两种肠道腺病毒基因型分型方法的比较

目的研究简便快速肠道腺病毒基因型分型方法。方法采集137例非腹泻人群的粪便样本,在A549细胞中培养,提取病变细胞的基因组DNA进行PCR扩增或直接提取粪便悬液过滤上清基因组DNA进行巢式PCR扩增,对PCR阳性者进行克隆、测序以及基因型分型。结果137份样本中,两种方法均有17份样本检出腺病毒,阳性率为12．4％（17／137）。序列分析显示,两种方法检出的腺病毒型别一致。这17份样本分别属于人腺病毒5型（5份）、7型（3份）、12型（3份）及48型（6份）。结论两种方法的敏感性、特异性一样,但方法二是直接提取粪便悬液过滤上清基因组DNA进行巢式PCR扩增,无需方法一需进行3次体外细胞感染实验后从病变细胞中提取基因组DNA进行PCR扩增,节省实验的时间及成本,特别是避免体外细胞感染过程中可能出现的污染,值得推荐。     

恒河猴MyD88基因沉默siRNA腺病毒载体的构建与鉴定

目的 构建恒河猴MyD88基因沉默siRNA腺病毒载体, 观察MyD88siRNA对树突状细胞中MyD88蛋白表达的影响。方法 将合成的MyD88RNAi片段与质粒载体连接, 转化进化学感受态的大肠杆菌, 然后进行菌落PCR鉴定、阳性克隆测序及质粒的抽提;然后转染HEK293细胞, 将获得的重组腺病毒进行两轮扩增后进行纯化;用终点稀释法测定腺病毒滴度;Western blot检测MyD88siRNA对树突状细胞中MyD88蛋白表达的作用。结果 阳性克隆PCR鉴定与理论条带一致, 测序鉴定通过, 腺病毒载体转染树突状细胞, Western blot检测显示干扰组MyD88蛋白表达降低。结论 成功构建恒河猴MyD88基因沉默siRNA腺病毒载体, MyD88siRNA对恒河猴树突状细胞中的MyD88蛋白表达具有抑制作用。     

恒河猴月经血量测定

恒河猴月经血量的测定,对于恒河猴生殖生物学研究以及人类新型避孕药具临床前研究、妇科月经量改变研究的动物模型是必要的。国内尚未见此类报道。本文应用 Hallberg 碱性正铁血红素比色法,测定有规则月经周期的7只成年恒河猴(Rhesusmonkey)的月经血量。     

恒河猴与食蟹猴微卫星DNA多态性的比较分析

目的 分析恒河猴和食蟹猴群体间的遗传多样性,确立一种对恒河猴和食蟹猴种群个体的遗传鉴别方法.方法 利用聚合酶链反应 (PCR) 扩增技术采用15个多态性微卫星DNA位点对50只恒河猴和50只食蟹猴个体进行了DNA多态性的分析,对比两群体间等位基因数目差异.结果 筛选的15个具有显著多态性的微卫星DNA位点对恒河猴和食蟹猴种群可以进行DNA多态性分析,其等位基因数目均在7个以上,且两群体间有11个位点的等位基因数存在一定的差异.结论 利用这些多态性微卫星DNA位点建立一种有效鉴别恒河猴和食蟹猴种群遗传背景的方法具有一定的可行性.     

恒河猴肠胀气死亡原因诊断分析

目的对1例恒河猴肠胀气死亡原因进行诊断分析。方法检查外观，解剖尸体，确认死因，采集胀气部位样品进行细菌学分离培养鉴定。结果尸体解剖确定为肠胀气死亡。细菌培养仅得到1株细菌，该菌生长旺盛，菌落呈圆形凸起，半透明，表面光滑湿润，37℃培养18h最大菌落直径约0．8cm。三糖铁培养大量产酸产气，革兰氏染色为阴性杆菌，生化鉴定为大肠埃希氏菌，同时测定了该菌的药敏结果。结论造成恒河猴肠胀气死亡的病因为产气大肠埃希氏菌感染，最可能的原因为饲料污染。     

