应用5-氮胞苷体外诱导P19细胞分化为心肌细胞

目的 探讨P19细胞体外经5-氮胞苷(5-aza)诱导向心肌细胞分化的特征.方法 将P19细胞接种于铺有琼脂的培养皿中,用含不同浓度5-aza的培养基诱导培养7d,细胞悬浮生长形成类胚体(EBs).将EBs用生长培养基黏附培养,观察细胞收缩情况;免疫细胞荧光检测α一横纹肌肌动蛋白(asarcomeric actin)、心肌肌钙蛋白(cTnT)的表达;RT-PCR检测GATA-4、a-MHC基因表达,鉴定细胞分化.结果 将5-aza诱导形成的:EBs黏附培养后,在EBs周围的生长晕中出现自发性节律收缩的细胞团片,α-sarcomeric:actin及cTnT染色阳性,表达GATA-4、αMHC基因.10μmol/L5-aza处理组心肌细胞分化率较高.结论 5-aza暴露结合悬浮培养可诱导P19细胞向心肌细胞分化,其分化与5-aza浓度有关.     

催产素诱导P19细胞分化为心肌细胞的作用

目的研究催产素(OT)在体外诱导P19细胞分化为心肌细胞中的作用。方法将P19细胞用含OT的诱导培养基悬浮培养4d,取其形成的拟胚体(EBs)用不含OT的生长培养基贴壁培养10~12d。用免疫细胞化学、透射电镜等方法对分化的细胞进行鉴定。结果EBs周边生长晕中部分细胞变形、伸长,呈放射状排列。免疫细胞化学染色显示,变形分化的细胞表达α-横纹肌肌动蛋白(α-SCA)和心肌肌钙蛋白T(cTnT),并以OT终浓度1×10-7mol/L的实验组阳性率最高(P<0.01)。透射电镜观察分化细胞具有心肌细胞发育早期的超微结构特征。结论在体外OT能够诱导P19细胞分化为早期的心肌细胞。     

P19细胞心肌体外分化诱导条件的优化

目的分别观察P19细胞心肌分化诱导中的几种影响因素,优化P19细胞心肌分化的诱导条件。方法使用悬滴法或96孔板悬浮培养法制备细胞聚集体(aggregates),二甲基亚砜(DMSO)为诱导剂诱导P19细胞的心肌分化。普通光学显微镜下观察跳动的心肌细胞的产生来确定诱导是否成功,免疫荧光染色确认心肌特异性蛋白Tro-ponin T的表达,RT-PCR方法检测分化诱导后心肌细胞标志基因的表达情况。结果使用96孔板悬浮培养法诱导细胞形成聚集体后转入贴壁培养阶段时细胞聚集体贴壁状态优于传统的悬滴法。DMSO的加入可以提高细胞形成聚集体后贴壁时细胞聚集体的完整性。1×107~2×108L-1的接种浓度下心肌细胞分化诱导效率较高。在可观察到跳动的心肌细胞之前即可检测到Troponin T的表达。结论通过对细胞形成聚集体的诱导方法、诱导剂、接种浓度等因素的优化可以提高P19细胞的心肌分化效率,为开发高效心肌分化诱导法提供了条件。     

P19细胞向神经元诱导分化的实验研究

目的 探讨P19细胞向神经元定向分化发育的可能性。方法 经维甲酸(RA)诱导4d的．P19细胞按神经细胞培养方法培养12d，分别用NSE、MAP-2和TH进行免疫组织化学染色，用AchE进行组织化学染色，鉴定分化细胞的特征。结果 经RA诱导的P19细胞培养12d，大多数细胞转变为类似于神经元的形态，长出突起并相互联络成网。经NSE免疫组织化学显示，12d培养物中神经元约占89％。P19诱导的神经元培养12d，神经元突起经MAP-2染色呈阳性反应。TH免疫组织化学显示，神经元中TH染色阳性神经元约占0.8％。组织化学显示．神经元中AchE染色阳性神经元约占71．09％。结论 P19细胞在体外经定向诱导分化可以产生较高比例的神经元。     

