恶性疟虫肝期抗原1基因3′端的克隆及序列分析

目的：克隆并测定恶性疟原虫海南株（FCC1／HN）肝期抗原1基因（LSA－1）3′端序列,比较FCC1／HN株与国外分离株LSA－1,3′端序列的差异。方法：应用PCR技术从FCC1／HN株基因组DNA中扩增LSA－1,3′端序列,用T－A克隆法将其克隆入pMD18－5载体。阳性克隆的重组质粒经酶切及PCR扩增鉴定后,用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定。应用DNASTAR软件进行不同分离株LSA－1,3′端序列的同源性分析。结果：PCR扩增得到特异的FCC1／HN LSA－1,3′端序列。酶切及PCR鉴定获得了正确的pT－LSA－1重组质粒。测序表明,所克隆的LSA－1,3′端大小为795bp,编码264个氨基酸。序列分析表明,我国恶性疟原虫FCC1／HN株国外的NF54、T9／96、KEN、PNG及BRA株LSA－1,3′端编码的氨基酸序列只在3个位点存在不同。结论：克隆了恶性疟原虫FCC1／HN LSA－1,3′端片段。序列测定及同源性分析表明,FCC1／HNLSA－1,3′端序列与其它分离株有高度的同源性。     

庚型肝炎病毒基因组全长cDNA的拼接及克隆

目的：构建ＧＢ病毒Ｃ／庚型肝炎病毒（ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶ）基因组全长ｃＤＮＡ克隆。方法：以覆盖ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶ分离株ＨＧＶ－Ｉｗ全长基因组且互相重叠的５个基因片段Ｉｗ５，Ｉｗｑ２，Ｉｗｈ６，Ｉｗ３′和Ｉｗ３为起始材料，采用重叠延伸ＰＣＲ拼接和连接酶连接的方法，构建ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶ基因组全长ｃＤＮＡ克隆。结果：ＧＢＶ／Ｃ／ＨＧＶ基因组全长ｃＤＮＡ克隆的酶切图谱与预期一致；核苷酸序列分析显示，克隆的     

克隆的丙型肝炎病毒NS2基因中发现数个N端终止突变序列

探讨丙型肝炎病毒（HCV）准种在NS2区的基因结构特征。利用逆转录－巢式PCR从一份HCV慢性携带者的阳性血清及一份急性丙肝患者的血清中获得HCV NS2全长cDNA，将其克隆于T载体，各随机挑取5个阳性克隆进行序列测定。结果显示在克隆到的HCV NS2全长基因中，慢性携带者该区序列有一个于HCV多聚蛋白第835位氨基酸的位置出现终止信号，丙肝患者该区序列有三个于第835位氨基酸的位置出现终止信号，一个小于第887位氨基酸的位置出现终止信号。在克隆到的HCV NS2基因中存在多个N端终止突变序列，提示NS2 N端跨膜区可能与包膜蛋白区有着密切的联系。     

丙型肝炎病毒Ns_3基因区部分序列的PCR克隆和鉴定

选取HCV－1、HCV－J、HCV－BK、台湾株HCV、中国河北株HCV序列的同源性部分，设计Ns3区部分序列的PCR引物．应用RT－PCR技术，从丙型肝炎患者血浆中扩增一长为448bp的cDNA片段作为目的基因，与经过限制性酶切的pUcI9载体连接，构建重组质粒pUHCV－Ns3．分别或混合应用HCV序列特异的引物和载作序列特异的通用引物，以PCR扩增重组质粒，结果扩增产物的分子量均与预期大小一致．限制性酶切位点分析结果也证实，克隆的基因是HCV的Ns3区部分序列的目的基因．克隆序列的特异性和插入方向同时得到了鉴定．     

