HT29和HCT116结肠癌细胞无血清培养形成肿瘤干细胞球特性的差异性研究

目的比较HT29和HCT116两种结肠癌细胞系中肿瘤干细胞的差异，初步探讨结肠癌干细胞研究模型。方法以无血清培养法培养HT29和HCT116细胞，观察其在不同时间形成肿瘤干细胞球的差异，用限制性稀释法计算两者的成球率；流式细胞术分析HT29和HCT116细胞系中CD44／CD24的表达情况；裸鼠体内成瘤实验鉴定HT29细胞球与HCT116细胞球成瘤能力。结果无血清培养法发现HCT116较HT29更易形成肿瘤干细胞球且所需时间更短，即HT29在无血清培养的第7天开始形成规则的球体，而HCT116则在第5天就已形成规则的球体，HCT116成球率（11．4±1．15）％高于HT29（3．31±0．27）％，且差异有统计学意义（P〈0．05）；HT29和HCT116中CD44±／CD24±各细胞含量有显著差异，结果显示具有干细胞特性的CD44＋／CD24＋结肠癌细胞在HCT116中所占比例（60．33±5．75）％明显高于HT29（9．23±2．15）％，差异有统计学意义（t=13．939，P〈0．05）；体内成瘤实验发现HCT116细胞球在裸鼠体内的成瘤能力明显强于HT29细胞球，HCT116细胞球的成瘤速度及瘤体生长速度都较HT29细胞球快。结论与HT29相比，HCT116结肠癌细胞系更适合作为肿瘤干细胞研究的模型。     

靶向乳腺癌干细胞DC瘤苗的核酸抗原制备

摘要 目的：应用无血清培养基细胞球培养法富集MCF-7乳腺癌干细胞,制备乳腺癌干细胞mRNA核酸抗原,为制备靶向乳腺癌干细胞树突细胞瘤苗奠定基础。方法：应用无血清培养基悬浮培养法富集MCF-7乳腺癌细胞,经单克隆形成、表面标志检测、NOD-SCID小鼠成瘤等实验对其肿瘤干细胞特性进行鉴定后,利用T7 mMESSAGE mMACHINE试剂盒进行mRNA体外扩增。结果：乳腺癌细胞MCF-7在无血清培养基中可形成悬浮状细胞球,其中具有CD44+CD24-表面标志的细胞约占90.16%。该细胞亚群具有较贴壁细胞更强的克隆形成能力和低剂量体内成瘤能力。细胞总RNA经体外扩增获得的mRNA,可作为核酸抗原。结论：应用无血清悬浮细胞球培养法可以获得高含量乳腺癌干细胞。通过体外扩增方法获得该细胞亚群的mRNA,可作为肿瘤核酸抗原,为下一步制备靶向乳腺癌干细胞的树突细胞瘤苗奠定了基础。     

胰腺癌肿瘤干细胞的悬浮培养法

目的 建立无血清悬浮培养分离人胰腺癌细胞系PANC1干细胞球的方法.方法 采用无血清悬浮法培养PANC1细胞,显微镜下观察干细胞球形成率;流式细胞仪检测细胞CD133表达和细胞周期;以含10%FBS培养基诱导干细胞球细胞分化,荧光显微镜下观察细胞形态及CK18的表达;干细胞球细胞接种NOD/SCID小鼠皮下,观察其成瘤能力.结果 在无血清悬浮培养条件下存活的PANC1细胞形成干细胞球,体外连续传代培养20代始终保持4%0～5%0的干细胞球形成率.干细胞球细胞CD133表达率(5.91±0.7)%,G0/G1期细胞占(80.99±2.60)%,与原代PANC1细胞的(1.44±0.52)%和(69.01±5.03)%相差显著(P＜0.05).将于细胞球细胞置含血清培养基中培养.细胞逐渐恢复原代细胞形态,并表达上皮标志蛋白CK18,2×103的干细胞即在NOD/SCID小鼠皮下成瘤.结论 无血清悬浮法培养PANC1细胞可分离出肿瘤干细胞,其具有自我更新、多向分化和成瘤能力.     

