放射及化学治疗对RB细胞系HXO-Rb44细胞的影响

作者用人视网膜母细胞瘤细胞系HXO-Rb₄₄进行顺铂（DDP）、阿霉素（ADM）和长春新碱（VCR）分别联合放射线对该细胞系杀伤效应的研究。结果提示，这三种药物在低剂量时，都可增强放射线对RB细胞的杀伤作用：高剂量时，则主要表现为两种方法的协同作用。DDP、ADM两种药物，在放射线照射前后运用无明显差别；VCR于照射前运用，效果明显优于照射后运用。DDP和ADM是通过抑制细胞的潜在致死损伤和亚致死损伤的修复，增加放疗效果，VCR只抑制细胞的潜在致死损伤的修复，起放射增敏作用。 （中华眼底病杂志，1995，11：15-18）     

lncRNA HIF1A-AS1对长春新碱耐药视网膜母细胞瘤细胞化疗敏感性的影响

目的：探讨长链非编码RNA-HIF1A-AS1(lncRNA HIF1A-AS1)调节缺氧诱导因子-1α(HIF-1α))表达对长春新碱(VCR)耐药视网膜母细胞瘤(RB)细胞化疗敏感性的影响。

方法：建立人RB VCR耐药细胞株SO-RB50/VCR，实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测SO-RB50与SO-RB50/VCR细胞lncRNA HIF1A-AS1表达； 在SO-RB50/VCR细胞中抑制lncRNA HIF1A-AS1表达或同时过表达HIF-1α，检测SO-RB50/VCR细胞对VCR的半数抑制浓度(IC₅₀)及细胞增殖、凋亡情况； Western blot检测HIF-1α、多药耐药相关蛋白(MRP)、P-糖蛋白(P-gp)蛋白表达。

结果：与SO-RB50细胞相比，SO-RB50/VCR细胞中lncRNA HIF1A-AS1与HIF-1α蛋白表达水平升高(P<0.05)； 在SO-RB50/VCR细胞中抑制lncRNA HIF1A-AS1表达后，细胞凋亡率显著升高(P<0.05)，细胞吸光度(OD₄₅₀)值显著降低，VCR对细胞的IC₅₀值及HIF-1α、MRP、P-gp蛋白表达水平显著降低(P<0.05)； 过表达HIF-1α可减弱下调lncRNA HIF1A-AS1表达对SO-RB50/VCR细胞耐药性的抑制作用。

结论：lncRNA HIF1A-AS1在SO-RB50/VCR细胞中高表达，抑制lncRNA HIF1A-AS1表达可通过下调HIF-1α表达，降低SO-RB50/VCR细胞对VCR的耐药性。     

抗视网膜母细胞瘤细胞株SO-Rb50单克隆抗体相应抗原的提取

目的 从SO-Rb₅₀细胞中提取出抗视网膜母细胞瘤单克隆抗体相应的抗原。 方法 用离子交换层析法从SO-Rb₅₀细胞中初步分离抗原，并利用抗视网膜母细胞瘤单克隆抗体以dot blotting鉴定抗原，然后以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离纯化出抗原目的蛋白条带，用Westein blotting检测其相对分子质量。 结果 从SO-Rb₅₀细胞裂解液的总蛋白中分离出一条抗原目的蛋白条带，其相对分子质量约为83×10³。 结论 从SO-Rb₅₀细胞裂解液中能够提取出抗视网膜母细胞瘤单克隆抗体对应的抗原。 （中华眼底病杂志，2003，19：152-155）     

人腺样囊性癌多药耐药细胞系的建立

目的:建立人腺样囊性癌耐药细胞系,为阐明腺样囊性癌的多药耐药机制及逆转尉药提供模型及研究依据.方法:以长春新碱(VCR)为诱导剂,通过浓度递增间断刺激法对人腺样囊性癌细胞系(ACC)进行体外诱导耐药,建立耐VCR的腺样囊性癌细胞系ACC/VCR.细胞计数法绘制细胞生长曲线,噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞对化疗药物敏感性.结果:ACC经体外诱导后,ACC/VCR细胞对长春新碱(VCR)、阿霉素(ADM)和平阳霉素(PYM)的耐药性明显增强,具有交叉耐药,对环磷酰胺(CTX)、氟尿嘧啶(5-FU)和顺铂(DDP)耐药性无明显变化.耐药前后ACC细胞的生长曲线、群体倍增时间和光镜下的形态无明显改变.结论:VCR可诱导腺样囊性癌细胞产生多药耐药.     

