ANGPTL4基因及缺失突变体对肝癌细胞生长的影响

目的:探讨ANGPTL4基因及其缺失突变体对肝癌细胞SMMC-7721生长的影响。方法:构建ANGPTL4基因全长及其功能结构域缺失突变体的融合表达载体,即ANGPTL4-GFP-N1、ANGPTL4-del1-GFP-N1、ANGPTL4-del2-GFP-N1、ANGPTL4-del3-GFP-N1,脂质体法将EGFP-N1空载体、ANGPTL4基因及其缺失突变体分别转染肝癌细胞SMMC-7721,G418筛选,建立稳定细胞系,用MTT试验法、细胞集落形成试验检测细胞体外生长活性和增殖能力;流式细胞仪检测ANGPTL4基因对细胞凋亡的影响;裸鼠移植瘤试验检测转染细胞的体内成瘤特性。结果:ANGPTL4基因及其缺失突变体体外对肝癌细胞SMMC-7721的生长、集落形成具有明显的抑制作用(均为P<0.01);ANGPTL4全长基因及其缺失突变体ANGPTL4-del1-GFP-N1和ANGPTL4-del2-GFP-N1均对SMMC-7721细胞体内成瘤有明显抑制作用(均为P<0.01)。但转染ANGPTL4全长基因及其缺失突变体的SMMC-7721细胞的细胞凋亡发生率与转染空载体组相比没有明显差别(均为P>0.05)。结论:ANGPTL4基因及其缺失突变体对肝癌SMMC-7721细胞体内、外生长均具有明显抑制作用,但该抑制作用不是通过促进细胞凋亡实现的。     

ANGPTL4 基因对不同肝癌细胞株生长的影响

目的:观察血管生成素样蛋白4(angiopoietin-like 4, ANGPTL4 )基因对不同肝癌细胞株生长的影响. 方法:用RT-PCR和Western印迹法检测9种不同肝癌细胞及永生化肝细胞中ANGPTL4的表达水平;选择ANGPTL4低表达的Huh-7、MHCC-LM3 和中度表达的MHCC-97L共3个肝癌细胞株,以pEGFP-N1质粒为载体,用Lipofectamine 2000脂质体转染 ANGPTL4 基因,用G418筛选结合FCM法对转染阳性细胞进行筛选,建立过表达ANGPTL4的稳定细胞株.制备细胞芯片,用 Ki-67 荧光免疫细胞化学技术检测3个稳定细胞株的体外增殖率,用裸小鼠体内成瘤实验观察ANGPTL4对这3个细胞株在裸小鼠体内生长的影响.结果:ANGPTL4 mRNA在未转染肝癌细胞Huh-7和MHCC-LM3中低表达,在MHCC-97L细胞中中度表达,在Hep3B细胞中高表达.细胞芯片检测结果表明,与空载体组相比,稳定过表达ANGPTL4的Huh-7细胞体外增殖率较低( P=0.000 74),而稳定过表达ANGPTL4的MHCC-LM3( P =0.073 08)和MHCC-97L( P=0.011 52)细胞株的体外增殖率则较高.体内实验证实,ANGPTL4可以明显抑制Huh-7细胞的裸鼠体内成瘤( P ＝0.001 10),而促进MHCC-LM3细胞( P＝0.057 50) 和MHCC-97L细胞( P＝0.018 91)的裸鼠体内成瘤.结论:ANGPTL 4对不同肝癌细胞株的生长有不同影响,而对同一种细胞株体内和体外生长的影响基本一致.     

ANGPTIA基因对不同肝癌细胞株生长的影响

目的：观察血管生成素样蛋白4（angiopoietin-like4，ANGPTL4）基因对不同肝癌细胞株生长的影响。方法：用RT—PCR和Western印迹法检测9种不同肝癌细胞及永生化肝细胞中ANGPTL4的表达水平；选择ANGPTL4低表达的Huh-7、MHCC—LM3和中度表达的MHCC-97L共3个肝癌细胞株，以pEGFP-N1质粒为载体，用Lipofectamine2000脂质体转染ANGPTL4基因，用G418筛选结合FCM法对转染阳性细胞进行筛选，建立过表达ANGPTL4的稳定细胞株。制备细胞芯片，用Ki-67荧光免疫细胞化学技术检测3个稳定细胞株的体外增殖率，用裸小鼠体内成瘤实验观察ANGPTL4对这3个细胞株在裸小鼠体内生长的影响。结果：ANGPTL4mRNA在未转染肝癌细胞Huh-7和MHCC-LM3中低表达，在MHCC-97L细胞中中度表达，在Hep3B细胞中高表达。细胞芯片检测结果表明，与空载体组相比，稳定过表达ANGFFL4的Huh-7细胞体外增殖率较低（P=0．00074），而稳定过表达ANGPTL4的MHCC—LM3（P=0．07308）和MHCC-97L（P=0．01152）细胞株的体外增殖率则较高。体内实验证实，ANGPTL4可以明显抑制Huh-7细胞的裸鼠体内成瘤（P=0．00110），而促进MHCC-LM3细胞（P=0．05750）和MHCC-97L细胞（P=0．01891）的裸鼠体内成瘤。结论：ANGPTL4对不同肝癌细胞株的生长有不同影响，而对同一种细胞株体内和体外生长的影响基本一致。     