西尼罗I型病毒亚克隆的构建及其鉴定

目的构建西尼罗病毒基因组的cDNA亚克隆，为西尼罗病毒全长cDNA克隆的研发和应用打下基础。方法根据基因组中限制性酶切位点的分布设计4对引物，QIAamp RNA抽提试剂盒提取西尼罗病毒培养细胞BHK-21的总RNA，长片段RT-PCR技术扩增目的基因片段。将目的基因片段与pMD18-T载体进行连接，转化人感受态细胞E.coli DH5α，进行蓝白斑筛选后得到阳性克隆。将重组质粒进行PCR和测序鉴定。结果获得的目的基因片段经PCR和测序结果表明西尼罗病毒功能基因正确地克隆进入载体。结论成功获得西尼罗I型病毒功能基因的cDNA亚克隆，可应用于西尼罗病毒全长cDNA克隆的制备。     

恶性疟原虫MESA基因的克隆和测序

目的克隆、测定恶性疟原虫海南株(FCC1／HN)成熟疟原虫感染红细胞表面抗原(MESA)基因序列，并进行序列分析。方法根据恶性疟原虫palo-alto株MESA基因已知序列，设计合成四对引物，用PCR技术从FCC1／HN株基因组DNA中扩增出4个部分序列重叠的MESA基因片段，分别克隆入pMD-18T测序载体。用双脱氧链末端终止法测定这4个基因片段的序列，拼接得到全长MESA基因序列。应用DNAstar、AnthProt软件辅助进行序列同源性比较和抗原表位区预测。结果PCR扩增得到特异的恶性疟原虫FCC1／HN株MESA基因片段，酶切及PCR鉴定获得了包含MESA基因片段的重组质粒。测序结果表明，FCC1／HN株MESA全基因编码区长4102bp，A T含量为72．11％，G C含量为27．89％，有1个内含子；编码1323个氨基酸残基，分子量为154470u。序列分析表明，FCC1／HN株与Palo-aho、D10株MESA蛋白在长度和序列组成上呈多态性，序列差异较大区域位于MESA蛋白的氨基酸重复区1、3、4、5和7。经多参数综合分析，有7个潜在的抗原表位区。结论测定、分析了恶性疟原虫FCC1／HN株MESA基因序列。FCC1／HN株MESA基因与其它分离株的MESA基因编码的氨基酸序列存在一定差异。     

西尼罗Ⅰ型病毒亚克隆的构建及其鉴定

目的 构建西尼罗病毒基因组的cDNA亚克隆,为西尼罗病毒全长cDNA克隆的研发和应用打下基础.方法 根据基因组中限制性酶切位点的分布设计4对引物,QIAamp RNA抽提试剂盒提取西尼罗病毒培养细胞BHK-21的总RNA,长片段RT-PCR技术扩增目的 基因片段.将目的 基因片段与pMD18-T载体进行连接,转化入感受态细胞E.coli DH5α,进行蓝白斑筛选后得到阳性克隆,将重组质粒进行PCR和测序鉴定.结果 获得的目的 基因片段经PCR和测序结果表明西尼罗病毒功能基因正确地克隆进入载体.结论 成功获得西尼罗Ⅰ型病毒功能基因的cDNA亚克隆,可应用于西尼罗病毒全长cDNA克隆的制备.     

SARS冠状病毒PUMC2株全基因组cDNA分段克隆

目的 分段克隆SARS冠状病毒PUMC2株的全基因组cDNA。方法 以SARS冠状病毒PUMC2株基因组RNA为模板,用RT-PCR扩增cDNA片段,PCR产物经纯化后,连接人pGEM-T载体中,进行序列测定。结果 获得了SARS冠状病毒PUMC2株基因组全长cDNA的分段克隆。结论 SARS冠状病毒PUMC2株基因组全长cDNA分段克隆的获得,为SARS冠状病毒基因功能的研究和全长有感染性cDNA的克隆奠定了基础。     