microRNA-125b对人视网膜母细胞瘤多药耐药性影响的实验研究

目的 探讨microRNA-125b（miR-125b）在人视网膜母细胞瘤细胞中多药耐药的作用及其机制。设计 实验研究。 研究对象 人视网膜母细胞瘤SO-RB50细胞。方法 用RT-PCR方法检测miR-125b视网膜母细胞瘤细胞株SO-RB50和耐药细胞株SO-Rb50/VCR中的表达变化;化学合成的miR-125b过表达（miR-125mimic 组）和抑制载体（miR-125inhibitor组）转染SO-Rb50细胞株,用MTT法和Annexin V-FITC法检测在药物长春新碱、依托泊苷和卡铂,依次作用上述转染细胞后,细胞增生力和细胞凋亡的变化;用蛋白印迹法检测miR-125b过表达和抑制表达后细胞株SO-RB50中 MAGE-A/P53蛋白的表达变化。主要指标 细胞存活率和细胞凋亡率。结果 SO-Rb50/VCR组与SO-RB50组相比,miR-125b的表达显著增高（P=0.002）;长春新碱、依托泊苷和卡铂依次作用于转染后的SO-RB50细胞株后,miR-125mimic组与miR-125inhibitor组相比,细胞存活率显著增高（P=0.000）,细胞凋亡率显著下降（P=0.000）,P53蛋白表达水平显著下降（P=0.001）,MAGE-A蛋白表达水平显著增高（P=0.004）。结论 在SO-RB50细胞中,下调miR-125b后提高肿瘤细胞对化疗药物敏感性,且miR-125b可能是通过MAGE-A/P53通路调控视网膜母细胞瘤多药耐药性。     

人参皂甙Rg3诱导视网膜母细胞瘤HXO-RB44细胞凋亡

目的观察人参皂甙Rg3对体外视网膜母细胞瘤（Rb）HXO—RB44细胞凋亡的作用。方法不同质量浓度的Rg3处理HXO—RB44细胞后，应用MTT比色法分析其细胞生长抑制作用。HOECHST33258染色法观察细胞的形态学改变，流式细胞仪测定48h细胞凋亡率。结果人参皂甙Rg3在一定范围内抑制体外培养的HXO-RB44细胞生长，其抑制率具有时间、质量浓度依赖性（P〈0.01）。HOECHST染色可见实验组HXO-RB44细胞中致密强荧光。流式细胞仪检测凋亡率随药物质量浓度增加而增加。结论人参皂甙Rg3主要通过诱导HXO—RB44细胞凋亡达到抑制作用。     

亚硒酸钠对微波致视网膜神经节细胞损伤的防护作用

目的 观察亚硒酸钠(sodium selenite,Na₂SeO₃)对微波致体外培养的视网膜神经节细胞损伤的防护作用。 方法 体外培养视网膜神经节细胞,按加入培养液Na₂SeO₃浓度分为4组,其中1组为对照组,30 mW/cm² 微波辐射1 h,测定细胞内的脂质过氧化指标及硒浓度,末端脱氧核甘酸转移酶介导的生物素化脱氧尿甘三磷酸末端标记法(TdT-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)检测细胞凋亡。 结果 1×10⁷mol/L Na₂SeO₃即可使细胞内超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutatione peroxidase,GSH-Px)活性较未加硒组明显升高(P<0.05),丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量显著下降(P<0.05),凋亡细胞数量减少,1×10⁶ mol/L组和1×10⁵ mol/L组在抗氧化能力方面优于1×10⁷ mol/L组,但这两组间无显著差异。 结论 Na₂SeO₃对微波致视网膜神经节细胞的损伤具有一定的保护作用。 (中华眼底病杂志,2000,16:97-99)     

