NT4-Al融合基因原核表达载体的构建

目的构建神经营养素（NT4）与肿瘤血管抑制肽Alphastatin融合基因的原核表达载体pBV220-NT4-Al。方法采用非对称互补引物（模板）法,依据GenBank提供的Alphastatin基因序列,设计合成并扩增出肿瘤血管抑制肽Alphastatin的cDNA;将其连接到NT4的信号肽和前导序列3’端,组成融合基因NT4-Al,再将该融合基因亚克隆于表达载体pBV220,构建pBV220-NT4-Al。结果经DNA测序、限制性内切酶酶切等方法证实Alphastatin成功重组到NT4信号肽和前导序列3’端,并将融合基因亚克隆于pBV220内。结论成功构建原核表达载体pBV220-NT4-Al,为进一步研究肿瘤基因治疗奠定了基础。     

NT4-A1融合基因原核表达载体的构建

目的 构建神经营养素(NT4)与肿瘤血管抑制肽Alphastatin融合基因的原核表达载体pBV220-NT4-A1.方法 采用非对称互补引物(模板)法,依据GenBank提供的Alphastatin基因序列,设计合成并扩增出肿瘤血管抑制肽Alphastatin的cDNA:将其连接到NT4的信号肽和前导序列3'端,组成融合基因NT4-A1,再将该融合基因亚克隆于表达载体pBV220,构建pBV220-NT4-A1.结果 经DNA测序、限制性内切酶酶切等方法 证实Alphastatin成功重组到NT4信号肽和前导序列3'端,并将融合基因亚克隆于pBV220内.结论 成功构建原核表达载体pBV220-NT4-A1,为进一步研究肿瘤基因治疗奠定了基础.     

靶向人血管紧张素原小干扰RNA表达质粒的构建和鉴定

背景：RNA干扰技术通过将具有一定结构特点、长19~25 bp的双链小干扰RNA导入哺乳动物细胞,特异性降解与其序列具有同源性的mRNA分子,导致目的基因表达抑制。 目的：拟构建针对人血管紧张素原mRNA的小干扰RNA表达载体,从而抑制肾素基因在脂肪细胞的表达。 方法：从NCBI中查找人血管紧张素原基因全长mRNA序列(NM000029),利用GeneScript公司提供的在线小干扰RNA模板序列设计软件,自行设计靶向血管紧张素原的两条shRNA的DNA模板单链,合成靶向血管紧张素原基因转录可形成茎环结构的寡聚核苷酸,退火后与酶切后的psiRNAT-U6.1/Neo质粒连接,在TOP10菌株中扩增,并测序鉴定。 结果与结论：将含有血管紧张素原-mRNA目标序列19 bp的双链DNA插入片段,连接到pRNAT-U6.1/Neo质粒形成重组质粒。EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切后,空载体得到351 bp小片段,而人重组质粒得到397 bp小片段,与预期相符。EcoRⅠ和Kpn Ⅰ双酶切后,空载体得到1条345 bp小片段,而人重组载体没有得到小片段条带,与预期相符。测序结果表明psiRNAT-U6.1/Neo质粒已经插入人脂肪细胞的干扰合成片段,无碱基突变,成功构建了靶向血管紧张素原-小干扰RNA表达载体。     

人骨形态发生蛋白4成熟肽cDNA的克隆及测序

背景：研究表明骨形态发生蛋白4的骨诱导能力最强，但在组织中含量甚微。 目的：克隆人骨形态发生蛋白4成熟肽基因。 方法：从人胎盘组织中提取信使核糖核酸，根据基因库人骨形态发生蛋白4基因序列合成两条引物，利用一步法反转录聚合酶链式反应技术扩增出人骨形态发生蛋白4成熟肽的基因序列，将聚合酶链反应扩增产物基因片段连接克隆载体质粒中转化大肠杆菌DH5α进行克隆筛选鉴定及测序。 结果与结论：琼脂糖凝胶电泳检测反转录聚合酶链式反应产物及阳性克隆质粒经双酶切产物显示一长约370 bp的条带，脱氧核糖核酸测序结果与基因库中的序列相符。结果证实，利用反转录聚合酶链式反应技术可成功的从人胎盘组织中克隆出人骨形态发生蛋白4成熟肽基因。     