SARS冠状病毒PUMC_2株全基因组cDNA分段克隆

目的分段克隆SARS冠状病毒PUMC2株的全基因组cDNA。方法以SARS冠状病毒PUMC2株基因组RNA为模板,用RT-PCR扩增cDNA片段,PCR产物经纯化后,连接入pGEM-T载体中,进行序列测定。结果获得了SARS冠状病毒PUMC2株基因组全长cDNA的分段克隆。结论SARS冠状病毒PUMC2株基因组全长cDNA分段克隆的获得,为SARS冠状病毒基因功能的研究和全长有感染性cDNA的克隆奠定了基础。     

稳定表达丙型肝炎病毒单链丝氨酸蛋白酶的HepG2细胞克隆的建立

目的：构建丙型肝炎病毒单链丝氨酸蛋白酶（scNS4A／NS3）的真核表达载体;建立重组质粒稳定转染的HepG2细胞克隆．方法：根据文献报道设计扩增scNS4A／NS3编码基因的引物,从HCV阳性患者血清中提取病毒RNA,RT-PCR方法扩增出scNS4A／NS3基因片段,BamH Ⅰ／HindⅢ双酶切后连接到经同样酶切的真核表达载体pcDNA3,1（-）,转化菌株JM109感受态细胞,获得重组质粒pcDNA3．1（-）～scNS4A／NS3,经酶切鉴定及序列测定．将阳性重组质粒用脂质体法转染HepG2细胞,经持续G418压力选择和克隆化获得稳定转染的细胞系,用RT-PCR,IFA,Western-blot证实该稳定细胞系可以表达单链丝氨酸蛋白．结果：成功构建了真核表达载体pcDNA3．1（-）-scNS4A／NS3;建立了稳定转染的HepG2细胞克隆,命名为scpHepG2．结论：获得稳定的scpHepG2细胞克隆可表达单链丝氨酸蛋白,为下一步建立以细胞为基础的评价抗HCV丝氨酸蛋白酶药物系统奠定基础．     

丙型肝炎病毒1bDY株ns5a基因的克隆及其所表达融合蛋白的免疫原性分析

目的:克隆和表达丙型肝炎病毒(HCV)1b型地方株DY株ns5a基因,为进一步研究和应用该基因及其表达产物奠定基础。方法:采用基因重组技术完成实验。设计特异的引物,采用巢式PCR法,从含HCV 1b DY株全长cDNA的质粒HCV17中扩增出目的片段,约480bp;将其插入克隆载体pMD18-Tvector中,再与原核表达载体pET-28a重组;经酶切、PCR及测序鉴定后转化入BL21菌株,在IPTG诱导下进行融合蛋白的表达。采用SDS-PAGE电泳及Western-blot检测NS5A蛋白表达水平。结果:含有HCV 1b DY株ns5a基因的重组体构建成功,并得以表达蛋白,并且NS5A蛋白具有与HCV患者阳性血清中的多克隆的结合活性,具有很好的免疫原性。结论:运用原核细胞基因工程技术成功构建和表达了HCV 1b DY株ns5a基因,为进一步研究HCVns5a的基因型及探讨该基因编码的NS5A蛋白的性质和生物学活性创造条件。     

登革2型病毒全长NS1基因真核表达载体的构建及序列分析

目的克隆登革2型病毒(DEN2)全长NS1基因，构建NS1基因的真核表达重组质粒。方法用RT—PCR技术扩增DEN2(NGC株)全长的NSl基因序列，并定向克隆入pPICZαB的KpnⅠ／XbalⅠ位点，构建真核表达载体pPICZαB—NS1，转化E.coli DH5a菌。阳性重组质粒用PCR、酶切及序列测定等方法鉴定。结果阳性质粒经PCR及KpnⅠ／XbaⅠ双酶切获得了一个核苷酸长度为1134bp的基因；序列测定证实该基因与DEN2(NGC株AF038403)NS1基因序列有99％同源。结论成功构建了含有DEN2全长NS1基因的真核表达载体DPICZαB—NS1，为NS1的进一步酵母表达奠定了良好的基础。     

