3种提取接触性检材脱落表皮细胞DNA方法的实验研究

目的对3种提取接触性检材脱落表皮细胞DNA的方法进行实验研究和比较,以获得最佳的方法.方法分别采用Chelex-100小体系法、磁珠法、改良磁珠法法对脱落表皮细胞的DNA进行提取,并对检测结果进行分析比较,探讨提取接触性检材脱落表皮细胞DNA的方法.结果磁珠法和改良磁珠法均能获得较高质量的细胞核DNA STR基因座分型,且后者的分型效果更好.Chelex-100小体系法的STR基因座分型效果不佳.结论磁珠法和改良磁珠法均能有效检测接触性检材脱落细胞DNA,故在法医检案中遇到接触性检材时考虑选择改良磁珠法.     

口腔粘膜脱落细胞DNA多态性分型检测在法医学应用的初步研究

目的研究各类口腔粘膜脱落细胞的微量生物性捡材中DNA提取和检验的方法,初步论证牙刷等载体作为法医物证检材的可能性。方法分别采用Chelex-100法、有机萃取法、联合抽提法三种方法提取口腔粘膜脱落细胞载体的样本DNA,进行CTTv四个STR位点单步复合扩增和两步级联扩增两种STR-PCR方式的扩增及各位点的等位基因检测。结果实验样本中,除了1例牙刷和2例牙签未能STR位点的正确分型外,其余各无关个体口腔粘膜脱落细胞载体均可以得到与标准血痕阳性相同的STR基因型。结论根据检材的PCR相对模板DNA量,选择适宜的DNA多态性检测分型方法,各类常见的含有口腔粘膜脱落细胞检材可以进行DNA检测分型,这类检材在法医检案中具有应用价值。     

接触性生物检材提取DNA方法的比较

目的 建立提取接触性生物检材DNA的新方法.方法 用PrepFiler ExpressTM法医DNA提取试剂盒提取各类接触性生物检材DNA并STR分型;将检验成功并可以重复的检材各取5份,用Chelex-100法、M48磁珠法和Chelex-100+纯化法3种方法提取接触性检材DNA,洗脱体积为50 μL,用Identifiler Plus复合扩增,并对检验结果分析比较.结果 对于接触性生物检材,采用PrepFiler ExpressTM法医DNA提取试剂盒STR分型的成功率最高,并将该方法加以实际应用.结论 PrepFiler ExpressTM法医DNA提取试剂盒是提取接触性生物检材DNA的一种新方法,可应用于法医实际案件检验.     

不同载体上人体脱落细胞富集方法的比较

目的 对不同载体上人体脱落细胞的富集方法进行比较研究.方法 选取使用过的口罩、衣服、手套, 分别采取负压吸附、粘取、剪取和擦拭4种方法富集脱落细胞.用QIAGEN QIAamp DNA Investigator Kit提取DNA, 用AB Identifiler系统进行PCR扩增, 用AB 3130 XL自动遗传分析仪进行扩增产物的电泳分离, 用Genemapper ID v3.2软件进行STR分型.结果 口罩、手套类体积小的载体, 采取负压吸附、粘取、剪取、擦拭的方法, 均能得到完整的STR分型图谱;而对于大件的衣服载体, 采用负压吸附和直接剪取明显斑迹处可得到完整的STR分型图谱.结论 对于纺织类渗透性载体, 体积较大时可采用负压吸附法富集人体脱落细胞;对于有明显斑迹的, 可直接剪取可疑斑迹进行检测;体积较小的载体, 可采用脱落细胞富集器粘取, 富集尽可能多的人体脱落细胞.     

亲子鉴定案件中21个STR基因座的突变分析

目的 观察和分析21个短串联重复序列(STR)基因座在亲子鉴定案件中的突变现象,并探讨该复合扩增分型系统在亲子鉴定中的应用价值.方法 收集2016年1月—2019年12月587例亲子鉴定案件的1628份样本,采用Chelex-100法提取样本DNA,用人类STRtyper-21G扩增荧光检测试剂盒进行PCR扩增,350...     