dystrophin基因常见易缺失外显子片段的克隆

背景：既往研究显示,dystrophin基因缺失集中在两个热点区域即外显子2~20和44~53,其主要缺失可以通过对一系列外显子的检测来发现。DNA微阵列可以将许多基因或基因的许多片段同时进行检测,为检测dystrophin基因缺失提供了一项新技术。 目的：对dystrophin基因18个常见易缺失外显子片段进行克隆、鉴定,以克隆产物作为核苷酸探针为研制dystrophin基因缺失检测微阵列作准备。 设计、时间及地点：分子生物学观察实验,于2002年在第四军医大学附属西京医院神经内科完成。 材料：细菌菌株E.coli JM109由全军基因诊断技术研究所保存,质粒载体pGEM®-T Easy Vector购自美国Promega公司,18对寡核苷酸引物由上海生物工程公司合成。 方法：以人类基因组DNA为模板,应用18对引物对dystrophin基因常见易缺失外显子片段进行PCR扩增。将扩增产物与pGEM-T Easy载体连接,转化E.coli JM109感受态细胞。通过平板培养,挑选阳性克隆。提取重组质粒,Not I酶切,获得完整的探针片段,并作测序鉴定。通过核酸序列数据库相似性检索工具验证序列的来源及其与GeneBank收录序列的相似性。 主要观察指标：①dystrophin基因外显子片段的PCR扩增。②扩增片段与pGEM-T Easy载体连接构成重组质粒并克隆。③重组质粒的Not I酶切及测序鉴定。④克隆片段的序列分析及同源性检索。 结果：PCR扩增出18个片段,与dystrophin基因预期扩增片段大小相一致。重组克隆质粒的酶切产物与PCR产物大小相近,与预期相一致。经测序获得18个克隆片段全序列,其核苷酸数量与预期基本一致,序列相似性检索分析证实了这些克隆片段与GeneBank收录的dystrophin基因片段具有极高的同源性。 结论：克隆产物确为dystrophin基因常见易缺失外显子片段。     

构建人csp-B核基质结合区克隆及其介导的反转录载体

背景：核基质结合区是染色质被限制酶消化后仍附着在核基质上的DNA序列。大量实验表明，核基质结合区可以作为DNA复制的起始点或调控基因的转录，构建核基质结合区表达载体能提高外源基因表达水平，增强外源基因表达的稳定性及提高转化细胞稳定株的频率等。 目的：通过克隆人基因组不同的核基质结合区片段，构建核基质结合区介导的包含氯霉素乙酰转移酶(CAT)报告基因的反转录病毒载体pLXSN-MAR，以探索核基质结合区对基因表达的影响。 方法：开放性实验于2007-01/12在新乡医学院生物化学与分子生物学实验室及分子研究室完成。自行构建含氯霉素乙酰转移酶报告基因的质粒PLXSN-CAT载体。TaqDNA聚合酶、T4 DNA连接酶、DNA Marker、限制性内切酶BamHⅠ、凝胶纯化试剂盒、质粒提取试剂盒均购于大连 TaKaRa公司；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。以人基因组DNA为模板，采用聚合酶链反应扩增csp-B 核基质结合区序列，克隆入反转录载体PLXSN-CAT中，经限制性内切酶酶切及DNA序列分析鉴定目的基因。 结果与结论：聚合酶链反应扩增的特异性片段长度为931 bp，以此构建的重组质粒命名为PLXSN-CAT-MAR，经BamHⅠ酶切后显示5.9 kb和931 bp左右的两条片段，测序结果与Gen-bank中的人csp-B 核基质结合区(Genbank序列号M62716)序列一致，证明人核基质结合区片段已成功克隆到了反转录载体PLXSN-CAT中。提示成功构建了PLXSN-CAT-MAR反转录表达载体。     