恒河猴婴猴离乳阶段行为观察及分析

目的了解婴猴离乳期的行为特点及规律,初步探讨婴猴早期断奶后心理和行为的变化。方法采用随意取样和时间记录法对2012年出生的290只婴猴离乳后的行为进行6个月的观察记录。结果离乳后1个月内出现团抱、吸手指、吸同伴身体3种行为,团抱、吸手指行为在第2、3月显著上升(P0.05),吸同伴身体行为在第2月显著上升(P0.05);第2个月,新增的踱步、吸生殖器的行为于第3个月显著上升(P0.05),爬跨行为随时间的延长无明显变化;第3个月新增吸脚趾行为的比例未随时间的变化而发生改变。其中,雌性同笼发生团抱的比率显著高于异性及雄性同笼(P0.05);雄性婴猴较雌性婴猴更易发生踱步行为;雄性婴猴吸手指及吸同伴身体的行为发生率显著低于雌性(P0.05);吸脚趾行为雌、雄发生率无显著差异。结论通过观察婴猴离乳后的行为,观察到团抱、踱步、吸脚趾、吸手指、吸生殖器、吸同伴身体和爬跨7种行为,且各行为均随时间的变化而递增。团抱行为反映了恐惧心理;吮吸行为代表了生理需求及防卫心理;踱步行为初期是无目的,逐渐变成焦虑心理的体现。为研究人类婴幼儿早期断奶后心理和行为的变化,开展心理学、行为学等方面的评估实验提供研究思路和模型。     

恒河猴不同年龄阶段血清中常量元素的比较分析

为进一步充实国内有关恒河猴血液生化中常量元素的实验数据 ,对不同年龄阶段恒河猴的血清中常量元素进行测定、分析 ,为以恒河猴作为实验动物的各研究领域提供参考数据而开展了此项研究。1　材料和方法1 1　实验动物　来源于中国医学科学院医学生物学研究所饲养的 3个年龄阶段的健康恒河猴 (动物合格证号 :滇动管第 2 0 0 30 0 5号 )共 6 0只 ,各年龄段 2 0只 ,均为随机挑选。1 2　 3个年龄段的划分　 2至 4岁为青少年组 ,5至 10岁为成年组 ,10岁以上为老年组。1 3　血样采集　静脉采集非麻醉状态空腹血 2ml,分离血清。1 4　样品的检测　血…     

两种麻醉方法用于恒河猴急性脑梗死模型麻醉效果的比较

目的 比较两种麻醉方法用于恒河猴急性脑梗死模型的麻醉效果。方法 选择拟行大脑中动脉M2段栓塞建立急性脑梗死模型的健康成年恒河猴16只,雄性,采用数字表法随机分为2组（n=8）：丙泊酚组（P组）、丙泊酚+右美托咪定组（PD组）。所有恒河猴采用0.1 mL/kg氯胺酮及速眠新的混合液肌内注射进行基础麻醉。待动物入睡后行气管内插管,接呼吸机行机械通气,P组麻醉维持采用持续输注丙泊酚,PD组麻醉维持采用持续输注丙泊酚及右美托咪定,两组必要时均追加上述氯胺酮与速眠新的混合液。大脑中动脉M2段栓塞模型制备结束后,停止输注麻醉维持药物,待恒河猴恢复自主呼吸,行头部磁共振成像（magnetic resonance imaging,MRI）检查。记录术中血流动力学变化、自主呼吸恢复时间、建模术中追加氯胺酮与速眠新混合液容量、丙泊酚用量、麻醉合并症发生情况。结果 16只恒河猴全部存活超过24 h。实验中16只恒河猴未发生躁动、呼吸抑制、心律失常等严重合并症。血流动力学指标、体温、动脉血气分析均在正常范围。两组不同时刻血流动力学指标、体温、动脉血气分析比较差异无统计学意义（P>0.05）。全部恒河猴均在实验结束停药后30 min内恢复自主呼吸,两组自主呼吸恢复时间比较,差异无统计学意义（P>0.05）。PD组术中丙泊酚用量、术中追加氯胺酮与速眠新混合液容量低于P组（P<0.05）。结论 两种麻醉方法用于恒河猴大脑中动脉M2段栓塞建立急性脑梗死模型麻醉效果良好,麻醉深度可控、安全性高。右美托咪定可减少建模术中丙泊酚、氯胺酮与速眠新混合液用量。     