雌激素对缺氧视网膜Müller细胞色素上皮衍生因子表达的影响

目的:探讨雌激素对缺氧视网膜Müller细胞色素上皮衍生因子（P EDF）表达的影 响。 方法:采用逆转录聚合酶链反应（RT PCR）和Western blotting印 迹分析方法分别测定不同浓度（10^-7、10^-6、10^-5 mmol/L）雌二醇 （E₂）作用于缺氧Müller细胞后，细 胞内 PEDF mRNA及蛋白表达水平。 结果:缺氧24 h后PEDF mRNA及蛋白表达明 显降低， 10^-7、10^-6、10^-5 mmol/L E₂作用于Müller细胞后可明显缓解 由于缺氧引起的细胞内PEDF mRNA及蛋白表达的降低，并与E₂的浓度有关。 结论:雌激素可以调控PEDF的表达 ，其可能在雌激素对视网膜新生血管形成的调控中起重要作用。     

抗癌药物敏感试验（MTT法）在视网膜母细胞瘤化疗中的初步应用

介绍MTT（Tetrazolium dye,四甲基偶氮啖蓝；3-4，5Dimethylthiazol-2,5 diphenyl tetrazolium bromide）抗癌药物敏感试验指导肿瘤患者的术后化疗，并报道用于3例视网膜母细胞瘤（RB）的结果。以肿瘤细胞存活率＜30%为对药物敏感的指标，结果显示同一种抗癌药物对不同的RB患者敏感性不同；抗癌药物单剂使用的效果不如联合使用；单剂作用以卡帕、顺氨氯铂、丝裂霉素C、鬼臼乙叉甙对RB细胞抑制作用较佳，联合使用以卡帕或顺氨氯铂联合长春新碱较佳，但长春新碱单剂使用并不敏感。 （中华眼底病杂志，1993，9：207-209）     

HXO-Rb44视网膜母细胞瘤株多药耐药现象的基因研究

目的 研究视网膜母细胞瘤（retinoblastoma,Rb)细胞系HXO－Rb44细胞多药耐药基因（multidrug resistance gene,MDR1)和多药耐药相关蛋白（multidrug associated protein,MRP）基因的表达,探讨Rb多药耐药现象的发生机制。方法 用逆转聚合酶链反应检测HXO－Rb44细胞的MDR1和MRP基因的表达,并用免疫组织化学方法对其蛋白产物P－gp和P190进行检测。结果 HXO－Rb44系同时存在MDR1和MRP基因,并呈现P-gp和P190的过度表达（96％和97％）。结论 MDR1和MDRP基因的过度表达是Rb多药耐药现象发生的重要机制。     

褪黑素对体外培养的视网膜母细胞瘤HXO-RB44细胞增生活性的影响察

目的 探讨褪黑素（MLT）对视网膜母细胞瘤(RB)HXO-RB44细胞增生活性的影响及相关机制。方法 利用四氮唑化合物（MTT）比色法,观察不同浓度的MLT对RB HXO-RB44细胞增生活性的影响;利用10-10、10-9、10-8、10-7 mmol/L的MLT对RB HXO-RB44分别进行干预,采用Hoechst荧光染色观察细胞凋亡的形态学变化;利用流式细胞仪测定不同浓度的MLT干预24 h后,RB HXO-RB44细胞内活性氧（ROS）的表达、细胞周期与凋亡情况。结果 浓度为10-7 mmol/L以下的MLT对HXO-RB44细胞并无抑制作用（P值均＞0.05）。10-6 mmol/L以上的MLT能够显著抑制HXO-RB44细胞增生（P＜0.01）。浓度为10-6、10-5、10-4 mmol/L的MLT干预后,随药物浓度的升高,HXO-RB44细胞内ROS的表达逐渐升高。Hoechst染色显示：不同浓度的褪黑素分别作用于培养的HXO-RB44细胞4、8、12、24 h后,细胞核固缩、核碎裂增多,细胞凋亡的程度随着MLT浓度的增大而加重。流式细胞仪检测：药物干预后,G0/G1期细胞明显增多,S期细胞减少,G2/M期细胞相对增多,随着MLT浓度的升高,HXO-RB44细胞凋亡率明显升高。结论 浓度大于10-6 mmol/L的MLT能够有效地抑制HXO-RB44细胞增生,其抑制效率随药物浓度的升高和作用时间的延长而增强;MLT的抗细胞增殖作用可能与其诱导HXO-RB44细胞内的活性氧产生、阻滞细胞周期于G0/G1期并诱导细胞凋亡有关。     