BDNF基因重组逆转录病毒表达载体pLEGFP-BDNF的构建与鉴定

目的构建脑源性神经营养因子(BDNF)基因重组逆转录病毒表达载体。方法根据 BDNF基因已知序列,设计合成一对引物并导入HindⅢ和BamH Ⅰ酶切位点;从大鼠海马组织提取总 RNA,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)获得编码BDNF的基因片段,与克隆载体pMD 18-T Simple连接构建pMDT-BDNF质粒;经HindⅢ、BamHⅠ双酶切,获得BDNF基因片断再克隆至逆转录病毒载体 pLEGFP-N1中构建重组质粒pLEGFP-BDNF。结果限制性内切酶酶切分析和PCR法鉴定表明为正确重组子,测序结果证实与已知序列吻合。结论构建的重组逆转录病毒表达载体 pLEGFP-BDNF含有序列正确的大鼠BDNF基因,可以作为今后治疗老年性痴呆动物模型转基因实验的基因来源。     

人β-神经生长因子前体基因的克隆及序列分析

目的 对人β-NGF前体基因的克隆及序列分析，为其在真核细胞中表达并获得具有神经生长因子活性的蛋白及临床应用打下基础。方法 从人血白细胞中提取基因组DNA，采用PCR技术，扩增出含前导肽及信号肽的β-NGF前体基因并与PUC18载体连接，经筛选得到重组质粒PUC18-β-NGF，经酶切及序列分析进行鉴定。结果 经序列测定与Genebank中已知序列(V01511)相比较，完全一致。结论 从人白细胞DNA中获得了人β-NGF前体基因，为神经生长因子的基因治疗提供了条件。     

中国人胶质细胞源神经营养因子基因的克隆及测序

目的 为了克隆中国人胶质细胞源神经营养因子（GDNF）基因，从而为开发重组人GDNF治疗神经变性疾病打下基础。方法 根据从GeneBank中调出的人GDNF基因全序列设计引物，以中国人外周血白细胞提取的基因组DNA为模板，通过PCR扩增出中国人GDNF基因片段，克隆到pGEM-T载体上，进行序列分析。结果 我们得到的一种425bp DNA片段。经与GeneBank中已注册的GDNF基因片段，克隆到pGEM-T载体上，进行序列分析。结果 我们得到的一种425bp DNA片段。经与GenBank中已注册的人GDNF基因比较，序列完全相同。结论 正确的中国人的GDNF基因已克隆成功。     

分化型胚胎软骨发育基因1特异性小干扰RNA表达质粒的构建和鉴定

背景：分化型胚胎软骨基因1可调控肿瘤生长、凋亡、衰老相关因子，与肿瘤的发生发展有着重要的联系。 目的：构建针对人分化型胚胎软骨基因1的小干扰RNA表达载体。 方法：从NCBI中查找人分化型胚胎软骨基因1基因全长mRNA序列，利用Katahdin提供的在线小干扰 RNA模板序列设计软件，设计针对分化型胚胎软骨基因1的2条shRNA 的 DNA 模板单链，合成靶向分化型胚胎软骨基因1基因转录可形成茎环结构的寡聚核苷酸，退火后与酶切后的pGreenPuro™ shRNA Cloning and Expression Lentivector质粒连接，在JM-109菌株中扩增，并进行质粒DNA琼脂糖凝胶电泳分析、紫外分光光度计检测、菌落PCR以及测序鉴定。 结果与结论：将含有分化型胚胎软骨基因1目标序列25 bp 的双链 DNA插入片段，连接到pGreenPuro™ shRNA Cloning and Expression Lentivector质粒形成重组质粒。质粒DNA琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计分析结果确认所提质粒纯度较高，可用于后续实验。菌落PCR结果表明产物大小约为170 bp，与预期相符。测序结果表明pGreenPuro™ shRNA Cloning and Expression Lentivector质粒已经插入人分化型胚胎软骨基因1的干扰合成片段，无碱基突变。成功构建了靶向分化型胚胎软骨基因1-小干扰 RNA表达载体。     

