IL-15对体外培养的DC致敏的T淋巴细胞的作用研究

目的 通过与IL-2进行比较,观察IL-15激活T细胞反应,增强DC细胞疫苗抗肿瘤的免疫反应.方法 将骨髓来源的树突状细胞（BMDCs）皮下注射小鼠作为初次免疫,14d后取小鼠脾脏,制备淋巴细胞,与细胞因子（IL-2、IL-15）和BMDCs共同培养作为再次免疫,产生细胞毒T淋巴细胞（CTL）.流式细胞术检测细胞因子（IL-2或IL-15）联合BMDCs刺激小鼠淋巴细胞CD62L、CD69、CD44的表达情况;采用Cr51释放实验检测CTL对Levis肺癌细胞的杀伤作用;采用酶联免疫斑点实验（ELISPOT）检测分泌干扰素γ（IFN-γ）细胞亚群比例.结果 IL-15联合BMDCs疫苗上调CD8＋T细胞表达CD69＋、CD44＋,增强对肿瘤细胞的杀伤活性,并能产生更多的IFN-γ分泌细胞.结论 IL-15可能较IL-2更能增强DC疫苗抗肿瘤的免疫反应,为IL-15和DC疫苗的联合免疫治疗提供重要的试验依据和临床前研究的理论基础.     

BALB/c小鼠骨髓来源高产量成熟树突状细胞的制备和初步鉴定

目的研究制备、鉴定小鼠骨髓来源的高产量树突状细胞（dendritic cells,DC）的方法,为制备DC及体外研究提供依据。方法取BALB/c小鼠骨髓细胞,经重组小鼠巨噬细胞-粒细胞集落刺激因子（recombinant mouse granulocyte-macrophage colony stimulating factor,rmGM-CSF）、重组小鼠白细胞介素4（recomtinant mouse interleukin 4,rmIL-4）诱导、脂多糖（lipopolysacchrides,LPS）刺激制备高纯度DC。利用光学显微镜、扫描电镜对所制备细胞做形态学观察;流式细胞术检测特定表型标记分子表达情况;酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor alpha,TNF-α）、干扰素γ（interferon gamma,IFN-γ）的分泌量。从形态、表型标记、细胞因子分泌功能三方面对所制备细胞进行初步鉴定。结果所制备细胞具有典型的DC形态学特征,细胞表面高表达CD1a、CD11c、CD80和CD86,相对于普通DC细胞有大量的TNF-α和IFN-γ分泌。结论利用BALB/c小鼠骨髓细胞在细胞因子rmGM-CSF、rmIL-4诱导及LPS的刺激下成功制备出纯度较高的成熟DC。     

大鼠树突状细胞的体外分离、纯化、扩增及鉴定

目的 探讨诱导及纯化大鼠树突状细胞（Dendritic cells,DC）的方法，为进一步研究树突状细胞的功能、特性及临床应用提供技术方法。方法 应用重组大鼠rGM-CSF、IL－4在体外培养大鼠骨髓前体细胞获得大量DCs，经标抗大鼠OX62单抗免疫磁株分离纯化后的DCs经形态学观察、表型检测、功能学实验鉴定。结果 大鼠骨髓来源的DC在体外培养12－14d后完全成熟，99．36％培养纯化后DC表达大鼠特异性表面标志OX62；典型的成熟大鼠DC形态上类似于小鼠和人类的DC，表型为MHCⅡ＋＋，OX62＋＋，FcγR（CD32）＋／－，CD80＋／－，CD86＋＋，体外功能分析显示该DC能够强烈刺激MLR并有效递呈可溶性抗原OVA刺激初始型T细胞的增殖。结论 成功地建立了体外大量扩增大鼠骨髓DC的方法，为研究其在异种移植及诱导免疫耐受的作用打下基础。     

大鼠骨髓来源树突状细胞的分离、培养及鉴定

目的 探讨大鼠树突状细胞(dendritic cells, DC)分享、培养、鉴定的方法.方法 重组大鼠rGM-CSF、 rIL-4在体外培养大鼠骨髓前体细胞获得大量DCs, DCs经形态学观察、表型检测、功能学鉴定.结果 大鼠骨髓来源的DC在体外9d后完全成熟,90%以上培养纯化后DC表达大鼠特异性表面标志OX62,高表达MHCII、 CD80、 CD86成熟的DC具有明显刺激同种异体T细胞增殖的能力.结论 成功地建立了体外大鼠骨髓DC扩增的方法.     