化疗药物诱导视网膜母细胞瘤细胞凋亡模型的建立

目的 检测不同类型肿瘤化疗药物对视网膜母细胞瘤（ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ ＲＢ）细胞系ＨＸＯ－ＲＢ４４的诱导凋亡作用,建立该细胞系的细胞凋亡模型,作为今后研究化疗药物诱导ＲＢ细胞凋亡机理的工作基础。方法 将长春新碱、阿糖胞苷、氨甲喋呤、环磷酰胺、噻替派、米托蒽醌、阿克拉霉素、吡喃阿霉素、顺铂、卡铂、丝裂霉素、足叶乙甙第十二种化疗药物分别以１０＾－９、１０＾－８、１０＾－７、１０＾－６、１０＾－     

原代视网膜母细胞瘤耐药基因及耐药蛋白表达的研究

目的 研究视网膜母细胞瘤(Rb)瘤细胞多药耐药基因(MDR1)和多药耐药相关蛋白(MRP)基因以及相应耐药蛋白P-gp和MRP的表达水平.方法 共35例Rb患儿,行眼球摘除术时取新鲜的肿瘤细胞,用RT-PCR的方法 检测Rb瘤细胞是否有耐药基因MDR1和MRP基因的表达,用免疫组织化学的方法 检测相应耐药蛋白P-gp和MRP的表达.结果 34例Rb瘤细胞进行了耐药基因的检测,MDR1基因平均表达水平为0.41±0.38,MRP基因平均表达水平为0.73±0.92;35例Rb进行了耐药蛋白的检测,P-gp有15例阳性(42.9%),MRP有23例阳性(65.7%);34例Rb两种基因和蛋白两种方法 的检验结果 呈一致性;两种耐药基因及两种耐药蛋白的表达相互间有一定的联系.结论 原代Rb瘤细胞中一部分个体有不同程度的耐药基因MDR1和MRP基因及其产物耐药蛋白P-gp和MRP的表达,提示Rb可能存在原发耐药性.     

lncRNA-MEG3通过P53途径介导视网膜母细胞瘤凋亡

目的 探讨MEG3是否参与视网膜母细胞瘤的形成及其分子机制.方法 应用实时荧光定量PCR技术检测视网膜母细胞瘤组织及瘤旁正常视网膜组织标本中MEG3的表达水平;通过转染pcDNA-MEG3或siRNA-MEG3上调或干扰视网膜母细胞瘤细胞SO-RB50及HXO-RB44中MEG3的表达水平,随后用流式细胞仪检测转染后的细胞凋亡率变化,用Western blot检测转染前后P53蛋白表达水平的变化.结果 视网膜母细胞瘤组织中MEG3的表达较瘤旁正常视网膜组织出现显著下降(P=0.014).转染了pcDNA-MEG3的SO-RB50细胞MEG3表达显著增加(P =0.002),转柒了siRNA-MEG3的HXO-RB44细胞MEG3表达显著减少(P=0.004).流式细胞仪检测结果显示,MEG3表达上调后的SO-RB50细胞凋亡率显著增加(P＜0.05);干扰MEG3表达后的HXO-RB44细胞凋亡率显著减少(P＜0.05).Western blot检测结果显示,转染了pcDNA-MEG3的SO-RB50细胞中P53蛋白的表达较阴性对照组显著增加(P＜0.05),转染了siRNA-MEG3的HXO-RB44细胞中P53蛋白的表达较阴性对照组显著减少(P＜0.05).结论 视网膜母细胞瘤组织中MEG3的表达下调,且MEG3可能通过促进P53蛋白的表达诱导视网膜母细胞瘤细胞的凋亡,从而影响视网膜母细胞瘤的发生和发展.     