高温处置后人体组织DNA提取研究

目的：研究高温后人体组织DNA的提取方法对DNA-STR分型的影响。方法：用不同浓度TritonX-100处理高温后的人体组织样本,采用Chelex-100提取DNA的方法,经DNA-STR复合扩增,用ABI-3130序列分析仪电泳分离并运用Gene mapper ID V3.2基因分析软件对基因进行分型。结果：用1% TritonX-100+Chelex-100处理样本后提取DNA,再经QIA quick PCR纯化后可检出全部基因座且基因座能较平衡地扩增。结论：该方法简便易行,实验效果好,是法科学领域中一种值得推荐的方法,尤其适合检案。     

用Chelex-100方法提取肋软骨DNA105例

目的研究尸体所处环境、死亡时间的条件下,用Chelex-100方法提取肋软骨DNA。方法对案件中不同条件腐败尸体，采用Chelex-100方法提取肋软骨DNA，进行PCR扩增及STR分型。结果提取肋软骨均可获得STR分型。结论肋软骨是法医检案中的一类具有实用价值的检材。     

用差异消化二氧化硅膜纯化技术提取和纯化疑难混合斑DNA效果观察

目的:建立疑难混合斑DNA提取和纯化的新方法.方法:从日常司法鉴定检案中收集现场严重污染的疑难混合斑12份,分别采用差异消化Chelex-100法、差异消化酚/氯仿法和差异消化二氧化硅膜纯化法提取DNA,对D19S253、FGA和CSF1PO 3个STR基因座进行PCR-STR分型.结果:用差异消化Chelex-100法提取模板DNA,12份分型均失败;用差异消化酚/氯仿法提取模板DNA,5份分型成功,1份FGA和CSF1PO基因座分型成功,2份CSF1PO基因座分型成功,4份分型失败;差异消化二氧化硅膜纯化法提取的模板DNA,12份分型均成功.结论:差异消化二氧化硅膜纯化法提取DNA 可有效用于疑难混合斑的个体识别.     

Identifiler & STRtyper-10F/G系统在单亲亲子鉴定中的应用分析

目的应用AmpFISTR IdentifilerTM和STRtyper-10F/G PCR扩增试剂盒,检测195例亲子鉴定案例,分析2个系统在单亲亲子鉴定中的应用价值。方法采用Chelex-100法提取全血基因组DNA,通过IdentifilerTM和STRtyper荧光标记试剂盒对24个STR基因座进行检测,判定基因分型。结果 195例单亲亲子鉴定中,认定亲生血缘关系182例(93.33%),累计PI值大于或等于10 000,RCP>99.999 9%。排除亲生血缘关系13例(6.67%),排除STR位点数5~16范围。在IdentifilerTM检测系统中,1个案例的vWA出现一步突变,1/182(0.55%),其他基因座检测结果均符合遗传规律。结论应用Identifiler和STRtyper系统的24个STR基因座进行DNA亲权鉴定,能准确地提高亲子鉴定判断结果,有效力地避免错误判性发生。     

Y染色体短串联重复序列基因座荧光复合扩增体系的法医学应用

目的探讨Y染色体DYS456、DYS464、DYS527、DYS531、DYS709、DYS448和DYS522共7个短串联重复序列(STR)基因座(相当于11个位点)荧光复合扩增体系在法医学中的应用价值。方法提取法医学应用中生物检材的基因组DNA,复合扩增7个Y-STR基因座,然后采用毛细管电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测扩增产物。结果盲测试验结果正确;可作为"人"与"非人"的种属特异性检测工具;用同一个体不同组织所获得的分型结果一致;调查同一父系家庭的男性成员样品,未观察到变异;对强奸案混合斑的分析,可直接检出7个Y-STR基因型,协助确定嫌疑人。结论荧光复合扩增Y染色体7个STR基因座方法可靠,对混合斑和微量检材中男性DNA的分析具有较高的应用价值。     

Applied Study on Magnetic Nanometer Beads in Preparation of Genechip Samples

A protocol for enrichment and adsorption of karyocyte from whole blood by using magnetic nanometer beads as solid-phase absorbents was presented. The PCR amplification could be accomplished by using the nanobeads with karyocyte as template directly and the PCR products were applied on an oligonucleotide array to do gene typing. The HLA-A PCR amplification system and a small HLA-A oligonucleotide microarray were applied as the platform and an experiment protocol of separating karyocyte from whole blood using the magnetic nanometer beads (Fe203) were set up.The experimental conditions were also discussed. It showed that pH level of PBS eluent, Taq enzyme quantity and fragment length of products could influent the amplification results, and the magnetic nano-beads could succeed in sample preparation in microarray to provide a promising way in automatic detection and lab-on-a-chip.     