应用低浓度长春新碱分离并鉴定MG-63细胞系中的骨肉瘤干细胞

目的 分离并鉴定人成骨肉瘤细胞系MG-63中的骨肉瘤类肿瘤干细胞.方法 通过无血清培养基加入低浓度长春新碱的方法悬浮培养成骨肉瘤细胞球来进行分离和类干细胞富集.后行细胞形态学观察、细胞球免疫荧光染色、RT-PCR、流式细胞仪鉴定细胞表面标志物,成骨、成脂肪诱导及裸鼠成瘤的一系列鉴定试验.结果 悬浮培养得到肉瘤细胞球,可持续传代细胞亚系"MG-63-M",多能干细胞、胚胎干细胞标志物及多药耐药基因表达均为阳性.具有很强的自我更新及多项分化能力.结论 MG-63细胞系中存在具有自我更新及多向分化能力的骨肉瘤干细胞,而采用神经干细胞培养基中添加低浓度长春新碱是从骨肉瘤细胞系中分离培养出骨肉瘤干细胞的有效办法.     

CD117阳性细胞亚群在肝癌细胞系HepG2中的分离及其特性

目的:观察从人肝癌细胞系HepG2中分离的CD117+细胞生物学行为,探讨肝癌中CD117+细胞亚群的干细胞特性.方法:采用无血清悬浮培养法培养HepG2细胞,流式细胞术检测HepG2及球体细胞中CD117的表达比例.用流式细胞分选技术从HepG2成球细胞中分离CD117+的肿瘤细胞,进行无血清悬浮培养,观察其成球能力.CCK-8法观察CD117+细胞的增殖能力和顺铂对CD117+细胞的抑制率,计算IC50和耐药指数(RI).结果:HepG2细胞能在无血清培养基中存活、增殖并形成细胞球,成球率为6.21%±2.03%;流式细胞检测发现球体细胞中CD117+细胞的比例比HepG2细胞提升了9倍;CD117+细胞在无血清培养基中成球率和增殖能力均显著高于未分选细胞和CD117细胞;CD117+细胞在各浓度的顺铂作用下抑制率均较未分选细胞和CD117细胞明显降低,三者IC50分别为12.229μmol/L、7.970μmol/L和7.345μmol/L,CD117+细胞和未分选细胞耐药系数RI为1.165和1.076.结论:人肝癌细胞系HepG2中的CD117+细胞是具有肿瘤干细胞特性的细胞亚群,CD117可能是肝...     

Wee1抑制剂MK-1775对GBC-SD细胞系胆囊癌干细胞样细胞自我更新的影响

目的 研究Wee1抑制剂MK-1775对GBC-SD细胞系胆囊癌干细胞样细胞自我更新的抑制作用.方法 体外培养GBC-SD细胞系,在无血清干细胞培养基中加入MK-1775后培养悬浮肿瘤干细胞球; Westernblot检测Wee1的表达,并分析比较肿瘤干细胞球体积大小和形成率的变化;建立裸鼠皮下移植瘤模型后MK-17751灌胃2 wk, 2 wk后检测分析移植瘤的重量.结果 加入MK-1775培养8 d后, GBC-SD细胞中Wee1表达下调,同时肿瘤干细胞球大小及形成率均受到抑制;经MK-17751处理后,裸鼠皮下移植瘤生长受到抑制.结论 MK-1775具有抑制GBC-SD细胞系胆囊癌干细胞样细胞自我更新的作用.     

干细胞培养基成球培养法筛选结肠癌干细胞的生物学特性

目的探讨干细胞培养基成球培养法筛选结肠癌干细胞的相关蛋白表达及生物学特性。方法用干细胞培养基成球培养法筛选结肠癌干细胞,Western blot检测干细胞相关蛋白的表达,流式细胞仪检测细胞周期;同时检测干细胞增殖、黏附、耐药及侵袭能力,并摸索结肠癌干细胞最佳冻存条件。结果用干细胞培养基成球培养法成功培养出了结肠癌细胞球,检测发现干细胞相关蛋白表达增强,静止期细胞比例明显升高,细胞增殖速度慢,黏附性、耐药性、侵袭性均强于亲本细胞。结论干细胞培养基成球培养法筛选的细胞球中富集了肿瘤干细胞,为结肠癌干细胞的研究提供了良好的细胞模型。     

