(Ⅲ),HBsAg组(Ⅳ),热灭活的正常人血清组(Ⅴ),及正常细胞培养液组(Ⅵ,空白对照组)。分别收集各组细胞铺片,免疫组化检测细胞的感染状况。结果所获人绒毛膜滋养层细胞纯度较高,符合后续实验要求。用鼠抗人anti-HBs免疫组化检测收集的细胞铺片,发现Ⅰ、Ⅱ组均有大量HBsAg阳性信号,Ⅲ组细胞亦有少量HBsAg阳性信号出现,其他各组细胞均未发现HBsAg阳性信号。结论体外培养的人胎盘滋养层细胞能将HBsAg-抗HBs复合物中的HBsAg,但不能将单独的HBsAg“摄入”胞内。     

HBV感染胎盘滋养细胞的体外研究

目的：对早孕绒毛的滋养细胞进行原代培养,利用HBV感染血清对滋养细胞进行体外感染,探讨细胞在体外培养条件下对HBV的感染率及HBV在细胞中的复制状态．方法：利用胰蛋白酶和胶原酶联合消化培养法原代培养早孕胎盘中的滋养细胞,并进行免疫组化鉴定,获得纯度较高的滋养细胞后进行体外的HBV感染,通过细胞免疫化学染色、ELISA及PCR法分别检测细胞上清中的HBsAg,细胞中的HBVDNA及cccDNA．结果：原代培养的滋养细胞,细胞生长良好,特异性角蛋白一7阳性,纯度高．原代滋养细胞在与HBV阳性血清共同孵育后均未出现明显的细胞病变,感染后24h和48h在滋养层细胞细胞浆中可见HBsAg的阳性表达,被感染细胞呈散在分布．感染后48h起可检测到弱阳性的HBsAg及HBVDNA,感染后细胞内未检测出cccDNA．结论：利用联合酶消化法建立了胎盘中滋养细胞的体外培养系统．HBV能够在体外感染原代培养的滋养细胞,对被感染细胞的生长无明显影响．HBV可能不在滋养细胞中复制．     

HBsAg进入体外培养的人绒毛膜滋养层细胞的初步研究

目的：检测HBsAg进入体外培养的人绒毛膜滋养层细胞的情况，为HBV宫内传播机制研究提供理论依据。方法：用胰蛋白酶（0．25％）－DNase I(0.15U/ml)联合消化法，获取纯度较高的人绒毛膜滋养层细胞。将状态良好的对数生长期人绒毛膜滋养层细胞分为6组，HBsAg-anti-HBs复合物组（I），热灭活的HBsAg、HBsAg、anti-HBc均阳性血清和高滴度anti-HBs阳性血清共同孵育物组（Ⅱ），热灭活的HBsAg、HBeAg、anti-HBc均阳性血清组（Ⅲ），HBsAg组（Ⅳ），热灭活的正常人血清组（Ⅴ），及正常细胞培养液组（Ⅵ，空白对照组）。分别收集各组细胞铺片，免疫组化检测细胞的感染状况。结果：所获人绒毛膜滋养层细胞纯度较高，符合后续实验要求。用鼠抗人anti-HBs免疫组化检测收集的细胞铺片，发现I、Ⅱ组均有大量HBsAg阳性信号，Ⅲ组细胞亦有少量HBsAg阳性信号出现，其他各组细胞均未发现HBsAg阳性信号。结论：体外培养的人胎盘滋养层细胞能将HBsAg-抗HBs复合物中的HBsAg，但不能将单独的HBsAg“摄入”胞内。     

TNF-α对HBV体外感染人胎盘绒毛膜滋养层细胞的促进作用

目的:研究TNF-α对HBV体外感染人胎盘绒毛膜滋养层细胞的促进作用,建立HBV与人胎盘绒毛滋养层细胞相互作用的稳定体外感染模型.方法:绒毛膜癌细胞系JEGⅢ细胞作为滋养层细胞模型,分别在促感染因子TNF-α存在和不存在情况下,与HBV阳性血清(2×1012HBV DNA/L)共同孵育.感染后24 h,PBS充分洗涤感染体系,直至最后一遍洗液HBsAg阴性.加新鲜培养液继续培养,每隔12 h,收集培养标本,分别用Western blott,透射电镜,ELISA,和PCR检测培养物中HBV标志物.结果:在TNF-α不存在的感染环境下,细胞标本中HBV标志物呈阴性或弱阳性.而在TNF-α存在的感染环境下,细胞标本中HBV标志物呈阳性或强阳性,感染效率大大增强(P<0.01).但各时间点之间的感染效率差异不显著.结论:在TNF-α存在的环境下,HBV体外可以成功感染滋养层细胞.该体外细胞感染模型是深入研究HBV宫内传播机制的关键.     