体外培养恒河猴外周血单核巨噬细胞的研究

目的：建立一种简单、经济、高效地培养恒河猴外周血单核巨噬细胞（monocyte-derived macrophage,MDM）的方法。方法：用肝素钠抗凝管采集健康成年中国恒河猴（Macaca mulatta）全血,密度梯度离心法分离外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）。同时用无抗凝剂采血管采集同一只猴外周血,自凝后分离血清。将猴PBMCs置于CELLBIND Surface的96孔（0.8×106个细胞/孔）或48孔培养板（3×106个细胞/孔）中,用含不同百分比的猴自体血清或胎牛血清（fetal calf serum,FCS）的RPMI 1640培养液培养24h后洗弃未贴壁细胞,加入含有猴自体血清或FCS的新鲜培养基继续培养7天后观察细胞形态学。分化良好的猴单核巨噬细胞贴壁能力强,占据板底大部分区域。胞体形态多样,多数呈长梭形。用巨噬细胞标记受体（CD14）抗体染色判断细胞纯度。并用细菌内毒素（LPS）刺激分化的巨噬细胞,检测巨噬细胞炎性因子的表达。此外,用猴艾滋病毒（SIVmac17E-Br、SIVmac251）和人-猴嵌合体艾滋病毒（SHIV KU-1）感染分化良好的猴巨噬细胞,检测病毒在猴巨噬细胞中的复制。结果：在含2%猴自体血清的RPMI 1640培养条件下,大多数（>85%）猴单核细胞能在24h内贴壁,体外分化5-7天后,猴巨噬细胞纯度大于96%。相比而言,含较高浓度（4%,8%或10%）猴自体血清或FCS的RPMI 1640 培养基对猴单核细胞的贴壁和分化作用较差。分化良好的猴巨噬细胞对LPS刺激敏感,可产生多种巨噬细胞炎性因子。此外,这些细胞对SIV或SHIV均易感,产生感染性病毒。结论：含2%猴自体血清的RPMI 1640培养基适于原代猴单核细胞的贴壁和分化。该方法简单、花费少,无需生长因子,且分化效果好,是培养猴艾滋病毒及开展相关免疫学实验的重要手段。     

恒河猴和人骨骼肌肌酶组织化学和超微结构的比较

目的观察恒河猴和人骨骼肌形态学的相同性及差异性，方法应用肌活检，ＨＥ染色和电镜观察恒河猴和人骨骼肌超微结构，并通过线粒体ＡＴＰ酶和ＮＡＤＨ－ＴＲ酶细胞化学染色观察恒河猴和人骨骼肌细胞类型的差异。结果，恒河猴肌纤维直径小于人，粗细肌丝发达，与人类显著不同的是恒河猴肌纤维ＩＩ型和更为发达（９６％以上）结论恒河猴骨骼肌组织适合于作为人类基因治疗和功能性细胞移植实验的靶组织。     