肾癌干细胞的培养及鉴定

目的从肾癌细胞中获取肾癌干细胞。方法将肾癌细胞悬浮于含有表皮生长因子（EGF）和成纤维生长因子（bFGF）的无血清培养基中培养。用流式细胞仪检测其CD133及CD34。收集无血清培养7d后的细胞重新常规培养并观察其分化情况。结果悬浮培养2d后出现肾癌干细胞球,培养7d后表达CD133^＋,CD34^-的细胞占8．33％±1．26％,高于肾癌细胞中表达CD133^＋CD34^-的细胞（P〈0．05）,后者只占1．24％±0．36％。结论用无血清培养基和悬浮培养的方法可以从肾癌细胞中获取肾癌干细胞。     

无血清培养胆囊癌GBC-SD细胞形成肿瘤细胞球的鉴定

目的:分离扩增肿瘤干细胞,并鉴定其生物学性质.方法:用无血清培齐基培养人胆囊癌GBC-SD细胞得到肿瘤细胞球.将肿瘤细胞球传代扩增,并用含血清培养基培养促使其分化;将肿瘤球和普通GBC-SD细胞分别种入96孔板,MTT检测增殖能力,并将肿瘤球和普通GBC-SD细胞分别植入裸鼠皮下,观察移植瘤的形成:流式细胞术检测CD15s和CD24在肿瘤球细胞和普通GBC-SD细胞中的表达,筛选细胞表面标志物.结果:在无血清培养基中,胆囊癌细胞可以形成少量的肿瘤细胞球,并显示很强的自我更新和增殖能力,含血清环境能够诱导其分化而贴壁生长;在动物实验中,肿瘤球细胞较普通GBC-SD细胞显示更强的致瘤能力(80.00%vs 10.00%,P<0.05);标志物CD15s在肿瘤球的表达较普通GBC-SD细胞明显增高(2.56%±0.38%vs 10.77%±0.93%,t=18.25,P<0.05).结论:人胆囊癌细胞GBC-SD的肿瘤干细胞可以通过无血清培养环境来分离和扩增,CD15s可能为其细胞表面标志物.     

大肠癌细胞系Lovo中亚群(SP)细胞的分离培养和鉴定

目的:应用无血清培养液(SFM)培养Lovo细胞系,克隆分离具有干细胞样特性SP细胞.方法:应用SFM培养Lovo细胞,分离成球样生长的细胞群作为SP细胞,并通过有限稀释,分化,自我更新,含血清培养基(SSM)和SFM交替培养及Musashi-1化学染色方法来鉴定SP细胞.结果:Lovo细胞中约含有0.54%-0.62%的SP能够在无血清培养基中能够存活、增殖,形成悬浮的肿瘤细胞球;在SFM中加入血清可促使SP细胞分化;SP细胞可以连续传代,并可交替培养于SSM和SFM中,细胞形态无明显变化;SP细胞Musashi-1染色阳性.结论:应用SFM可从Lovo细胞中分离出极少量的具有干细胞特性的SP细胞.     

羟基喜树碱富集结肠肿瘤干细胞样群体的初步研究

背景:肿瘤干细胞是临床上肿瘤耐药的主要机制,识别并靶向肿瘤干细胞为肿瘤治疗的研究带来了新的思路。目的:探讨在体外以化疗药物富集结肠肿瘤干细胞样群体的可行性。方法:应用前期实验中以药物浓度递增诱导法建立的羟基喜树碱(HCPT)耐药人结肠癌细胞株SW1116/HCPT,免疫荧光标记干细胞表面抗原CD133,Hoechst33342/PI双染流式细胞仪检测、分选侧群(SP)细胞,实时PCR检测干细胞相关和多药耐药相关基因表达。结果:亲代细胞株SW1116中CD133阳性群体和SP群体分别仅占2%和1%,耐药细胞株SW1116/HCPT中则高达7%和61%,多药耐药基因MDR1抑制剂维拉帕米可使两组SP群体均下降至接近0水平。SW1116/HCPT细胞SP群体中干细胞相关基因CD133、Nanog和多药耐药相关基因MDR1、MRP1、MRP2、MRP6 mRNA表达水平较非SP群体显著上调(P0.05)。结论:HCPT药物浓度递增诱导法可成功富集结肠肿瘤干细胞样群体,其SP亚群中存在于细胞相关和多药耐药相关基因高表达。     