乙型肝炎病毒体外感染人绒毛膜癌JEG3细胞的实验研究

目的建立乙型肝炎病毒(HBV)体外感染人绒毛膜癌滋养层细胞(JEG3)模型,探讨HBV宫内感染机制。方法应用HBV阳性且高载量的血清,感染JEG3细胞。应用实时荧光定量PCR(RT-PCR)技术检测感染后细胞上清液和细胞内的HBV载量;应用ELISA方法检测感染后不同时间、不同代次上清液的HBsAg、HBeAg浓度;应用SP免疫组化检测感染细胞内HBsAg、HBeAg的表达。结果感染初代的JEG3细胞,随着时间增加病毒载量亦增加。传代后细胞及上清中的HBV载量随传代次数增加逐渐降低,5代后检测均为阴性;感染初代上清液HBsAg含量随时间增加,120h含量最高。传代细胞的上清液HBsAg检测1～4代为阳性,但浓度逐渐降低,5代后均为阴性。上清液的HBeAg检测,各时间点、各代均为阴性;1、2、3、4代细胞HBsAg、HBcAg染色可见阳性细胞。结论HBV可以在体外感染滋养层细胞,且能在传代细胞中有持续的表达。感染过程中参与调控的相关细胞因子及HBV复制的持续与否有待进一步探讨。     

乙肝病毒标志物阳性血清感染胎盘滋养层细胞的体外研究

目的提供血清中的HBV病毒能进入体外培养的滋养层细胞(HPT-8)的依据。方法用HBV阳性血清体外感染HPT-848h,设感染组和对照组。ELSIA检测细胞培养上清中HBsAg、HBeAg,PCR检测细胞培养上清和细胞中HBVDNA,细胞免疫组织化学法检测细胞中HBsAg、HBcAg,免疫荧光定量PCR检测细胞培养上清中HBVDNA的含量。结果ELISA检测PBS洗8次后第1、2代感染细胞的培养上清的HBsAg、HBeAg均呈阳性;PCR在感染细胞第1、2代的培养上清中检测到HBVDNA特异的片断;第1、2代感染细胞中检测出了rcDNA,第1代感染细胞中检测出了cccDNA;免疫组化检测感染组第2代细胞中HBsAg阳性;荧光定量PCR检测感染细胞第1、2代培养上清中HBVDNA的滴度分别为8×104拷贝/ml和4.6×103拷贝/ml,第3代<103拷贝/ml。结论血清中的HBV病毒能进入HPT-8,但在HPT-8内很难复制、繁殖。     

乙型肝炎病毒感染原代培养人绒毛膜滋养层细胞的实验研究

目的探讨原代培养的人绒毛膜滋养层细胞感染乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）的可能性及规律。方法采用胰酶/DNA酶序贯消化及Percoll密度梯度离心分离纯化人绒毛膜滋养层细胞后,采用血清直接感染法进行滋养层细胞的HBV感染,同时通过与对正常成人肝细胞株L02细胞的HBV感染后及转染HBV的肝癌细胞株（HepG2.2.15）的传代培养比较,实时荧光定量PCR检测培养上清的HBV DNA;并用透射电镜观察HBV感染后滋养层细胞的超微结构改变及其在滋养层细胞中的定位。结果原代培养的滋养层细胞感染HBV后释放至培养上清中的HBV DNA于感染后48-72h达高峰,而L02细胞则于感染后12-24h达高峰,HepG2.2.15细胞株感染后则一直攀升。透射电镜观察HBV感染后滋养层细胞超微结构发生了明显改变,主要表现为溶酶体大量增生,出现空泡状结构,并可观察到病毒样颗粒,主要定位于细胞核周。结论HBV可以感染滋养层细胞,定位于核周并导致滋养层细胞的超微结构改变。     

HBsAg阴性孕妇乙型肝炎病毒宫内感染检测分析

目的:探讨使用荧光定量PCR方法检测乙型肝炎表面抗原(HBsAg)阴性孕妇乙型肝炎病毒(HBV)宫内感染情况。方法:选择住院分娩的HBsAg阴性孕妇,使用荧光定量PCR方法检测孕妇及其新生儿的血清中HBV-DNA。结果:502例HBsAg阴性孕妇血清HBV-DNA阳性40例,其中27例发生宫内感染,宫内感染总阳性率5.38%。以HBeAb+HBcAb+组合模式的宫内感染率最高,达12.50%,而HBVM全阴性者发生宫内感染率最低,为1.10%。结论:HBsAg阴性孕妇也可能发生HBV宫内感染,采用灵敏度高的荧光定量PCR方法检测HBsAg阴性孕妇及新生儿血清中HBV-DNA,对发现其HBV宫内感染有重要意义。     