实验用猕猴颈部骨骼和血管的影像学及血流动力学分析

【摘要】 目的：利用320排螺旋CT三维重建观察猕猴颈椎骨骼结构,椎动脉走形,测量椎动脉与其所经过横突孔直径大小。通过彩色多普勒超声以无创的方法获得健康实验猕猴颈部动脉的血流相关数据,为以猕猴为实验对象的基础研究提供一些有价值的颈部影像学资料。方法：选择健康实验猕猴6只,雌雄各半,年龄3－5岁,体重3.5-5kg,给予全身麻醉后行颈部CT血管扫描试验, 采用平扫及增强扫描技术,进行容积数据采集,获取正常猕猴颈部CT横断面影像。并在横断位图像中测量C6横突孔入口处左右两侧椎动脉直径、C2-C6横突孔的横径、矢状径。彩色多普勒超声对健康猕猴颈总动脉(CCA)、颈内动脉(ICA)、颈外动脉(ECA)、椎动脉(VA)的收缩期峰值血流速度（PSV）、舒张期峰值血流速度（EDV）及血管内径(D)进行分析。结果：螺旋CT三维重建显示：①猕猴椎动脉经C6横突孔入颈椎,C2横突孔出颈椎,并有钩椎关节的存在,猕猴椎动脉的走行与人极其相似;②猕猴左侧椎动脉直径为1.89?.44（mm）,右侧椎动脉直径为1.72?.39（mm）,双侧椎动脉直径比较无统计差异(P>0.05),同一节段双侧的横突孔测量指标比较无统计学差异(P>0.05)与人相似。彩色多普勒超声检测颈部血管提示：猕猴左右两侧的颈总动脉收缩期峰值血流速度（CCA-PSV）、舒张期峰值血流速度（CCA-EDV）,颈内动脉收缩期峰值血流速度（ICA-PSV）、舒张期峰值血流速度（ICA-EDV）,颈外动脉的收缩期峰值血流速度（ECA-PSV）,椎动脉收缩期峰值血流速度（VA-PSV）的差异有统计学意义。颈部左侧动脉是猕猴的优势动脉。结论：本研究获得了健康实验用猕猴颈部骨骼及血管的影像学资料,血流动力参数及血管内径的测值,为以猕猴为实验对象的科学研究提供了有价值的基础资料。     

Disease progression patterns of SHIV-KB9 in rhesus macaques of Chinese origin in comparison with Indian macaques

Objective To develop a model of SHIV-KB9/Chinese origin rhesus （Ch Rh） macaques for vaccine research and to compare the pathogenesis of SHIV-KB9 in Ch Rh macaques with that reported in Indian rhesus （Ind Rh） macaques. Methods Seven mamu-A＊01 negative Ch Rh macaques were inoculated intravenously with 1-10000 MID50 of SHIV-KB9. The monkeys were monitored for viral load, CD4, CDS, SHIV-specific antibody and virus genetic variation. The results were compared with those previously observed in Ind Rh macaques. Results As compared to that observed in Ind Rh macaques, SHIV-KB9 in Ch Rh macaques displayed three identical disease progression patterns. However, the primary pattern was not identical between the two subspecies. The level of plasma viremia differed in SHIV-KB9-infected Ch Rh macaques which exhibited different outcomes from those in Ind Rh macaques. Generally, the values of viral load and the maintenance of CD4^＋ T cells were associated with humoral responses. Otherwise, the viral genetic distances （divergence, diversity） were larger in animals （M419, M425） with their CD4^＋ T cells profoundly depleted. Conclusion The model of SHIV-KB9/Ch Rh macaques displays a relatively slow progression to AIDS compared with Ind Rh macaques, which may more accurately reflect the potential of candidate vaccines in humans.     

猴腺病毒GD株的分离与鉴定

目的体外分离出猴腺病毒(simian adenovirus,SAdV)毒株, 并对其进行鉴定,为SAdV的生物学特性、致病机制和诊断试剂等方面的研究提供基础。方法采用PCR法对猕猴粪便样本进行SAdV筛查,将PCR检测为阳性的样本处理后接种BSC-1细胞,盲传3代后用PCR扩增测序并负染色电镜观察。结果从广东地区食蟹猴粪便样本中成功分离出一株SAdV,细胞病变明显,PCR检测呈阳性,电镜下可观察到典型腺病毒样形态的病毒粒子,命名为GD株。经测序鉴定,发现GD株属HAdV-G亚属,与SAdV-1进化发生距离最近。结论GD株的分离成功,使猴腺病毒基因转移载体的构建成为可能,有助于猴腺病毒替代载体的发展。     