表皮生长因子及其受体对结肠癌干细胞的增殖调控

背景：肿瘤干细胞是肿瘤组织中一小部分具有自我更新、多向分化以及高度增殖能力的肿瘤细胞。研究发现表皮生长因子（EGF）可促进肿瘤干细胞增殖。目的：探讨EGF及其受体（EGFR）在结肠癌干细胞增殖调控中的作用。方法：结肠癌细胞株HT29、HCTll6培养于无血清培养基中,以EGF、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、胰岛素样生长因子（IGF）分别干预细胞。MTT11法检测EGFR抑制剂吉非替尼对结肠癌细胞球细胞的增殖抑制作用,体外实验检测EGFR抑制剂吉非替尼、PDl53035对细胞球形成的抑制作用,流式细胞术检测细胞凋亡。体内实验检测结肠癌细胞球和细胞株的成瘤能力,real、timePCR检测两者干细胞标记LGR5、Musashi-1和分化标记CK20表达。结果：EGF组HCT116细胞形成的细胞球数量显著高于空白对照、bFGF、IGF组（P〈0．05）。吉非替尼能抑制HCT116细胞球细胞增殖和细胞球形成,并诱导细胞凋亡,作用呈浓度依赖性。HCT116细胞球成瘤时间较细胞株显著缩短,移植瘤体积显著增大（P〈0．05）。LGR5、Musashi-1在细胞球中的表达显著高于细胞株,而CK20在细胞株中的表达显著高于细胞球（P〈0．05）。结论：EGF对结肠癌细胞株HCTll6、HT29形成细胞球具有促进作用。EGFR抑制剂可抑制结肠痛细胞球增殖并诱导细胞凋亡,相关作用可能与调控LGR5、Musashi-1和CK20表i大有关。     

A subpopulation of CD24⁺ cells in colon cancer cell lines possess stem cell characteristics

Cancer stem cells (CSCs) have been shown to contribute to the resistance and relapse in a range of cancer types such as breast cancer and glioma. However, colon cancer stem cells remain poorly characterized. Here we reported that CD24+ subpopulation in colon cancer cell lines HCT116 and SW480 exhibited cancer stem cell-like characteristics. Using flow cytometry candidate CSCs markers were selected after initial screening of known CSCs markers from other types of cancer on colon cancer cell lines HCT116, SW480 and HT29. CD24 was expressed in the minority of bulk cell population of HCT116 and SW480 cell lines. Moreover, functional tests demonstrated that CD24+ cells exhibited enhanced chemotherapy-resistance, self-renewal and tumorigenic capacity both in vitro and in vivo, compared to CD24- subpopulations. These results suggest that CD24+ subpopulation in colon cancer cell lines HCT116 and SW480 exhibits CSCs like characteristics, and represents a nice model to study and develop effective strategies to overcome chemo-resistance and relapse of colon cancer.     

二甲双胍对结肠癌细胞增殖的影响

目的研究发现,二甲双胍在多种肿瘤中显示出抗肿瘤作用。在结直肠癌中,二甲双胍对肿瘤的抑制作用机制尚不明确,本研究旨在探究二甲双胍对结肠癌细胞增殖的影响。 方法MTT实验检测不同浓度的二甲双胍对HT29结肠癌细胞增殖率变化的影响。利用蛋白免疫印迹方法检测二甲双胍作用下的HT29结肠癌细胞增殖相关蛋白表达的变化。 结果二甲双胍能够抑制结肠癌HT29细胞的增殖且呈浓度依赖性。利用二甲双胍处理HT29细胞不同时间点后发现,二甲双胍能够抑制蛋白激酶B（Akt）与细胞外调节蛋白激酶（ERK）的磷酸化水平。进一步研究证实,二甲双胍能够抑制结肠癌细胞Akt、Erk上游IGF1R磷酸化水平。 结论二甲双胍能够通过阻断胰岛素样生长因子受体（IGF1R）进而抑制下游Akt、Erk信号抑制结肠癌HT29细胞增殖。     

恶性脑胶质瘤U87细胞系肿瘤干细胞放疗敏感性的体外实验研究

目的探讨脑胶质瘤细胞系U87细胞及其肿瘤干细胞（CSCs）对体外放疗的敏感性。方法应用神经干细胞（NSCs）培养基分离培养形成细胞球克隆,检测细胞球细胞的NSCs特性。采用不同剂量放射线照射U87细胞及其CSCs,应用集落形成实验和生存曲线检测其生存情况。结果 U87细胞在NSCs培养基中形成悬浮的细胞球克隆,具有自我更新和多向分化能力,表达CD133、Nestin;两种细胞的存活率均随照射剂量增加而下降,且CSCs的存活率明显高于U87细胞（P〈0.01）。结论在体外条件下,CSCs的放射敏感性明显低于U87细胞,其可能是恶性脑胶质瘤放疗抵抗的主要原因。     