CIK细胞与DC-CIK细胞抗肿瘤效应的对照研究

目的比较细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-induced killer cells,CIK）与树突状细胞（dendritic cells,DC）结合CIK细胞抗肿瘤效应。方法外周血单个核细胞诱导DC和CIK细胞,将DC与CIK共培养,以CIK细胞单独培养为对照。用MTT法测定杀伤活性,流式细胞术分析免疫表型,ELISA法测定干扰素-γ（IFN-γ）、白介素-12（IL-12）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的水平。结果 DC-CIK细胞增殖能力明显高于CIK细胞（P〈0.05）,DC-CIK细胞共培养后,CD3＋CD8＋、CD3＋CD56＋细胞比率较相同条件下CIK细胞组显著增多（P〈0.05）,共培养3 d,DC-CIK细胞上清液中IL-12、IFN-γ、TNF-α水平均比CIK细胞单独培养的水平高（P〈0.01）,DC-CIK细胞对白血病细胞与淋巴瘤细胞的杀伤率显著高于CIK细胞（P〈0.01）。结论 DC-CIK细胞比CIK细胞有更强的抗肿瘤效应。     

免疫治疗后荷瘤小鼠树突状细胞的功能评价

目的评价免疫治疗后荷瘤小鼠骨髓来源的树突状细胞（DC）体外激发T细胞增殖及分泌细胞因子的功能。方法采用腹腔注射激发型4-1BB抗体联合DC主动免疫治疗荷瘤小鼠。^3H-TdR掺入试验捡测免疫治疗后荷瘤小鼠骨髓来源DC体外激发T细胞增殖的能力。ELISA法检测DC刺激T细胞分泌IL-2、IFN-γ及IL-10的水平。结果荷瘤小鼠骨髓前体细胞产生的DC激发T细胞增殖及分泌IL-2、IFN-γ的能力下降，但经过免疫治疗后，这类DC激发T细胞增殖及分泌IL-2、IFN-γ的能力均得到改善，而且免疫治疗效果越好，改善就明显。结论荷瘤小鼠经免疫治疗后．其骨髓前体细胞来源DC的免疫功能得到改善。     

TLR7刺激对系统性红斑狼疮易感型小鼠树突状细胞免疫功能的影响

目的 研究TLR7通路对于系统性红斑狼疮易感Fas - -M RLIpr/Ipr小鼠树突状细胞免疫功能的影响.方法 从5周龄MRLIpr/Ipr小鼠骨髓提取DC体外培养,以TLR7激活剂咪喹莫特处理48h,流式细胞仪检测细胞表面分子CD80、MHCⅡ表达.ELISA法检测细胞培养上清中细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-10.结果 咪喹莫特处理后,树突状细胞表面抗原提呈相关分子MHCⅡ和CD80分子均降低,分泌的IFN-γ、TNF-α和IL-10均明显增加.结论TLR7通路调节系统性红斑狼疮易感小鼠MRLIpr/Ipr小鼠DC抗原呈递能力,具有影响免疫应答作用.     