Expression of multidrug resistance proteins in retinoblastoma

AIM: To elucidate the mechanism of multidrug resistance in retinoblastoma, and to acquire more insights into in vivo drug resistance. METHODS: Three anticancer drug resistant Y79 human RB cells were generated against vincristine, etoposide or carboplatin, which are used for conventional chemotherapy in RB. Primary cultures from enucleated eyes after chemotherapy (PCNC) were also prepared. Their chemosensitivity to chemotherapeutic agents (vincristine, etoposide and carboplatin) were measured using MTT assay. Western blot analysis was performed to evaluate the expression of p53, Bcl-2 and various multidrug resistant proteins in retinoblastoma cells. RESULTS: Following exposure to chemotherapeutic drugs, PCNC showed less sensitivity to drugs. No significant changes observed in the p53 expression, whereas Bcl-2 expression was found to be increased in the drug resistant cells as well as in PCNC. Increased expression of P-glycoprotein (P-gp) was observed in drug resistant Y79 cells; however there was no significant change in the expression of P-gp found between primary cultures of primarily enucleated eyes and PCNC. Multidrug resistance protein 1 (Mrp-1) expression was found to be elevated in the drug resistant Y79 cells as well as in PCNC. No significant change in the expression of lung resistance associated protein (Lrp) was observed in the drug resistant Y79 cells as well as in PCNC. CONCLUSION: Our results suggest that multidrug resistant proteins are intrinsically present in retinoblastoma which causes treatment failure in managing retinoblastoma with chemotherapy.     

Arpc1b gene is a candidate prediction marker for choroidal malignant melanomas sensitive to radiotherapy

PURPOSE: Choroidal malignant melanomas (CMMs) are the most common primary intraocular tumors in adult humans. Although radiotherapy is commonly used to treat the melanomas, the therapeutic effects are unpredictable. The purpose of this study was to search for a gene(s) that can predict the success of radiotherapy for CMMs. METHODS: The cell lines 92-1, OCM-1, and OMM-1 were established from patients with CMM, and radiation sensitivity was determined using the colony-formation assay. RNA was extracted from nonirradiated cells, and gene expression analysis was performed using a microarray containing 10,800 genes. The up- or downregulated genes were verified by real-time PCR using other cancerous cell lines in which radiation sensitivity had been documented. RESULTS: Analysis of radiation survival curves showed that cell line 92-1 was radiation sensitive and OCM-1 and OMM-1 lines were radiation resistant. The results of microarray analyses showed that 34 genes were differentially expressed in the OCM-1 and OMM-1 cell lines compared with the 92-1 cell line. The validity of the expression level of 13 of the 34 genes that were identified by microarray was confirmed by PCR. From the analysis of the different radio-sensitivity cancer cell lines, the Arpc1b gene was selected as a prediction marker gene for sensitivity of CMM to radiotherapy. CONCLUSIONS: Gene expression analysis of CMM cell lines can be used to search for radiation sensitivity prediction markers. Comprehensive gene expression profiles of radiation-sensitive and/or resistant cell lines may provide new insights into the mechanisms of resistance or sensitivity to radiation therapy.     

Effects of salvianolic acid B on in vitro growth inhibition and apoptosis induction of retinoblastoma cells

AIM: To observe the effects of salvianolic acid B (SalB) on in vitro growth inhibition and apoptosis induction of retinoblastoma HXO-RB44 cells. METHODS: The effects of SalB on the HXO-RB44 cells proliferation in vitro were observed by MTT colorimetric method. The morphological changes of apoptosis before and after the treatment of SalB were observed by Hoechst 33258 fluorescent staining method. Apoptosis rate and cell cycle changes of HXO-RB44 cells were detected by flow cytometer at 48 hours after treated by SalB. The expression changes of Caspase-3 protein in HXO-RB44 cells were detected by Western Blot. RESULTS: SalB significantly inhibited the growth of HXO-RB44 cells, while the inhibition was in a concentration-and time-dependent manner. The results of fluorescent staining method indicated that HXO-RB44 cells showed significant phenomenon of apoptosis including karyorrhexis, fragmentation and the formation of apoptotic bodies, etc. after 24, 48 and 72 hours co-culturing of SalB and HXO-RB44 cells. The results of flow cytometer showed that the apoptosis rate and the proportion of cells in S phase were gradually increased at 48 hours and 72 hours after treated by different concentrations of SalB. Western Blot strip showed that the expression of Caspase-3 protein in HXO-RB44 cells was gradually increased with the increase of the concentration of SalB. CONCLUSION: SalB can significantly affect on HXO-RB44 cells growth inhibition and apoptosis induction which may be achieved through the up-regulation of Caspase-3 expression and the induction of cell cycle arrest.