Side population does not define stem cell-like cancer cells in the adrenocortical carcinoma cell line NCI h295R

Recent evidence suggests the existence of a stem cell-like subpopulation of cells in hematological and solid tumor entities, which determine the malignant phenotype of a given tumor through their proliferative potential and chemotherapy resistance. A recently used technique for the isolation of this cell population is through exclusion of the vital dye Hoechst 33342, which defines the so-called side population (SP). Herein we demonstrate the presence of SP cells in a variety of adrenal specimens, including primary cultures of human adrenocortical tumors and normal adrenal glands as well as established human and murine adrenocortical cancer cell lines by fluorescence-activated cell sorter analysis and confocal microscopy. On a functional level, SP cells from the human adrenocortical tumor cell line NCI h295R revealed an expression pattern consistent with a less differentiated phenotype, including lower expression of steroidogenic enzymes such as steroid acute regulatory protein (StAR) and side-chain cleavage enzyme (P450scc) in comparison with non-SP cells. However, proliferation between SP and non-SP cells did not differ (105.6 +/- 18.1 vs. 100.0 +/- 3.5%). Furthermore, re-sorting and tracing experiments revealed the capacity for both cell types to give rise to the original SP- and non-SP-containing cell population. Similarly to the baseline growth kinetics, no survival benefit was evident in SP cells after treatment with cytotoxic agents commonly used in adrenocortical carcinomas. Taken together, these findings provide evidence that Hoechst dye exclusion, in contrast to what has been reported for other tumor entities, is not a major tumor stem cell defining marker in adrenocortical NCI h295R tumor cells.     

Ovarian cancer side population defines cells with stem cell-like characteristics and Mullerian Inhibiting Substance responsiveness

The recent identification of "side population" (SP) cells in a number of unrelated human cancers and their normal tissue sources has renewed interest in the hypothesis that cancers may arise from somatic stem/progenitor cells. The high incidence of recurrence attributable to multidrug resistance and the multiple histologic phenotypes indicative of multipotency suggests a stem cell-like etiology of ovarian cancer. Here we identify and characterize SP cells from two distinct genetically engineered mouse ovarian cancer cell lines. Differential efflux of the DNA-binding dye Hoechst 33342 from these cell lines defined a human breast cancer-resistance protein 1-expressing, verapamil-sensitive SP of candidate cancer stem cells. In vivo, mouse SP cells formed measurable tumors sooner than non-SP (NSP) cells when equal numbers were injected into the dorsal fat pad of nude mice. The presence of Mullerian Inhibiting Substance (MIS) signaling pathway transduction molecules in both SP and NSP mouse cells led us to investigate the efficacy of MIS against these populations in comparison with traditional chemotherapies. MIS inhibited the proliferation of both SP and NSP cells, whereas the lipophilic chemotherapeutic agent doxorubicin more significantly inhibited the NSP cells. Finally, we identified breast cancer-resistance protein 1-expressing verapamil-sensitive SPs in three of four human ovarian cancer cell lines and four of six patient primary ascites cells. In the future, individualized therapy must incorporate analysis of the stem cell-like subpopulation of ovarian cancer cells when designing therapeutic strategies for ovarian cancer patients.     

人胰腺癌细胞系SW1990中肿瘤干细胞样侧群细胞的分离及生物学特性研究

目的 从人胰腺癌细胞系SW1990中分离肿瘤干细胞样侧群(side population,SP)细胞,并进一步研究其生物学特性.方法 细胞常规培养后应用Hoechst 33342和PI染色、荧光激发流式细胞仪检测并分选SP细胞,MTT法检测细胞活性,流式细胞仪分析干细胞标志物CD133的表达,克隆平板测定细胞克隆形成能力,Western blot检测细胞ABC超家族成员G2(ABCG2)蛋白表达.结果 人胰腺癌细胞系SW1990中SP细胞比例为2.70%,可完全被维拉帕米阻断.培养9 d后,SP细胞的A492值为2.1,克隆形成率为(38.7±6.8)%,CD133阳性率为69.63%,均显著高于非SP细胞的0.5,(15.5±2.8)%,16.71%;SP细胞ABCG2表达也较非SP细胞强.结论 胰腺癌细胞系SW1990存在SP细胞.