用荧光探针定量多聚酶链反应技术检测乙肝病毒宫内传播的研究

目的：探讨孕妇血中乙肝病毒（HBV）DNA数量与宫内传播的关系。方法：用荧光探针定量多聚酶链反应（FQ-PCR）方法,检测76例乙肝病毒表面抗原（HBsAg)阳性孕妇血清中HBVDNA数量,26例HBVDNA阳性者肌注乙肝免疫球蛋白,新生儿出生后24h内取末梢静脉血检测HBVDNA,结果：孕妇血中HBVDNA阳性者其宫内感染率为33.3%,宫内感染与孕妇血中HBVDNA数量有关,HBVDNA数量高易导致胎儿宫内感染,乙肝免疫球蛋白免疫注射后可降低HBV宫内感染率,结论：孕妇血中HBVDNA数量高易导致胎儿宫内感染,孕期应用乙肝免疫球蛋白可减少宫内传播。     

乙型肝炎病毒宫内感染的机制

目的 探索乙型肝炎病毒（HBV）宫内传播的机制和时间。方法 孕妇和新生儿血清HBsAg和HBVDNA检测采用ELISA和PCR法,引产胎儿肝组织和胎盘的HBsAg,HＢt HBVDNA检测采用ＡＢＣ免疫组化染色和原位杂交。结果 母亲外周血HBV高浓度（≥0.02ug.L^-1)、先光早产和胎盘毛毛细血管内皮细胞HBV感染导致宫内感染发生的危险性比值比（OR）分别为7.06,13.08和16.15,胎盘HBV感染从孕早期、孕中期至足月分娩愈来愈严重且广泛,在足月分娩胎盘中,从母面蜕膜细胞至胎儿面绒毛毛细血管内皮细胞HBV感染率呈逐渐下降趋势,但胎儿宫内感染的OR值却越来越大,1例孕19wk引产胎儿肝组织中检出HBVDNA和抗原。结论 胎儿宫内感染的发生可经2条途径,即血源性和细胞性,宫内感染可发生孕9wk前,但主要时期是在孕晚期。     

HBsAg阳性孕妇足月分娩胎盘HBV感染状态的免疫组织化学研究

目的：拟从观察胎盘乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）感染状态，探讨ＨＢＶ宫内传播发生的机制，以期为进一步预防ＨＢＶ宫内传播提供科学依据．方法：采用ＡＢＣ免疫组织化学染色检测ＨＢｓＡｇ阳性孕妇足月分娩胎盘ＨＢｓＡｇ和ＨＢｃＡｇ感染和分布状态．结果：在６２例足月分娩胎盘中，２１例检出了ＨＢｓＡｇ，８例检出ＨＢｃＡｇ．ＨＢｓＡｇ主要分布于蜕膜血管内皮细胞（１８例）、蜕膜细胞（２１例）、滋养层细胞（８例）、绒毛间质细胞（８例）和绒毛血管内皮细胞（５例）的胞浆和绒毛间隙（２１例）中．ＨＢｃＡｇ分布于蜕膜细胞（５例）、蜕膜血管内皮细胞（８例）和绒毛间质细胞（８例）的胞核内．结论：结果提示，ＨＢＶ可在胎盘组织中复制．ＨＢＶ经胎盘感染胎儿的主要途径可能是经血和（或）细胞传递方式实现的．即ＨＢＶ经蜕膜细胞和（或）绒毛间感染滋养层细胞，然后感染绒毛间质细胞，最终感染胎儿毛细血管内皮细胞     