不同浓度γ干扰素诱导大鼠脾脏来源树突状细胞表达IDO的变化及对T淋巴细胞增殖的影响

背景：DC可通过产生吲哚胺-2 ,3-双加氧酶（IDO）,抑制T淋巴细胞增殖诱导免疫耐受。因此,上调DC细胞的IDO表达可能成为诱导移植后免疫耐受的新策略。本研究的目的在于探讨不同浓度γ干扰素（IFN-γ）作用下大鼠脾脏来源的树突状细胞（DC）中吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）mRNA和蛋白表达的变化及IDO对同种异体T淋巴细胞增殖的影响。方法：应用细胞因子体外诱导培养大鼠脾脏来源DC,应用流式细胞仪测定大鼠DC特异性分子OX62和表面分子CD80、CD86的表达。分别用不同浓度（0、100、300、500U/ml）的IFN-γ诱导作用DC后,Real-time PCR测定DC中IDO mRNA的相对表达水平,Western Blot检测DC中IDO蛋白在DC中的表达水平。同种异体混合淋巴细胞反应（MLR）检测不同浓度IFN-γ诱导后的DC对同种异体T淋巴细胞增殖的影响。结果：体外诱导培养的DC光学显微镜下观察,具有典型的树枝状突起。OX62表达率达到80%以上,CD80、CD86的阳性表达也在80%左右;DC的IDO mRNA和蛋白的相对表达量随着IFN-γ作用浓度的增大逐渐增大,不同浓度组间差异有统计学意义（P<0.05）;各组IFN-γ作用后DC与对照组比较,T淋巴细胞的增殖率显著降低（P<0.05）;且随着IFN-γ作用浓度的增大T淋巴细胞的增殖率逐渐降低,各组间差异有统计学意义（P<0.05）。结论：采用改良的培养黏附法体外成功地获得了纯度较高的大鼠脾脏来源的DC;IFN-γ可以诱导大鼠脾脏来源DC表面活性IDO的表达增加,减弱脾脏DC对同种T细胞增殖的刺激能力。     

CpG ODN对不同来源树突状细胞活化的影响

目的比较CpG ODN-1826对BALB/C小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDC)和脾脏来源树突状细胞(SDC)的活化作用.方法用CpG ODN-1826体外刺激树突状细胞(DC),流式细胞术检测CD80阳性率,ELISA检测1L-12(p70)分泌水平,MTT法检测活化DC刺激T细胞增殖的能力.结果CpG ODN-1826体外可不同程度激活BMDC和SDC,诱导DC上调CD80的表达和分泌高水平IL-12,促进DC刺激T淋巴细胞增殖.CpG ODN-1826刺激的BMDC膜表面CD80表达水平明显高于SDC,其分泌IL-12的水平亦高于SDC.结论CpG ODN-1826可促进小鼠骨髓来源和脾脏来源DC的功能成熟,CpG ODN-1826刺激活化BMDC的作用明显强于刺激活化SDC.     

小鼠骨髓来源树突状细胞体外诱导培养及其不同生长状态差异性探索

目的:体外诱导扩增获取大量高纯度小鼠骨髓来源树突状细胞(dendritic cells,DC),并研究DC不同生长状态、不同培养时间的生物学特性差异.方法:重组小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(recombinant-murine granulocyte-macrophage colony-stimulating fac...     

核转录因子RelB抑制途径对骨髓树突状细胞表面分子表达的影响研究

目的 探讨核转录因子RelB抑制途径对小鼠骨髓树突状细胞(bone marrow dendritic cells)的表面分子表达的影响,为致耐受树突状细胞的研究提供新方法.方法 rmGM-CSF和rmIL-4联合诱导培养体系培养小鼠骨髓树突状细胞,免疫磁珠方法纯化;用慢病毒载体制备RelB shRNA慢病毒,与小鼠骨髓树突状细胞共培养,流式细胞术观察树突状细胞表面分子MHC-II、CD86和CD40的表达,设LPS-DC对照组、未处理组和LPSRNAi RelB DC组.结果 核转录因子RelB抑制的树突状细胞表面分子MHC-II、CD86和CD40均低水平表达,显著低于成熟Dc表面分子的表达(P<0.05),且经LPs刺激后(LPS RNAi RelB DC)DC表面上述三类分子的表达水平仍显著低于LPS-DC组(P<0.05),与未处理组(immature DC)表面分子表达水平相当.结论 核转录因子RelB抑制的骨髓树突状细胞表面分子表达水平低,呈现出致耐受的树突状细胞的特点,是致耐受树突状细胞研究的一种新方法.     