高迁移率族蛋白1对人鼻咽癌细胞株C666-1体外迁移及侵袭能力的影响

目的 观察高迁移率族蛋白1（HMGB1）对人鼻咽癌细胞株C666-1体外迁移及侵袭能力的影响,并初步探讨其可能的机制。 方法 用siRNA干扰C666-1细胞株HMGB1基因表达,通过划痕试验及Transwell检测siHMGB1对C666-1细胞株迁移及侵袭能力的影响,通过Western blot检测HMGB1干扰后侵袭相关蛋白基质金属蛋白酶2/9（MMP2/9）的表达变化。结果 相比对照组,干扰C666-1细胞株HMGB1基因的表达后,C666-1细胞迁移能力明显下降（P<0.001）, 侵袭能力明显减弱（P<0.001）,细胞侵袭相关蛋白MMP2表达水平明显下降（P<0.001）,而MMP9表达未见明显变化。结论 HMGB1促进人鼻咽癌细胞株C666-1体外迁移及侵袭,且其对C666-1侵袭能力的影响可能通过MMP2介导。     

高通量肿瘤血管新生研究技术平台的建立

目的：建立高通量肿瘤血管新生研究的体内外技术平台。方法：以VEGF,hFGF为血管新生因子,以Thalidomide血管新生抑制因子对体外培养的血管内皮细胞系（RF／6A,SVEC）应用MTT试验,迁移试验,浸润试验和管状形成试验检测内皮细胞的各种特性;体内实验以鸡胚C57BL／6小鼠为实验动物检测血管新生因子和抑制因子在体内对血管新生的影响。结果：VEGF和bFGF在体内和体外均有促进血管新生的作用,体外试验表明VEGF和bFGF对内皮细胞的增殖活性,迁移、浸润和管状结构形成均有明显的促进作用（P＜0．01）;小鼠体内栓子试验和鸡胚绒毛尿囊膜试验结果均表明,VEGF和b FGF对体内血管新生同样具有促进或刺激作用,和阴性对照组相比主要表现在新生血管密度高、管腔大、管壁完整等;而Thalidomide在体内外均有明显抑制血管新生的作用。结论：本技术平台是一个高通量、经济、简便易行、实用的血管新生研究技术平台。     

Sema6D对人骨肉瘤细胞增殖、迁移、侵袭及血管形成能力的影响及机制

目的 探讨沉默信号素蛋白6D(Sema6D)对人骨肉瘤细胞增殖、迁移、侵袭及促进血管形成能力的影响.方法 检测人骨肉瘤组织及细胞系中Sema6D的表达情况,脂质体法转染靶向siRNA后通过CCK-8、细胞划痕、Transwell、人脐静脉内皮细胞与肿瘤条件培养基共培养实验探究骨肉瘤细胞增殖、迁移、侵袭和体外促血管形成能...     

siRNA 抑制Sema4C 基因表达对人乳腺癌细胞恶性行为的影响*

目的:研究小干扰RNA（small interf ering RNA,siRNA ）抑制轴突导向蛋白分子（Semaphorin 4C,Sema4C）基因的表达对人乳腺癌细胞MDA-MB-231 体外迁移、侵袭及增殖的影响,并初步探讨其作用机制。方法:根据Sema4C 基因设计序列特异性的siRNA（Sema4C-siRNA ）,在脂质体介导下转染MDA-MB-231 细胞,Western blot方法检测基因封闭效应,利用细胞划痕实验、Tran ?swell小室侵袭实验及CFSE流式细胞仪方法检测细胞转染前后迁移、侵袭及增殖能力的变化,Western blot检测磷酸化AKT（p-AKT ）在转染前后细胞中表达的变化。结果:转染Sema4C-siRNA 72小时后,乳腺癌MDA-MB-231 细胞株（MDA-MB-231/Si）Sema4C 蛋白表达明显下降,与未转染细胞MDA-MB-231 相比,MDA-MB-231/Si细胞体外迁移能力减弱,侵袭及增殖能力明显下降;p-AKT 表达水平在MDA-MB-231/Si细胞中明显降低。结论:Sema4C-SiRNA 转染人乳腺癌MDA-MB-231 细胞可下调细胞中Sema4C 蛋白表达水平,Sema4C-SiRNA 对MDA-MB-231 细胞的体外迁移、侵袭和增殖有抑制作用,这可能与p-AKT 的下调有关。      