乙型丙型肝炎病毒合并感染细胞模型的建立

目的：本文拟利用慢病毒载体,在可感染丙型肝炎病毒（HCV）的Huh7.5.1细胞中过表达人肝细胞乙型肝炎病毒（HBV）受体钠离子牛磺胆酸共转运蛋白（sodium taurocholate cotransporting polypeptide, NTCP）编码基因,建立Huh7.5.1- hNTCP细胞模型,使其可以被HBV、HCV共同感染。方法：使用携带人NTCP编码基因、GFP（green fluorescent protein）基因、嘌呤霉素抗性基因的GV358重组慢病毒载体,以50的感染复数（MOI）感染Huh7.5.1细胞。经过嘌呤霉素筛选获得稳定表达人NTCP基因的Huh7.5.1-hNTCP细胞株,并通过Western-blotting验证NTCP蛋白的表达。使用HepAD38细胞来源的HBV感染Huh7.5.1-hNTCP细胞,通过ELISA及qPCR等方法检测HBV感染后不同时间点HBsAg、HBeAg的表达以及HBV DNA的复制。HBV感染后24小时予以HCV-JFH1感染,检测合并感染状态下HBV DNA以及HCV RNA的复制。结果：Western-blotting 结果表明Huh7.5.1-hNTCP细胞株可稳定表达HBV受体NTCP。HBV感染Huh7.5.1-hNTCP细胞后ELASA、qPCR结果显示：HBsAg、HBeAg、HBV DNA合成逐渐增加,并在第9天达峰。HBV/HCV合并感染Huh7.5.1-hNTCP细胞后,qPCR检测结果显示不同时间点HBV DNA、HCV RNA复制逐渐增加。结论:建立了Huh7.5.1-hNTCP细胞模型,该模型可被HBV/HCV合并感染。     

122例艾滋病患者合并乙肝病毒 丙肝病毒感染的临床流行病学研究

目的 研究在抗逆转录病毒药物治疗(HAART)状态下HIV/AIDS患者合并乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)的流行状况以及相关血清生化和病毒学特征.方法 对122例正在接受HAART治疗的HIV/AIDS患者采集血标本,使用酶免法(ME-IA)检测乙肝五项指标(HBs Ag、抗-HBs、HBe Ag、抗-HBe、抗-HBc)、肝功能,应用酶联免疫吸附法(ELISA)检测丙型肝炎病毒抗体,运用RT-PCR法对丙肝病毒抗体阳性标本以及表面抗原和/或核心抗体阳性标本分别进行HCV-RNA以及HBV-DNA测定.以43名单纯HCV感染者作为对照组进行研究.结果 122名 HIV/AIDS患者,乙肝五项指标全阴性97例(78.86％),表面抗原阳性3例(2.46％),表面抗体阳性者总计19例(15.57％),单纯核心抗体阳性者3例(2.46％).HCV 抗体阳性84例(68.85％),84例HCV抗体阳性标本中HCV-RNA 阳性58例(69.05％),HIV/HCV/HBV合并感染者为0.HIV/HCV合并感染组 HCV-RNA 水平与感染者性别,CD4 +细胞数水平无明显差异(P＞0.05);HIV/HCV合并感染组与单纯HCV感染组 HCV-RNA水平、肝功能异常率无明显差异(P＞0.05).结论 HIV感染者HBsAg阳性率低于普通人群,HIV/HCV合并感染的比例显著高于普通人群.HIV/HCV合并感染与单纯HCV感染者血清生化及病毒学改变相似.     

原代培养人肝细胞体外乙型肝炎病毒感染和乙型肝炎病毒表面抗原黏附模型初探

目的研究建立人肝细胞体外乙型肝炎病毒（HBV）感染模型和乙型肝炎表面抗原（HBsAg）黏附模型，为后期研究小分子抗体Fab的作用打下基础。方法体外原代培养人肝细胞，对人原代肝细胞进行HBsAg黏附实验及HBV感染实验。采用正常人胎肝细胞系（L-02）及鼠原代肝细胞进行实验对照。倒置相差显微镜下观察细胞形态，生化法检测其白蛋白分泌功能。免疫组化法检测HBsAg黏附情况和HBV感染肝细胞内HBsAg的表达。酶联免疫吸附试验（ELISA）检测肝细胞感染HBV后HBsAg的持续表达。PCR检测肝细胞内HBV复制中间体-闭合环状双链DNA（cccDNA）。结果人原代肝细胞体外培养达2周以上。HBsAg黏附实验检测到HBsAg可黏附于人原代肝细胞、L-02、鼠原代肝细胞胞膜。HBV体外仅感染人原代肝细胞，从第2天起即可检测到细胞培养上清中存在HBsAg，并持续到观察结束第16天，免疫组化检测人原代肝细胞内HBsAg呈阳性；PCR检测到人原代肝细胞内存在HBV—cccDNA，而L—02及鼠原代肝细胞实验检测结果均为阴性。结论人原代肝细胞体外分离培养成功，HBsAg黏附和HBV感染模型初步建立于人原代肝细胞。     