不同DNA抽提方法在乳腺癌血清循环DNA提取中的效果比较

目的:探讨不同DNA抽提方法在乳腺癌血清循环DNA提取中的效果。方法:选取86例乳腺癌患者为研究对象,比较QIAgene、OMEGA、磁珠法、酚/氯仿法对乳腺癌患者血清循环DNA的提取效果。结果:四种DNA提取方法中,磁珠法具有最高的提取效率(72.5%)和最低的CV值(23.1%)。结论:磁珠法对乳腺癌患者血清循环DNA的提取效果最好,尤其适用于小片断DNA的提取。     

16 SrRNA基因聚合酶链反应检测细菌感染的研究

目的：探索快速可靠的检测细菌感染的新方法。方法：通过自行设计合成的细菌１６ＳｒＲＮＡ基因高度保守区引物,对２０ 种标准菌株、１２ 种２７ 株临床分离的细菌株、人基因组ＤＮＡ及巨细胞病毒进行聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增。结果：对所测细菌株均获得３７１ ｂｐ 扩增产物,而与人基因组ＤＮＡ、巨细胞病毒无交叉阳性反应,ＰＣＲ最低能检测ｌｐｇ 大肠杆菌ＤＮＡ。结论：建立了用共同引物ＰＣＲ扩增以判断是否存在细菌感染的方法,该方法检测快速,敏感性和特异性高。     

高浓度EB病毒感染人永生化上皮细胞Hacat系

目的：探讨EB病毒感染上皮细胞的机制。方法：大规模培养绒猴淋巴细胞B958系，从中提取并浓缩EB病毒，用胎儿脐带血淋巴细胞滴定后，以高浓度EB病毒感染人永生化上皮细胞Hacat系，提取Hacat细胞基因组DNA，PCR扩增EB病毒基因组特异性核酸序列Bam HIw片段，Southern blotting及原位杂交验证感染结果。结果：PCR，Southernblotting及原位杂交结果证实高浓度EB病毒能够感染Hacat细胞，但是感染率非常低，结论：EBV对上皮细胞存在CR2或多聚IgA受体介导之外的未知感染途径。     

免疫微球检测金黄色葡萄球菌与链球菌研究

目的建立一种新型、快速的检测病原菌方法。方法以金属鳌舍免疫化微球、醛基免疫磁性微球和氨基免疫化磁性微球为载体，利用金黄色葡萄球菌表面A蛋白、G群链球菌表面G蛋白与IgG分子特异性结合的原理，富集检测病原菌。蛄果制备的三种免疫磁性微球每克均可在2h内至少固定60rag人IgG，经SDS—PAGE和wester Blot分析，也均能在1h内鉴定出分离得到的金黄色葡萄球菌和G群链球菌，且以醛基化免疫磁性微球检测效果最好。结论以免疫微球检测金黄色葡萄球菌和链球菌操作稳定性，成本低，有望在临床检验以及微生物检测等方面得到广泛应用。     

PCR技术应用于临床结核病的诊断研究

采用PCR(聚合酶链反应)技术,选择一对寡核苷酸引物,扩增的靶基因为克隆的PH_重组标准人型结核分枝杆菌2.4kb DNA。其基因片段是结核杆菌所特有,单一拷贝基因,与其他非典型分枝杆菌的基因无同源序列。研究结果表明:①扩增了人型和牛型结核杆菌标准株基因DNA 158bp 片段,而其他14种非典型分枝杆菌和金黄色葡萄球菌、脓杆菌 DNA 未扩增出相应产物.②10倍系列稀释人型结核菌 DNA,检测敏感性相当于10～50菌数/ml痰样。③60例临床肺结核病人痰样进行 PCR 技术检测和常规生物法测定比较,前者阳性率为58.3%,后者检测率11.70%。而20例非结核痰样用两种方法检测全为阴性。提示:PCR 技术诊断结核病快速、简易、特异、敏感、高效,是在基因水平上检测的一种新技术。     

一种新型结核分枝杆菌检测方法的研究

目的 探讨利用荧光量子点(QDs)开发新一代结核分枝杆菌的检测方法.方法 采用特异性多克隆抗体偶联到磁珠上用于结核杆菌的分离和富集,然后用标记QDs的链霉亲和素检测结合生物素标记的肝素血凝素(HBHA)单克隆抗体的结核杆菌.采用牛结核分枝杆菌和结核分枝杆菌作为阳性样品,以大肠杆菌和沙门氏菌作为阴性对照,以评估该方法的可行性.结果 用抗酸染色能检测到磁珠分离和富集的结核杆菌,直接观察没有发现阴性对照有荧光,但阳性对照可以观察到荧光.直接观察法的检测限为104细菌/mL.当采用荧光光度计检测样品时,其检测限可以达到103细菌/mL.结论 该方法能适用于包括结核分枝杆菌病原体的检测,是一种具有前景的病原体的检测方法.     