pEGFP-N2-BMP2转染诱导P19细胞分化为心肌样细胞

目的 探讨真核表达质粒pEGFP-N2-BMP2转染P19细胞后能否诱导其分化为心肌样细胞.方法 实验分转染组和对照组,转染组以真核表达质粒pEGFP-N2-BMP2转染P19细胞并使骨形态发生蛋白2(BMP2)基因稳定表达,然后结合细胞聚集培养,对照组为培养的P19细胞.两组细胞聚集培养4d,形成聚集体后贴壁培养,于贴壁培养的4d、8d、12d、16d,免疫细胞化学和Western blotting方法检测心肌标志物心肌肌钙蛋白T (cTnT)和心肌肌动蛋白α;半定量RT-PCR检测心脏早期转录因子GATA-4和NKx2.5基因的表达.结果 转染组心肌肌钙蛋白T和心肌肌动蛋白α两种蛋白形成聚集体贴壁4d时无表达,8d、12d、16d出现表达,其表达随时间延长逐渐增强.取材各时间点之间有显著差异(P＜0.01).在转染诱导后4d时GATA-4、NKx2.5两个基因即出现弱的表达,随着时间延长,8d、12d、16d两个基因的表达逐渐增强.取材各时间点之间有显著差异(P＜0.01).对照组未发现心肌肌钙蛋白T和心肌肌动蛋白α两种蛋白的表达,亦未发现GATA-4、NKx2.5两个基因的表达.结论稳定表达BMP2基因的P19细胞可以分化为心肌样细胞,BMP2可能通过调控转录因子GATA-4、NKx2.5进而影响心肌肌钙蛋白T和心肌肌动蛋白α的表达.     

二甲基亚砜体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞

目的 探索二甲基亚砜（DMSO）体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）向心肌样细胞分化的方法。方法 取SD大鼠四肢骨骨髓,分离培养MSCs,应用终浓度为1.0%的DMSO定向诱导,相差显微镜观察细胞形态学变化,应用免疫细胞化学、激光扫描共聚焦显微镜技术检测结蛋白（desmin）,α-横纹肌肌动蛋白（α-sarcomeric actin）、心肌特异性肌钙蛋白（C-TnT）的表达,透射电镜观察超微结构。结果 MSCs经体外诱导后分化的细胞均阳性表达desmin、α-sarcomeric actin、C-TnT。透射电镜下可见到平行排列的肌丝和丰富的粗面内质网。结论 大鼠骨髓间充质干细胞体外在DMSO诱导下可以定向分化为心肌样细胞。     

P19细胞体外向脂肪细胞诱导分化的实验

目的 探讨应用96孔板悬浮法诱导P19细胞体外向脂肪细胞分化的可行性和有效性。方法 P19细胞使用96孔板悬浮培养法制备拟胚体（EBs）,其中第3天至第5天使用诱导剂全反式维甲酸（RA）。第7天挑取EBs用胰岛素和三碘甲状腺原氨酸诱导,继续贴壁培养20d后,油红O染色鉴定分化细胞的特征。
结果 使用96孔板悬浮培养法可以形成大小均一的EBs,诱导结束后EBs生长晕周围部分细胞分化为脂肪细胞。细胞形态趋于类圆或圆形,胞质中出现小脂滴,可被油红O染色清晰显示。 结论 使用96孔板悬浮法获得的P19细胞EBs在体外可诱导分化为脂肪细胞。     