空肠弯曲菌cdtA、cdtB、cdtC基因的克隆、序列分析及B细胞表位预测

目的预测和分析空肠弯曲菌(CJ)细胞扩张毒素(CDT)cdtA、cdtB、cdtC蛋白的二级结构和B细胞抗原表位,为CJ疫苗研制提供基础资料。方法 PCR扩增cdtA、cdtB、cdtC基因,克隆入pGEM-T载体并测序,对重组质粒测序后进行生物信息学分析。以cdtA、cdtB、cdtC基因推导的氨基酸序列为基础,采用Chou-Fasman法、Ganmier-Robson法和Karplus-Schulz法预测该蛋白二级结构;按Kyte-Doolittle方案、Emini方案和JamesonWolf方案预测其B细胞抗原表位。结果克隆的cdtA、cdtB、cdtC基因全长分别为874bp、913bp、711bp。发现cdtA的840-32bp序列完全与标准株NCTC11168的1-807bp序列一致,cdtB的841-42bp序列完全与标准株NCTC11168的1-798bp序列一致,cdtC的667-96bp序列完全与标准株NCTC11168的1-570bp序列一致。cdtA第11～44和54～90区段,cdtB第5～70、78～112、137～187区段,cdtC第119～140和145～193区段及其附近可能是CJ-cdtA、cdtB、cdtC蛋白的B细胞表位优势区。结论成功扩增空肠弯曲菌O∶19菌株cdtA、cdtB、cdtC基因,测序表明与标准株序列高度同源,已有文献证明cdtA、cdtB、cdtC基因在不同CJ菌株中高度保守,符合疫苗候选抗原的基本特征;预测出cdtA、cdtB、cdtC蛋白的B细胞抗原表位优势区,这将为CJ新型疫苗的设计和单克隆抗体的筛选等方面的研究提供重要信息。     

脑脓肿相关新基因RBAG2-3的电子克隆及其功能预测

目的研究脑脓肿形成和发展过程中所涉及的新分子。方法对应用mRNA荧光差异显示技术(DD-PCR)获得的脑脓肿早期差异表达cDNA片段G2-3进行电子克隆,根据电子克隆的结果设计引物进行逆转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)、克隆及测序,验证电子克隆的准确性,并利用生物信息学技术对电子克隆产物进行功能预测。结果G2-3经电子克隆获得长度为1157bp的新基因RBAG2-3,Genbank登陆号为CN382815。结构功能分析显示RBAG2-3编码73个氨基酸残基的蛋白,存在多个功能作用位点,并具有PSI和H-NS结构功能域。结论经电子克隆获得新基因RBAG2-3,其编码蛋白具有多个功能作用位点,并具有能对神经上皮组织基因表达起作用的结构功能域,可能在脑脓肿的发病中起重要作用。     

人SNCA及其致病突变基因的逆转录病毒pEGZ／MCS HA载体的构建

目的:克隆人野生型SNCA基因,构建野生型SNCA基因及其致病突变Ala30Pro、Ala53Thr的逆转录病毒表达载体。方法:通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法从人胎脑扩增SNCA基因,T-A克隆后测序。在此基础上利用单核苷酸差异引物定点诱变法构建其致病突变Ala30Pro、Ala53Thr的SNCA基因的逆转录病毒载体,并用这些重组逆转录病毒载体转染宿主细胞。结果:PCR、酶切及测序证明逆转录病毒表达载体构建成功。目的基因序列在宿主细胞成功表达。结论:人野生型SNCA基因及其Ala30Pro、Ala53Thr突变基因的重组逆转录病毒pEGZ/MCSHA载体的成功构建,为进一步构建表达野生型及Ala30Pro、Ala53Thr突变型SNCA的PD细胞模型奠定基础。     

人野生型parkin基因真核表达载体的构建及其在PC12细胞中的表达

目的 克隆人野生型parkin基因并构建真核表达载体pCDNA3．1—parkin，将重组质粒转染PC12细胞获得高表达人野生型parkin基因的PC12细胞克隆。方法 从胎脑组织中提取总RNA，用RT—PCR方法获得人野生型parkin基因的全长cDNA，插入pCR2．1—TA克隆载体中进行序列测定，测序正确后将其亚克隆至表达载体pCD—NA3．1，利用脂质体将重组质粒转染PC12细胞，经G418筛选获得抗性细胞克隆，采用RT—PCR和Western Blot方法鉴定人野生型parkin基因在PC12细胞中的过表达。结果 经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定证实目的基因已插入重组质粒，RT—PCR和Western Blot证明经G418筛选得到的转基因PC12细胞克隆中存在人野生型parkin基因的表达。结论 成功构建了人野生型parkin基因的真核表达载体，获得了稳定表达人野生型parkin基因的PC12细胞克隆，为进一步研究parkin的生物学功能以及parkin在帕金森病发病机制中的作用奠定了良好的基础。     