登革2型病毒NGC株基因组亚克隆的构建及其鉴定

目的 构建登革2型病毒NGC株基因组全序列的亚cDNA克隆，为进一步构建全长感染性cDNA克隆奠定基础。方法根据登革2型病毒NGC株基因组全序列中的酶切位点设计2对引物，从病毒感染的乳鼠脑中提取RNA，采用长链RT—PCR技术扩增出覆盖病毒基因组全长的2个cDNA片段，并克隆至pCR—XL—TOPO载体后测序。结果经酶切鉴定和序列测定表明，获得的cDNA克隆为登革2型病毒NGC株特异的。结论已成功构建出登革2型病毒NGC株基因组的2个cDNA亚克隆。     

恶性疟原虫海南株节结相关组氨酸富集蛋白基因的克隆及序列分析

目的 克隆恶性疟原虫海南株（FCC1／HN）节结相关组氨酸富集蛋白（KAHRP）基因，并进行序列分析。方法 采用PCR技术分两段从FCC1／HN株基因组A趸扩增出部分序列重叠的KAHRP基因片段，分别克隆入pMD-18T测序载体。用双脱氧链末端终止法测定这2个片段的序列，从而得到全长KAHRP基因序列。应用AnthProt、DNAstar软件辅助分析基因结构及进行同源性比较。结果 恶性疟原虫FC1/HN KAHRP全基因长2358个核苷酸，在112至564位核苷酸是内含子，全基因编码634个氨基酸残基，其中赖氨酸含量为14．35％，丙氨酸含量为9．15％，组氨酸含量为7．72％；分子量为69．37kDa。序列分析表明，我国恶性疟原虫FCC1／HN株与国外的3D7、FCR3、India-1、India-2、NF17、Palo-alto,PUPSP株KAHRP基因编码的氨基酸残残留基有52个氨基酸残基替代位点，并存在氨基酸残基序列的增加和缺失。经多参数综合分析，可能有5个潜在的抗原表位区。结论 克隆了恶性疟原虫FCC1／HN株KAHRP基因。序列测定及同源性分析表明，FCC1／HN株与其它分离株KAHRP基因编码的氨基酸序列存在一定差异。     

丙型肝炎病毒NS5A基因真核表达载体的构建及其在HL-7702细胞中的高效表达

目的：构建丙型肝炎病毒(HCV)NS5A基因的真核表达载体，并在正常人肝细胞株(HL-7702细胞)中进行表达，为今后研究HCV NS5A蛋白功能奠定基础。方法：从含HCV NS345序列的重组质粒pCDNA3.1（+）/ NS345中扩增出HCV NS5A基因片段，构建pCI-neo/ NS5A重组表达质粒。用脂质体将其转染HL-7702细胞，通过Western blotting印迹法鉴定NS5A蛋白。结果：用PCR方法扩增的HCV NS5A基因全长1 344 bp,与PGEM-T重组，测序证实所克隆的NS5A基因片段大小正确；成功地构建pCI-neo/ NS5A重组表达质粒，瞬时转染HL-7702细胞表达NS5A蛋白，Western blotting印迹法显示其相对分子质量约为56 000。结论：HCV NS5A的真核表达载体pCI-neo/ NS5A在HL-7702细胞中能有效表达NS5A蛋白，NS5A蛋白可导致病毒复制、肝细胞癌发生，且NS5A区为IFN敏感性决定区。     

甲肝病毒减毒活疫苗（H2株）的cDNA克隆及序列分析

本文通过ｍＲＮＡ提取，逆转灵（ＲＴ）－聚合酶链反应（ＰＣＲ），获得甲肝病毒减毒活疫苗株（Ｈ２减毒株）的ｃＤＮＡ片段，再经分子克隆，从而得到贯穿甲肝病毒（ＨＡＶ）全基因组的１０个相互重叠基因片段的ｃＤＮＡ克隆。经双脱氧末端终止法进行核苷酸序列分析，得到了长度为７４７３ｂｐ的甲肝病毒减毒活疫苗株（Ｈ２减毒株）ｃＤＮＡ全序列。计算机分析表明，该株与野毒株ＨＭ１７５的核苷酸和氨基酸同源性分别为９９．４％和     