过表达miR-32削弱多氯联苯抑制P19细胞向心肌细胞的分化

BACKGROUND:Polychlorinated biphenyls inhibit the differentiation of P19 cells into cardiomyocytes. In the meanwhile, microRNAs play an important role in regulating cell differentiation. OBJECTIVE:To explore the effect of microRNA-32(miR-32) on the polychlorinated biphenyls-inhibited differentiation of P19 cells into cardiomyocytes. METHODS:P19 cells were co-cultured with 2.5 μmol/L polychlorinated biphenyls and 1% dimethyl sulfoxide. Afterwards, α-actinin, desmin, cTnI and GATA4 were identified by western blot assay. Wddwxrof polychlorinated biphenyls on the expression of miR-32 was evaluated by real-time PCR. Mouse eukaryotic vector expressing miR-32 was constructed by gene recombination technology, and transfected into P19 cells followed by co-cultured with 2.5 μmol/L polychlorinated biphenyls and 1% dimethyl sulfoxide. Then, expressions of differentiation-related proteins were detected by western blot assay. RESULTS AND CONCLUSION:Polychlorinated biphenyls inhibited the differentiation of P19 cells into cardio myocytes and decreased the miR-32 expression. Cell lines overexpressing miR-32 was successfully established in mice. Furthermore, we found that overexpression of miR-32 weakens the inhibition of polychlorinated biphenyls to the differentiation of P19 cells into cardiomyocytes.     

干细胞向心肌细胞诱导分化的研究进展

各种原因引起的心肌梗死是临床上重要的死亡原因 ,利用细胞移植可以增加有功能的心肌细胞数量和质量 ,但是供体细胞来源受限。干细胞是一类具有无限增殖和多向分化潜能的细胞 ,进行合适的诱导可使它向心肌细胞方向分化 ,为临床心肌缺血梗死进行细胞移植治疗提供新的供体细胞     

二甲基亚砜诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞的分化

BACKGROUND: Numerous studies have demonstrated that bone marrow mesenchymal stem cells can be induced to differentiate into myocardial cells under certain conditions. Dimethyl sulfoxide is one of the commonly used inducers, and its mechanism is mainly by inhibiting the c-myc gene expression, thus reducing endogenous poly(adenosine diphosphate nucleotide) level.      

中枢神经系统不同部位来源的神经干细胞在体外生长特性的比较

目的 比较相同发育阶段中枢神经系统不同部位来源的神经干细胞在体外的生长特性。方法 胚胎小鼠(E14)于无菌条件下分别分离并收集皮层、纹状体、间脑、中．后脑和脊髓,各部分制备成单细胞悬液,接种在添加有纤维细胞生长因子(FGF)的无血清培养液内,神经干细胞克隆生成后,经免疫细胞化学方法鉴定细胞特性,并在相同条件下进行传代,相差显微镜下观察克隆生成和细胞的迁移特性。结果 在添加有纤维细胞生长因子的无血清培养液中,少量接种的单个细胞会增殖并形成悬浮于细胞培养液中的细胞克隆。这些克隆具有生成新克隆并分化成神经元和胶质细胞的能力。在相同发育阶段,皮层、纹状体、间脑均可生成悬浮的克隆,其中皮层生成的速度最快,纹状体、间脑较慢,中．后脑、脊髓生成克隆的速度最慢;生成克隆后,皮层克隆的贴壁能力最差,贴壁的克隆少有细胞从其底部迁出,纹状体、间脑克隆较易贴壁,贴壁克隆底部有明显的细胞迁出,中．后脑、脊髓生成的克隆不易悬浮,很快贴壁,在贴壁克隆的底部有大量的细胞迁出。结论 在无血清培养液中,神经干细胞可在体外增殖、传代并分化生成神经元和胶质细胞,不同部位来源的神经干细胞在体外生成克隆的速度和细胞迁移性不同,这可能同体内特定部位细胞的发育特性有关。     

大鼠脑的神经干细胞的体外培养、增殖和分化

采用无血清培养基分离和培养大鼠脑的神经干细胞,并通过免疫荧光细胞化学技术进行细胞自我更新能力、巢蛋白表达和多向分化潜能的鉴定。鉴定结果表明,所分离培养的细胞为大鼠神经干细胞,具有神经干细胞的特征,并可在体外大量增殖和较长期培养,可经诱导分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞,是进行诱导分化的良好细胞模型。本文讨论了神经干细胞传代培养中应予以注意的问题和对策。     