磁珠法半自动提取全血基因组DNA条件的优化

目的:探讨磁珠法提取基因组DNA的影响因素,建立快速、高效、批量提取全血基因组DNA的优化方案。方法:使用磁珠法核酸自动提取系统从全血中提取基因组DNA,紫外分光光度计测定DNA浓度和纯度。采用正交试验设计分析裂解时间、全血量、磁珠量和乙醇浓度4个因素的主效应和全血量与裂解时间、磁珠量,裂解时间与磁珠量的二阶交互作用对所提取DNA浓度和纯度的影响。结果:裂解时间、全血量、磁珠量和乙醇浓度4个主效应对DNA浓度的影响均存在统计学差异(P<0.05),当裂解时间为15 min,全血量为100μl,磁珠量为80μl,乙醇浓度为80%时,DNA平均浓度最高。磁珠量、裂解时间和全血量的交互作用对DNA OD260/OD280的比值有影响(P=0.008和P=0.013)。当磁珠量为40μl,裂解时间为15 min,全血量为100μl时,OD260/OD280的比值较好。磁珠量和乙醇浓度影响DNA OD260/OD230的比值(P=0.017和P<0.05),磁珠量为40μl,乙醇浓度为80%时,OD260/OD230的比值更好。结论:当DNA得率优先考虑时,可以选择裂解时间15 min、全血量100μl、磁珠量80μl、乙醇浓度80%的提取条件;而对DNA纯度要求较高时,可以将磁珠量改为40μl,以获得最优DNA提取效果。     

鸭乙型肝炎病毒核酸荧光定量PCR方法的建立及应用

目的：建立鸭乙型肝炎病毒核酸(DHBV DNA)荧光定量的方法。方法：根据DHBV DNAS基因区的序列设计扩增所需3条引物，通过偶联反应用AmpliSensor荧光信号标记半巢式引物，经过前期不对称扩增、半巢式扩增及在线检测建立DHBV DNA阳性标准品QPCR的标准曲线，并将70份鸭血清分别用荧光定量PCR方法和地高辛标记的DHBV DNA探针斑点杂交的方法检测，比较结果的相关性。结果：DHBV DNA阳性标准品经过30次循环后，扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测，可以看出有180bp、70bp两个片段，与设计的片段大小相符，扩增产物的浓度与标准品的起始浓度成正比，扩增指数的数值大小与该循环时己合成的扩增产物的量成正比，起始浓度的大小与要合成的一定扩增产物的量所需的循环次数成反比。用荧定量PCR方法和斑点杂交的方法检测血清中DHBV DNA的结果有良好的相关性(r＝0．97，P＜0.01，ν＝58)。结论：荧光定量PCR方法可作为检测DHBV DNA含量的一个重要手段。     

TRIzol法与磁珠法用于丙型肝炎病毒RNA定量检测的比较

目的 比较TRIzol法与磁珠法对丙型肝炎病毒(HCV) RNA定量检测结果的影响.方法 收集117例丙型肝炎病毒感染阳性患者的血清及其基因分型信息.分别采用TRIzol法与磁珠法提取患者血清样本的HCVRNA,qPCR检测提取HCV RNA的病毒载量,分析两种提取方法所得HCV RNA检测结果的差异.结果 qPCR结果显示TRIzol法和磁珠法具有良好的线性相关性:y=0.978x+0.063(R2 =0.973).Bland-Altman统计分析显示TRIzol法提取的HCV RNA病毒载量对数值的平均值略低于磁珠法,但差异无统计学意义(P＞0.05).基因型分析结果显示1a、1b、2a、3a和6a基因型中两种提取方法差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 TRIzol法提取HCV RNA的定量检测结果和磁珠法相当,且成本低廉,可在国内广泛用于试剂盒的开发和HCV RNA临床检测.