丙型肝炎病毒NS5B区基因的扩增、克隆及序列分析

目的 对丙型肝炎病毒(HCV)NSSB区基因克隆并测序，研究其变异状况。方法 从HCV RNA阳性血清中抽提病毒RNA，利用巢式RT-PCR对NS5B区基因进行扩增，将扩增获得的靶cDNA克隆至P^KPL-3a质粒载体中，并以内引物为测序引物进行序列测定分析。结果 构建了已克隆HCVNS5B区基因的重组质粒KHC5—1；序列分析表明，与HCV-BDS株同源性最高，属于主要流行于我国的HCV 1b基因亚型。结论 证实了在NS5B区，与RNA依赖的RNA聚合酶(RDRP)活性密切相关的基元结构Gly-Asp-Asp及其相邻序列的同源性非常高。     

人血管内皮生长因子基因cDNA的克隆及其在COS-7细胞中的表达

目的：克隆和在COS－7细胞中表达人血管内皮生长因子165（VEGF165）。方法：利用RT－PCR方法，从新鲜卵巢癌组织中扩增到人VEGF165的全长cDNA，并测定其核酸序列；利用基因重组技术构建VEGF165的真核表达载体pcDNA3.1-VEGF165；应用脂质体介导的基因转移术将这一表达载体导入COS－7细胞后，免疫组化（SP法）检测瞬时表达的产物。结果：经酶切鉴定和基因测序证实，克隆的基因片段为人VEGF65cDNA，重组质粒pcDNA3．1－VEGF165转染COS－7细胞后，免疫组化检测有VEGF表达，结论：成功克隆人VEGF165基因，并在COS－7细胞获得表达。     

人I型基质金属蛋白酶基因真核表达重组质粒的构建

目的：构建人I型基质金属蛋白酶基因（MMP1）真核表达重组质粒，并进行序列分析。方法：用逆转录聚合酶链反应扩增人I型基质金属胶原酶cDNA，获得目的基因片段（1407bp）连接至pcDNA3载体，并转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆并鉴定，并对片断全长进行DNA序列测定。结果：所克隆人I型基质金属胶原酶cDNA，含全长MMP1编码区，与GeneBank公布序列比较，仅1318位的胞苷酸C突变为腺苷酸A。并成功构建了含有MMP1的真核表达质粒pcDNA3－MMPI。结论：以逆转录聚合酶链反应方法成功构建了人I型基质金属胶原酶cDNA克隆，并获得该基因真核表达质粒pcDNA3-MMP1，从而为下一步抗肝纤维化基因治疗研究提供物质基础。     

Bal b／c小鼠甘露聚糖结合凝集素—C基因的克隆与鉴定

目的：获得小鼠甘露聚糖结合凝集素－C（MBL－C）基因的全长编码区cDNA。方法：利用RT－PCR方法，从Balb/c小鼠的肝细胞中分离出MBL－C基因cDNA片段，将其克隆入PUC－T载体并测序，对基因结构及其与人MBL基因的同源性进行比较分析。结果：扩增得到的Bal b/c小鼠MBL－C基因cDNA全长735bp，编码245个氨基酸残基，包含了完整的编码区基因序列，经核苷酸序列比较分析发现，扩增得到的Bal b/c小鼠BL－C基因与Genbank中发表的序列具有100％的同源性，与人的MBL基因的同源性为71．4％。结论：成功地克隆到完整的Bal b/c小鼠MBL－C编码区基因，为进一步在整体水平研究MBL分子的天然免疫功能提供了必要的条件。