IFN-γ刺激培养未成熟树突状细胞免疫耐受效应机制研究

目的通过γ-干扰素(IFN-γ)刺激培养未成熟树突状细胞,研究在体外IFN-γ诱导未成熟树突状细胞免疫耐受的效应机制。方法采用经典的GM-CSF+IL-4诱导方案,以获得细胞表面缺乏共刺激分子的大鼠骨髓来源的未成熟树突状细胞,经IFN-γ刺激培养后,通过外源性抗原T细胞表位pCol(28-40)多肽培养,流式细胞仪检测表面MHCⅡ类分子及共刺激分子CD80、CD86,DC表面相对特异性标记OX62的情况,将脾脏分离淋巴细胞分为3组,即对照组、imDC组和imDCIFN-γ组,采用MTT法检测各组淋巴细胞增殖情况,Anneix-V-Flous检测各组淋巴细胞凋亡,ELISA法检测体外培养脾细胞上清液Th1/Th2型细胞因子,观察体外CD4+T细胞Th亚群的分化情况。结果 IFN-γ刺激培养的未成熟树突细胞通过外源性抗原T细胞表位pCol(28-40)多肽培养后低表达表面MHCⅡ类分子(14.01%)及共刺激分子CD80(4.78%)、CD86(19.79%),同样低表达DC表面相对特异性标记OX62(15.31%,P<0.05,n=4);MTT法检测共培养的脾淋巴细胞imDC组i、mDCIFN-γ组与对照组增殖...     

PA-MSHA抗肿瘤效应的免疫机制研究

 目的  研究铜绿假单胞菌甘露糖敏感血凝菌毛株(pseudomonas aeruginosa mannose sensitive hemagglutinin,PA-MSHA)处理树突状细胞(dendritic cells,DCs)后对其功能及激活T细胞杀伤肿瘤细胞效应的影响。方法  取小鼠骨髓来源的DC,观察PA-MSHA体外处理后对DC表面分子、吞噬功能及T 细胞杀伤功能的影响。结果   PA-MSHA处理的DC其表面分子CD40、I-E表达显著上升,吞噬功能显著下降,由DC诱导的活化T细胞对肿瘤细胞的杀伤效应显著高于对照组。结论  PA-MSHA能有效促进DC成熟并增强抗肿瘤免疫效应。     

TGF-β2对树突状细胞表型和功能的影响

目的: 研究转化生长因子-β2 (TGF-β2)对树突状细胞(dendritic cells, DC)表型和功能的影响. 方法: 体外培养骨髓来源的DC(BMDC)及TGF-β2诱导的DC(TGFβ2-DC). 采用双色免疫荧光化学染色或流式细胞仪(FCM)分析DC的细胞表型. 分离纯化脾脏来源的同种异体T细胞和CD4+ T细胞. 用BMDC及TGFβ2-DC刺激T细胞增殖,并用混合淋巴细胞反应(MLR)测定其能力. 在CD4+ T细胞与BMDC或TGFβ2-DC共培养5 d后,用FCM检测CD4+ T细胞表型的变化. 结果: BMDC表现为CD11c, CD86, MHC class II+和CD8а-的髓系DC. TGF-β2的诱导抑制了DC表面协同刺激分子、MHC classII的表达(P<0.01),并抑制其刺激同种异体T细胞增殖的能力. 与BMDC诱导的CD4+ T细胞相比,TGFβ2-DC诱导的CD4+ T细胞CD152(细胞毒T淋巴细胞相关分子4, CTLA-4)表达上升(P<0.01). 结论: TGF-β2的诱导促使DC表面协同刺激因子表达下降,T细胞合成CTLA-4增加,T细胞的活化和增殖受到明显抑制.     