成年大鼠及猴骨髓基质细胞的体外培养及向神经元的分化诱导

为了探讨成年动物骨髓基质细胞的体外培养和神经元诱导及其不同培养时程对外源基因的转染率,本实验采用直接和间接两种方法分离、培养成年大鼠和猴的骨髓基质细胞。在体外进行神经元诱导,用免疫细胞化学方法进行鉴定;用携带酪氨酸羟化酶基因的逆转录病毒载体转染体外培养第1～10代大鼠骨髓基质细胞,经免疫细胞化学鉴定并计算转染率。结果显示,成年大鼠和猴骨髓基质细胞以未分化状态至少可持续培养20余代,部分细胞表达干细胞的标志蛋白nestin,经BrdU孵育后呈BrdU抗体免疫阳性;经诱导后细胞具有典型的神经元形态,表达神经元的特异性蛋白NeuN;培养第3代至6代的骨髓基质细胞对外源性基因的转染效率较其他时程明显增高。实验结果说明,骨髓基质细胞可以在体外培养并被诱导成为神经元,它还可携带外源性治疗基因。     

人胚胎大脑皮层神经干细胞的分离培养

目的　为人神经干细胞的基础研究及临床应用提供细胞模型。　方法　采用无血清培养技术 ,分离培养了 10～ 14周人胚大脑皮层细胞 ,并用神经上皮干细胞蛋白 (Nestin)免疫组化鉴定培养细胞 ;5 %胎牛血清诱导其分化 ,神经丝 2 0 0 (NF 2 0 0 )和胶质纤维酸性蛋白 (GFAP)免疫组化鉴定分化细胞。　结果　获得了大量未分化、呈簇状悬浮生长的神经干细胞团 ,且能被诱导分化成神经元和神经胶质细胞。经传 12代后仍具干细胞特性。　结论　本实验成功地分离培养了人胚胎大脑皮层神经干细胞 ,为神经干细胞的基础研究和临床应用奠定了基础。     

新生大鼠海马源性神经干细胞的分离培养及其向胆碱能神经元定向诱导分化研究

本研究目的是从新生SD大鼠海马分离、培养神经干细胞并诱导其向胆碱能神经元方向分化。利用含b FGF(20ng/ml)和B27的无血清DMEM/F12培养基培养新生SD大鼠海马分离的具有自我更新和多向分化能力的细胞群,用免疫细胞化学技术检测巢蛋白(nestin),并于分化后分别检查特异性成熟神经细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞的标记抗原β微管蛋白(Tuj1 )、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和半乳糖脑苷脂(Galc)的表达;用鸡胚骨骼肌提取液,诱导神经干细胞向胆碱能神经元方向分化。结果显示:从海马分离的细胞群具有自我更新能力,表达nestin,分化成熟后的细胞表达神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原;与对照组3. 9%相比,鸡胚骨骼肌提取液可以诱导这些细胞中的9. 6%分化成为胆碱能神经元。提示分离的细胞具有自我更新能力和多向分化潜能,是中枢神经系统的干细胞;在加有鸡胚骨骼肌提取液的培养基诱导下,能向胆碱能神经元方向分化。     

胚胎大鼠颅盖骨分离细胞早期体外培养的组织化学观察

本实验采用胚胎后期Sprague-Dawley大鼠颅盖骨(连同骨膜)分离细胞进行体外培养。并以活体相差、HE染色及组织化学染色等技术进行早期观察。发现骨外膜再生层骨生成细胞和骨髓区未分化间充质细胞在体外培养条件下,都可发育成为细胞体积很大的鳞片形细胞,具有许多突起,并以突起与相邻细胞连接。鳞片形细胞的胞浆Sirius red染色呈淡红色,偏光显微镜下无双折射,表明细胞已开始形成胶原的前体。细胞碱性磷酸酶反应呈阴性,表明细胞仍然处于骨生成细胞阶段。