重组人血管内皮抑制素对鼻咽癌HNE-1细胞株体外血管生成拟态的抑制作用

目的：研究重组人血管内皮抑制素（rh-Endostatin，Endostar，恩度）对人鼻咽低分化鳞癌HNE-1细胞的增殖、迁移及体外血管生成拟态的影响。方法：用不同浓度恩度（0～50μg／m1）处理HNE-1细胞，MTT法检测HNE-1细胞增殖活性的变化；创伤修复实验检测细胞迁移能力的变化。在Matrigel上接种HNE-1细胞，观察HNE-1细胞能否形成血管网状结构及其特点；体外管状形成抑制试验检测恩度对HNE-1细胞管道形成能力的影响。结果：恩度（1-50μg／m1）组的OD值与对照组比较无明显统计学差异（P〉0．05），但可以显著降低HNE-1细胞的迁移速度（P〈0．01），且与浓度呈负相关（r=-0．983，P〈0．01）。HNE-1细胞在Matrigel上培养能形成血管网状样结构，并能与内皮细胞连接共同构成马赛克样血管网状结构；恩度能抑制HNE。1细胞体外管道形成（P〈0．01），其管状结构数量与恩度浓度呈负相关（r=-0．978，P〈0．01）。结论：HNE-1细胞具有血管生成拟态及与内皮细胞共同形成马赛克血管的能力，恩度能够抑制HNE-1细胞的迁移和体外血管生成拟态形成。     

人源电压门控质子通道对乳腺癌细胞迁移与侵袭的影响

  目的  明确人源电压门控质子通道蛋白（human voltage-gated proton channel 1,Hv1）对乳腺癌细胞迁移及侵袭能力的影响。   方法  检测Hv1在不同转移能力的人乳腺癌细胞系中的表达,利用小RNA干扰（siRNA）技术下调Hv1在乳腺癌MDA-MB-231细胞中的表达,通过细胞划痕和体外侵袭实验方法,观察Hv1对乳腺癌细胞迁移和侵袭的影响并初步探讨相关分子机制。   结果  Hv1在高转移的乳腺癌细胞MDA-MB-231中表达较高,Hv1基因的siRNA干扰片段能够抑制Hv1基因及蛋白的表达;细胞划痕和体外侵袭实验表明Hv1降表达的MDA-MB-231细胞迁移和侵袭能力较弱;明胶酶谱和免疫印迹实验证明下调Hv1基因在MDA-MB-231细胞中的表达明显抑制了MMP-2的活性。   结论  Hv1能够促进乳腺癌细胞迁移及侵袭。      

Src激酶抑制剂PP2对人胃癌细胞生物学行为的影响

目的:探讨Src激酶抑制剂PP2对人胃癌SGC-7901细胞生长、迁移、侵袭和诱导血管形成等生物学行为的影响.方法:通过Western印迹法检测PP2作用对SGC-7901细胞中Src激酶活化的影响;分别采用MTT法、划痕实验、Transwell小室法和体外诱导血管形成分析实验观察PP2对SGC-7901细胞生长、迁移、基质侵袭和诱导血管形成等生物学行为的影响.结果:MTT法检测结果提示,15 μmol/L PP2作用人胃癌SGC-7901细胞12 h时能明显抑制细胞的增殖;5和10 μmol/L PP2均能抑制SGC-7901细胞的迁移、侵袭和诱导血管的形成,且其抑制能力随PP2浓度的增加而逐渐增强.结论:Src激酶抑制剂PP2具有抑制人胃癌SGC-7901细胞生长、迁移、侵袭和诱导血管形成的能力,可能对胃癌具有一定的治疗效果.     