CIK与DC细胞免疫治疗在血液肿瘤中的临床应用

细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-induced killer cells,CIK）是一种新型的免疫活性细胞,它是由白细胞介素（interleukin,IL）-2、γ-干扰素（interferon,IFN）和CD3单克隆抗体等诱导而成的对多种肿瘤细胞具有杀伤活性的细胞毒性T淋巴细胞。由于该种细胞同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子,故又称为自然杀伤（natural killer,NK）细胞样T淋巴细胞。树突状细胞（dendritic cells,DC）是目前所知抗原递呈功能最强的抗原递呈细胞（antigen presenting cell,APC）,可有效的刺激幼稚T细胞活化和诱导特异性的抗原免疫反应,从而将先天和获得性免疫有机联系在一起,是免疫反应的始动者。本文就CIK、DC及DC-CIK细胞免疫治疗在血液肿瘤中的应用进行综述。     

落新妇苷对小鼠骨髓来源树突状细胞成熟及免疫功能的抑制作用

目的：探讨落新妇苷对小鼠骨髓来源树突状细胞（dendritic cell, DC）成熟和免疫功能的影响。 方法：采用体外条件培养法得到小鼠骨髓来源未成熟树突状细胞,加入脂多糖刺激细胞成熟。落新妇苷（低浓度25 μg/mL、中浓度50 μg/mL、高浓度100 μg/mL）处理细胞后,流式细胞仪分析各组细胞凋亡,细胞表面主要组织相容性抗原复合物分子Ⅰa和共刺激分子CD40、CD80和CD86表达;异硫氰酸荧光素标记葡聚糖内吞实验分析各组DC抗原吞噬功能;酶联免疫吸附测定法检测各组DC培养液上清白细胞介素12亚单位p40（p40 subunit of interleukin-12,IL-12p40）水平;氚-胸腺嘧啶核苷掺入法检测体外混合淋巴细胞反应（mixed lymphocyte reaction, MLR）中各组DC刺激同种反应性T细胞的增殖能力,酶联免疫吸附测定法检测MLR上清IL-2、IL-4、IL-10、γ干扰素水平。 结果：各组DC凋亡率差异无统计学意义（P＞0.05）。与脂多糖组相比,高、中、低浓度落新妇苷组细胞表面主要组织相容性抗原复合物分子Ⅰa和共刺激分子表达明显降低,抗原吞噬能力明显升高,分泌IL-12p40明显减少,刺激同种反应性T细胞增殖的能力显著下降（P〈0.05）。与脂多糖组相比,高、中、低浓度落新妇苷组MLR上清中IL-2和γ干扰素水平明显降低（P〈0.05）,而IL-4、IL-10水平比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。 结论：落新妇苷（25、50、100 μg/mL）能够剂量依赖性地抑制体外培养小鼠骨髓来源DC的成熟,并对其免疫功能具有一定的负性调节作用。     

NF-KB圈套性寡核苷酸诱导骨髓DC疫苗的实验研究

目的体外诱导、培养大鼠（Lewis大鼠）骨髓来源改良树突状细胞（DC），为进一步研究核苷酸圈套技术抗移植排斥反应作准备。方法Lewis大鼠骨髓造血于细胞，体外经重组大鼠细胞因子GM-CSF、IL-4诱导成DC；核因子-kB（NF-kB）圈套寡核苷酸（NF-kB decoy ODN）用于阻止DC的成熟，降低细胞表面分子的表达，制备改良的DC；LPS用于刺激DC的成熟。流式细胞仪检测DC表面分子CD11c、CD80、CD86等的表达情况，分析DC的细胞特性。结果体外GM-CSF和IL-4诱导的大鼠骨髓来源DC纯度高、数量丰富。NF-kB decoy ODN能明显降低DC表面分子（CD11c、CD80、CD86等）的表达，表现为非成熟状态；经LPS刺激仍能保持非成熟状态。结论经NF-kB decoy ODN处理的大鼠骨髓来源DC,其状态稳定,低表达表面分子和其刺激分子,可作为进一步研究的DC疫苗。     