Simian virus 40 inhibits differentiation and maturation of rhesus macaque DC-SIGN+-dendritic cells

Dendritic cells (DC) are the initiators and modulators of the immune responses. Some species of pathogenic microorganisms have developed immune evasion strategies by controlling antigen presentation function of DC. Simian virus 40 (SV40) is a DNA tumor virus of rhesus monkey origin. It can induce cell transformation and tumorigenesis in many vertebrate species, but often causes no visible effects and persists as a latent infection in rhesus monkeys under natural conditions. To investigate the interaction between SV40 and rhesus monkey DC, rhesus monkey peripheral blood monocyte-derived DC were induced using recombinant human Interleukin-4 (rhIL-4) and infective SV40, the phenotype and function of DC-specific intracellular adhesion molecule-3 grabbing nonintegrin (DC-SIGN)(+) DC were analyzed by flow cytometry (FCM) and mixed lymphocyte reaction (MLR). Results showed that SV40 can down-regulate the expression of CD83 and CD86 on DC and impair DC-induced activation of T cell proliferation. These findings suggest that SV40 might also cause immune suppression by influencing differentiation and maturation of DC.     

安徽野生和自繁恒河猴血液生化指标的测定与分析

目的 测定人工饲养条件下安徽野生和自繁恒河猴的血液生化指标,并比较分析两种来源的恒河猴,雌、雄猴间以及感染BV阳性与阴性恒河猴生化指标的差异性。 方法 采用全自动生化分析仪对安徽野生和自繁恒河猴的14个血液生化指标进行测定,并用统计学方法比较了相同性别的野生猴与自繁猴以及感染BV阳性与阴性恒河猴血液生化值的差异性。结果 野生猴与自繁猴雄性的生化指标普遍高于雌性,野生猴碱性磷酸酶、甘油三脂和谷氨酰基转移酶雌雄间差异显著;自繁猴碱性磷酸酶、白蛋白、血清Ca、甘油三脂、肌酐和谷氨酰基转移酶雌雄间差异有显著性。除谷草转氨酶、尿素氮和血清总胆固醇外,感染BV阳性较感染BV阴性的恒河猴所得生化指标高。结论 野生猴与自繁猴,雌雄间猴以及感染BV阳性与阴性猴的血液生化指标有一定的差异性。     

恒河猴BST-2基因编码区单核苷酸多态性及其对蛋白结构和功能的影响

目的：筛查恒河猴BST-2基因编码区单核苷酸多态性（ coding-region single nucleotide polymorphism, cSNP）,研究其对蛋白结构和功能的影响。方法提取恒河猴外周血RNA,RT-PCR扩增,单克隆测序比对,确定猴BST-2的cSNP位点;通过蛋白质结构分析软件对蛋白结构进行分析;比较不同基因型猴体内SHIVSF162 p3复制水平的差异。结果序列比对发现8个非同义突变位点;经Psipred软件预测,其中G41A、T128C、C129和A333C cSNP位点可影响BST-2蛋白二级结构。在SHIVSF162 p 3感染平台期,参考基因型猴（ DLQ）病毒复制水平要高于GLQ型猴（P ＜0.05）,其他基因型猴之间无显著差异。结论 cSNP （G41A）可能影响BST-2的抗病毒功能,这为后续研究提供参考信息。     