雷公藤红素抑制血管生成的实验研究

目的：探讨雷公藤红素对血管生成的抑制作用。方法：采用MTT法测定雷公藤红素对血管内皮细胞株(ECV)增殖的影响,观察雷公藤红素对ECV迁移实验和小管形成实验的作用,以及对鸡胚尿囊膜血管生成的影响。体内实验采用Matrigel plug方法。结果：雷公藤红素可明显抑制ECV的体外增殖,IC50为1．33μg／ml;可抑制ECV的迁移和小管形成,并且呈明显的剂量依赖性;同时具有抑制鸡胚尿囊膜血管生成和Matrigel plug中的血管新生的作用。结论：雷公藤红素具有明显抑制血管生成的作用,有可能成为有效的血管生成抑制剂。     

IL-17在NSCLC淋巴管形成和侵袭中的作用

目的 探讨白细胞介素-17(IL-17)在非小细胞肺癌(NSCLC)淋巴管形成和侵袭中的作用.方法 收集手术切除的NSCLC组织标本40例,采用免疫组织化学法检测NSCLC组织中IL-17表达情况及淋巴管密度;采用MTT实验检测IL-17对淋巴管内皮细胞(LEC)增殖的影响;采用Transwell实验和淋巴管形成实验检测IL-17对LEC细胞迁移和管样结构形成的影响.结果 IL-17蛋白阳性表达患者的淋巴管密度高于IL-17蛋白阴性表达患者(P﹤0.05);0、0.5、1.0、5.0和10.0 ng/ml IL-17对LEC增殖活力的影响比较,差异无统计学意义(P﹥0.05);对照组和IL-17组透膜细胞数比较,差异无统计学意义(P﹥0.05);LLC组透膜细胞数为(58.70±12.52)个,高于对照组和IL-17组(P﹤0.05);LLC+IL-17组透膜细胞数最高,为(98.82±20.16)个,高于对照组、IL-17组和LLC组(P﹤0.05);对照组和IL-17组管样结构分支数比较,差异无统计学意义(P﹥0.05);LLC组管样结构分支数高于对照组和IL-17组(P﹤0.05);LLC+IL-17组管样结构分支数最高,为(155.82±29.92)个,高于对照组、IL-17组和LLC组(P﹤0.05).结论 IL-17对LEC的增殖、迁移和管样结构形成无直接的促进作用,但可通过对NSCLC细胞的作用间接促进LEC的侵袭和转移.     

siRNA沉默结肠癌转移相关基因1表达对人类卵巢癌细胞株侵袭转移的影响

目的 检测结肠癌转移相关基因1（MACC1）在卵巢癌细胞株中的表达,并探讨用siRNA技术抑制其表达对卵巢癌细胞生物学行为的影响.方法 应用实时荧光定量PCR （RT-qPCR）及Western blot法检测OVCAR3、ES-2、SKOV3、HO-8910卵巢癌细胞株中MACC1的表达,合成MACC1特异性siRNA并转染OVCAR3细胞,利用RT-qPCR筛选并鉴定MACC 1基因有效沉默后,应用体外黏附实验、Transwell迁移及侵袭实验、体外血管拟态实验检测MACC1基因沉默后OVCAR3细胞的体外黏附、迁移、侵袭及血管生成能力的变化.结果 OVCAR3细胞较其他卵巢癌细胞株高表达MACC1.MACC1基因沉默后,OVCAR3细胞的体外黏附能力受到不同程度的抑制;Transwell迁移实验中,MACC1 siRNA干扰的OVCAR3细胞（干扰组）转入底层膜的细胞数为（245.5±12.8）个,低于阴性对照组和空白对照组[分别为（500.3±16.5）、（496.3±13.1）个,均P＜0.05]; Transwell侵袭实验中,干扰组转入底层膜的细胞数为（185.3±14.1）个,低于阴性对照组和空白对照组[分别为（405.7±9.1）、（416.3±11.5）个,均P＜0.05];体外血管拟态显示干扰组细胞多呈散在分布,连接减少,形成的完整结构少.结论 利用siRNA技术抑制MACC1基因表达可有效抑制卵巢癌OVCAR3细胞的体外转移和侵袭能力,MACC1有望成为卵巢癌治疗的靶基因.     

重离子辐照对人舌鳞癌CAL27细胞的生物学效应及其分子机制

目的 研究重离子12C6+离子辐照对人舌鳞癌CAL27细胞的生物学效应以及分子机制。方法 应用不同剂量重离子束（12C6+）对体外培养的人舌癌CAL27细胞进行辐照,采用MTT、Transwell、流式细胞术、划痕实验、克隆实验观察重离子束（12C6+）对CAL27细胞迁移和侵袭、凋亡和周期的影响,Western blot法观察重离子束（12C6+）对CAL27细胞增殖的影响。结果 （1）重离子辐照对CAL27细胞的增殖抑制作用与剂量-时间成正相关;（2）和空白对照组比较,在相同时间点,不同剂量的重离子束（12C6+）对细胞中P53、P65和VEGF的表达影响明显,随着重离子束（12C6+）辐照剂量增大,细胞中P53、P65和VEGF的表达明显降低（P<0.05）。结论 重离子辐照能抑制CAL27细胞的增殖,且具有剂量和时间效应。     