人慢性髓性白血病细胞系来源的树突状细胞免疫功能的体外研究

目的：探讨人慢性髓系白血病K-562来源的树突状细胞的免疫功能。方法：用细胞因子粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)及IL4在体外诱导培养K-562细胞，获得树突状细胞(DC)检测其细胞表型，并观察其诱导的细胞毒T淋巴细胞(CTL)体外抗肿瘤效应。用ELISA法测定DC培养及DC与外周血单个核细胞共培养上清液中IL-12及IFN-γ的量。结果：联合GM-CSF及IL-4可诱导K-562细胞分化为树突状细胞，K-562DC体外激活的CTL对K-562细胞具有特异性细胞毒活性；诱导DC培养上清及DC与外周血单个核细胞共培养上清测出一定量IL-12及IFN-β。结论：人慢性髓系白血病K-562来源的树突状细胞表达抗原提呈细胞表型，具有诱导CTL反应和分泌IL—12以及促进T细胞分泌IFN-γ的作用。     

1,25-二羟维生素D3处理树突状细胞在过敏性气道炎症中的作用

目的 研究1,25-二羟维生素D3对树突状细胞(dendritic cells,DC)表型和功能的影响及其处理后DC在过敏性气道炎症中的作用.方法 体外扩增小鼠骨髓来源的树突状细胞,采用流式细胞术和ELISA检测1,25-二羟维生素D3对DC表型和分泌细胞因子IL-10和IL-12的影响;观察1,25-二羟维生素D3处理DC过继卵蛋白致敏小鼠肺组织病理特点和支气管肺泡灌洗液细胞类型.结果 经1,25-二羟维生素D3处理后,DC表达CD80和MHC Ⅱ均明显降低,而CD11c变化不明显;分泌IL-10显著增加,而分泌IL-12显著降低.过继小鼠肺组织未见典型的哮喘样病理改变,支气管肺泡灌洗液细胞类型与空白对照组无显著差异.结论 1,25-二羟维生素D3可抑制DC成熟,经其处理后DC过继致敏小鼠可诱导对抗原的免疫耐受,避免过敏性气道炎症的发生.     

负载自体肿瘤抗原的树突状细胞联合细胞因子诱导的杀伤细胞在乳腺癌的临床研究

目的：探讨负载自身肿瘤裂解物的树突状细胞（DC）与细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）共培养后，对CIK体外肿瘤细胞杀伤活性的影响，进一步观察负载自身肿瘤裂解物的DC联合CIK治疗乳腺癌患者的临床免疫学疗效、毒副反应。方法：选择20例乳腺癌患者，分离外周血单个核细胞，其中贴壁细胞经GM—CSF和IL-4诱导产生DC，并负载自体肿瘤细胞裂解物；悬浮细胞经IFN-γ、IL-2、抗CD3单抗、IL-1α体外诱导产生CIK细胞。将负载抗原的DC与CIK共培养，观察CIK在体外对自身肿瘤细胞和乳腺癌细胞株SKBR-3的杀伤活性。此外，20例患者在切除原发病灶后，接受Ag—DC＋CIK细胞的过继免疫治疗，观察临床免疫疗效。结果：①CIK细胞培养后可见CD3^＋、CD8^＋和CD3^＋CD56^＋细胞较培养前显著增加；②将负载自身肿瘤抗原的DC与CIK共培养后，CIK的体外特异性和非特异性杀瘤活性明显提高；③细胞治疗后患者外周淋巴细胞Ag—NORs的IS值明显增高；CD3^＋、CD8^＋、CD56^＋升高；PBMC对自身肿瘤细胞的杀伤活性增强（P〈0．05）；④除一过性发热、畏寒外未见其它不良反应。结论：负载自体肿瘤细胞裂解物的DC疫苗联合CIK细胞在体外能明显增强对乳腺癌细胞的杀伤作用，亦能增强乳腺癌患者的细胞免疫功能，取得较理想的临床免疫疗效。