针对病毒性心肌炎的细胞凋亡研究

目的 探讨柯萨奇病毒致细胞死亡时是否存在凋亡，以及凋亡百分率。方法 柯萨奇病毒感染心肌细胞和HeLa细胞以后，应用TUNEL原位标记、DNALadder、Hoechst3325B染色和Annexin—V／PI染色观察细胞凋亡发生情况；并通过流式细胞仪分析细胞凋亡发生率。结果 Hoechst33258染色发现病毒感染后的细胞核出现强亮度的蓝色荧光，可观察到凋亡细胞的典型变化；Armexin—V／PI染色可见HeLa细胞膜显强绿色荧光。细胞核显强红色荧光；感染组细胞DNA出现阶梯状条带影。通过流式细胞仪检测被PI染色的细胞DNA．发现病毒感染组出现凋亡峰，凋亡率为49．5％。结论 柯萨奇病毒致病毒性心肌炎时细胞不仅存在凋亡，而且是细胞主要死亡形式。     

Relationship between Maternal PBMC HBV cccDNA and HBV Serological Markers and its Effect on HBV Intrauterine Transmission

Objective To investigate the relationship between maternal peripheral blood mononuclear cells (PBMC) hepatitis B virus(HBV) covalenty closed circular deoxyribonucleic acid(cccDNA) and other HBV serological markers and its effects on HBV intrauterine transmission. Methods We enrolled 290 newborns and their hepatitis B surface antigen(HBsAg) positive mothers. HBV cccDNA in PBMC and HBV DNA in serum were detected by a real‐time PCR‐TaqM an probe while HBV serological markers were detected with an electrochemiluminescence immunoassay. Results There was a positive correlation between the levels of PBMC HBV cccD NA and serum HBV DNA and HBeA g(r = 0.436 and 0.403, P 0.001). The detection rate of pattern A [‘HBsA g(+), HBeA g(+), and anti‐HBc(+)'] was significantly higher in the PBMC HBV cccD NA positive group than in the control group(χ2 = 48.48, P 0.001). There was a significant association between HBV intrauterine transmission and PBMC HBV cccD NA(χ2 = 9.28, P = 0.002). In the presence of serum HBV DNA, HBeA g, and PBMC HBV cccD NA, the risk of HBV intrauterine transmission was three times higher(OR = 3.69, 95% CI: 1.30‐10.42) than that observed in their absence. The risk of HBV intrauterine transmission was the greatest(OR = 5.89, 95% CI: 2.35‐14.72) when both PBMC HBV cccD NA and pattern A were present. A Bayesian network model showed that maternal PBMC HBV cccD NA was directly related to HBV intrauterine transmission. Conclusion PBMC HBV cccDNA may be a direct risk factor for HBV intrauterine transmission. Our study suggests that serological markers could be combined with PBMC‐related markers in prenatal testing.     

乙型肝炎病毒与丙型肝炎病毒重叠感染重症化探讨

目的:探讨HBV、HCV重叠感染时,病毒之间的相互关系及对病情转归的影响。方法:用ELISA法检测180例患者乙肝病毒血清学指标(HBV-M)和丙肝病毒抗体(抗-HCV),用PCR和RT-PCR体外扩增法检测HBV-DNA和HCV-RNA。结果:HBV、HCV重叠感染LC和HCC的发生率远远高于单纯HBV或HCV感染,HBV、HCV重叠感染患者中HBV-DNA和HBsAg的阳性率明显低于单纯HBV感染者。结论:HBV重叠感染HCV后,对肝细胞的损害加重,重叠感染患者病情的发展及转归可能主要与HCV有关,是HBV、HCV作用相互叠加的结果。     

乙肝病毒宫内传播与胎盘感染的关系

目的：母亲乙肝病毒（ＨＢＶ）感染在宫内即可造成其胎儿感染，但其机理尚不清楚，作者试图了解胎盘细胞中ＨＢＶ的感染情况，宫内传播的危险因素和母胎传播的可能途径。     

腮腺组织HBsAg、HBcAg和HBVDNA的检测

目的 观察乙型肝炎病毒感染者腮腺组织中HBsAg、HBcAg和HBV DNA的表达情况。方法 对22例血清学HBV标志阳性的腮腺肿瘤患者用免疫组化方法检测腮腺活检组织HBsAg、HBcAg的表达；应用PCR技术对免疫组化阳性病例进一步检测腮腺组织HBV DNA。结果 22例腮腺组织中HBsAg阳性10例。阳性率为45．5％；HBcAg阳性9例，阳性率为40．9％。总阳性率为54．5％(12／22)，其中HBsAg和HBcAg同时阳性7例。占31．8％。阳性信号呈棕褐色细颗粒状，弥漫分布于腮腺腺泡细胞。12例免疫组化阳性患者检出HBV DNA7例，阳性率为58．3％。结论 腮腺组织对HBV有较强的亲和力，唾液中HBV的出现可能源于受染的唾液腺组织，含HBV的唾液是乙型肝炎生活接触性传播的媒介。