降脂药对肝癌细胞增殖、侵袭及中性粒细胞外诱捕网形成的影响

目的 探讨降脂药对肝癌细胞增殖、干性特征、迁移、侵袭和中性粒细胞外诱捕网（NETs）形成的作用。方法 下调ASPP2或HMGCR基因建立胆固醇合成增加或减弱的小鼠肝癌细胞Hepa1-6，分别用辛伐他汀和黄连素两种降脂药处理。CCK-8和平板克隆实验检测肝癌细胞增殖能力；低吸附板成球和qRT-PCR分析细胞干性特征和相关基因表达；划痕和Transwell实验分析细胞迁移、侵袭的能力。免疫荧光染色分析NETs形成。结果 降脂药可显著抑制Hepa1-6细胞贴壁和成球生长及干性基因表达（P<0.001）；显著抑制Hepa1-6细胞迁移和侵袭能力（P<0.001）；显著抑制中性粒细胞诱导的Hepa1-6细胞侵袭和NETs的生成（P<0.001）。结论 降脂药通过抑制肝癌细胞的干性特征和NETs形成，抑制肝癌细胞增殖和转移，是治疗肝癌转移的一种潜在方式。     

SPAG6促进卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭

目的:探讨抑制精子相关抗原6（sperm-associated antigen 6,SPAG6）对卵巢癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响。方法:体外培养正常卵巢上皮细胞（NOE-71）和卵巢癌细胞（SKOV-3、OVCAR-3）,采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）实验检测细胞中SPAG6基因的表达。将4种潜在抑制SPAG6基因表达的“SPAG6-shRNA”质粒分别转染到SKOV-3细胞,RT-qPCR和Western blot实验筛选有效抑制SPAG6基因表达的细胞株;采用细胞计数法和平板克隆实验检测抑制SPAG6基因表达对卵巢癌细胞增殖的影响;运用细胞划痕实验和Transwell实验检测抑制SPAG6基因表达对细胞迁移和侵袭能力的影响;流式细胞实验检测抑制SPAG6基因表达对细胞周期的影响;免疫荧光实验和Western blot检测在SKOV-3细胞中抑制SPAG6表达对p27kip1分布的影响。结果:SPAG6基因在卵巢癌细胞SKOV-3和OVCAR-3中的表达均显著高于正常卵巢上皮细胞NOE-71,且在SKOV-3细胞中表达最强。RT-qPCR和Western blot实验显示2种“SPAG6-shRNA”质粒能够有效抑制SKOV-3细胞中SPAG6基因的表达;与对照组细胞相比,抑制SPAG6基因表达能够降低SKOV-3细胞的增殖,差异有统计学意义（P＜0.01）;平板克隆实验显示抑制SPAG6基因表达能降低SKOV-3细胞的克隆形成率,差异有统计学意义（P＜0.01）;细胞划痕实验和Transwell实验显示抑制SPAG6基因表达能够降低卵巢癌细胞的迁移和侵袭能力（P＜0.01）;流式细胞实验显示抑制SPAG6基因表达能使细胞G0/G1期显著上调,S期显著下调(P＜0.01)。SKOV-3细胞中抑制SPAG6表达可降低细胞质中p27kip1的水平而增加细胞核中p27kip1的水平。结论:SPAG6促进卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭。     

ECRG2基因对人类纤维肉瘤HT1080细胞侵袭迁移能力的影响

目的探讨ECRG2基因在人类纤维肉瘤侵袭和转移过程中的作用。方法应用RNA干扰技术抑制内源性ECRG2基因在人类纤维肉瘤HT1080细胞中的表达,建立ECRG2基因在该细胞中的可诱导表达系统,Westernblotting方法观察细胞ECRG2蛋白表达水平的变化,细胞划痕实验和Transwell侵袭实验观察HT1080细胞迁移、侵袭能力的变化。结果Westernblotting检测筛选得到敲除内源性ECRG2基因的最佳Tet—On可诱导表达克隆。细胞划痕实验和Transwell侵袭实验发现,敲除内源性ECRG2基因明显促进HT1080细胞的侵袭迁移能力,而表达外源ECRG2基因的HT1080细胞侵袭、迁移能力显著下降。结论ECRG2基因与人类纤维肉瘤的侵袭转移潜能相关,外源ECRG2基因的表达可明显抑制人类纤维肉瘤HT1080细胞的侵袭、迁移能力。