恒河猴外周血单核巨噬细胞体外培养方法的建立

目的 建立一种简单、经济、高效的培养恒河猴外周血单核巨噬细胞(monocyte-derived macrophage,MDM)的方法。方法 用肝素钠抗凝管采集成年恒河猴(Macaca mulatta)全血,密度梯度离心法分离外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)。同时用无抗凝剂采血管采集同一只猴外周血,自凝后分离血清。将猴PBMCs置于CellBIND Surface的96孔(0.8×10⁶个细胞/孔)或48孔培养板(3×10⁶个细胞/孔)中,用含不同百分比的猴自体血清或胎牛血清(fetal calf serum,FCS)的RPMI 1640培养液培养24 h后洗弃未贴壁细胞,加入含有猴自体血清或FCS的新鲜培养基继续培养7 d后观察细胞形态学。分化良好的猴单核巨噬细胞贴壁能力强,占据板底大部分区域。胞体形态多样,多数呈长梭形。用巨噬细胞标记受体(CD14)抗体染色判断细胞纯度。并用细菌内毒素(LPS)刺激分化的巨噬细胞,检测巨噬细胞炎性因子的表达。此外,用猴艾滋病毒(SIVmac17E-Br、SIVmac251)和人-猴嵌合体艾滋病毒(SHIV KU-1)感染分化良好的猴巨噬细胞,检测病毒在猴巨噬细胞中的复制。结果 在含2%猴自体血清的RPMI 1640培养条件下,大多数(>85%)猴单核细胞能在24 h内贴壁,体外分化5～7 d后,猴巨噬细胞纯度大于96%。相比而言,含较高浓度(4%,8%或10%)猴自体血清或FCS的RPMI 1640 培养基对猴单核细胞的贴壁和分化作用较差。分化良好的猴巨噬细胞对LPS刺激敏感,可产生多种巨噬细胞炎性因子。此外,这些细胞对SIV或SHIV均易感,产生感染性病毒。结论 含2%猴自体血清的RPMI 1640培养基适于原代猴单核细胞的贴壁和分化。该方法简单、花费少,无需生长因子,且分化效果好,是培养猴艾滋病毒及开展相关免疫学实验的重要手段。     

恒河猴samhd1基因编码区多态性及其对蛋白结构和功能的影响

目的筛查恒河猴samhd1基因编码区单核苷酸多态性(coding-region single nucleotide polymorphism,cSNP),研究其对蛋白结构和功能的影响。方法提取恒河猴外周血RNA,RT-PCR扩增,测序比对,确定基因编码区变异位点;通过蛋白质结构分析软件对该蛋白结构进行分析;使用SNaPshot方法筛查138只恒河猴基因背景。结果序列比对发现5个非同义突变位点C15G(2.17%)、C320T(6.88%)、G547A(13.41%)、A552T(4.35%)、T839C(17.39%);其中除C15G外的其它四个cSNP位点均处于SAMHD1蛋白重要结构域上,且G547A、A552T、T839C三个cSNP位点改变SAMHD1蛋白二级结构,可能影响SAMHD1蛋白功能。结论恒河猴samhd1基因编码区存在三个可能影响SAMHD1蛋白功能的cSNP位点,为后续研究提供了参考信息。     

猴免疫缺陷病毒（SIVmac239）恒河猴适应株耐9-(2-磷酸甲氧丙基)腺嘌呤(PMPA)突变位点筛查

目的初步明确猴免疫缺陷病毒（SIVmac239）耐9-（2-磷酸甲氧丙基）腺嘌呤（PMPA）突变基因位点,指导SIV／恒河猴模型在药物评价中的应用。方法SlVmae239恒河猴适应株感染恒河猴,之后进行PMPA治疗,测定不同时间点血浆病毒载量和外周血CD4^＋T细胞数;使用CEMx174细胞进行药物敏感实验。单拷贝PCR测定病毒rt基因变异情况。结果PMPA治疗不能有效降低感染猴血浆病毒载量,且对血CD4^＋T细胞数没有显著影响;细胞水平药物敏感实验证实该病毒株对PMPA不敏感。序列比对发现S205L和M5021可能影响到病毒对PMPA的药物敏感性。结论本研究为SIV／恒河猴模型的合理使用及HIV-1的临床治疗提供了信息。