构建胶质原纤维酸性蛋白原核表达载体及蛋白表达鉴定

背景：胶质原纤维酸性蛋白在神经损伤的发生发展过程中具有重要作用。 目的：对胶质纤维酸性蛋白进行基因克隆,构建原核表达质粒并加以鉴定。 设计、时间及地点：单一样本观察,于2008-09/11在上海市长征医院神经外科实验室完成。 材料：中间载体pGEM-T Easy质粒购于Promega 公司,原核表达质粒pGEX-4T-2由上海市长征医院神经外科实验室保存。 方法：从人脑胶质瘤组织提取mRNA, 采用反转录-聚合酶链反应的方法扩增胶质纤维酸性蛋白序列并表达,然后与载体pGEX-4T-2连接,转化宿主菌BL21构建重组质粒,诱导表达后纯化,Western-blot鉴定。 主要观察指标：总RNA鉴定结果,聚合酶链反应扩增产物分子质量的鉴定,重组表达载体的酶切鉴定,Western-blot鉴定。 结果：抽提肿瘤组织总RNA后,电泳清晰可见rRNA28S、18S、5S 3条带。且总RNA的A260nm/A280 nm值为1.903。聚合酶链反应结果显示,在约1 300 bp左右有一条特异性条带,与预期的胶质原纤维酸性蛋白基因大小一致。重组表达载体的酶切鉴定及测序结果与GenBank的胶质原纤维酸性蛋白序列一致,经Western-blot验证为目的蛋白。 结论：用双酶切、DNA测序与Western-blot的方法证实原核表达载体构建成功。     

保守性多巴胺能神经营养因子重组杆状病毒转移载体的构建及鉴定

目的 构建并鉴定小鼠保守性多巴胺能神经营养因子(mCDNF)重组杆状病毒转移载体pFastBacHTb-mCDNF. 方法 应用Trizol法提取小鼠组织总RNA,反转成cDNA,经PCR扩增得到带有预定酶切位点(BamH Ⅰ、Xho Ⅰ)的mCDNF基因全长(564 bp),回收片段并克隆至pGEM-T载体,测序验证PCR结果的准确性.将mCDNF定向克隆到pFastBacHTb载体,构建含有mCDNF基因的重组质粒pFastBacHTb-mCDNF,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆,摇菌抽取质粒进行测序和双酶切鉴定. 结果 RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳显示得到预定大小的目的 条带(564 bp),mCDNF的T-A克隆经蓝白斑抗性筛选获得阳性克隆,PCR及测序均提示pGEM-T-CDNF载体成功构建.重组质粒pGEM-T-mCDNF和pFastBacHTb载体进行BamH Ⅰ、Xho Ⅰ限制性内切酶酶切后再连接,得到pFastBacHTb-mCDNF重组质粒,并经PCR、酶切及测序验证无误. 结论 本实验成功构建了mCDNF重组杆状病毒转移载体pFastBacHTb-mCDNF,为该营养因子的进一步研究奠定了一定基础.     

人神经营养素—3全长基因克隆

本文从ＰＣＲ技术入手，以人基因组ＤＮＡ为模板扩增出人神经营养素－３（ｈｕｍａｎｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ－３，ｈＮＴ－３）全长基因，并对克隆至ｐＵＣ１８质粒中的ｈＮＴ－３基因做了全序列分析，序列分析结果表明，除ｈＮＴ－３中第１３０位编码ｐｒｅｐｒｏ－序列－９５位Ｌｅｕ密码子的第一个碱基外（Ｃ→Ｔ）其余序列同文献报道完全一致，改变的碱基并不影响其编码的氨基酸序列。     

Rapid isolation of tissue-specific and developmentally regulated brain cDNAs using RNA arbitrarily primed PCR (RAP-PCR)

RNA arbitrarily primed PCR (RAP-PCR) was used to isolate cDNAs that represent developmentally regulated brain-specific genes. Five clones with a restricted pattern of expression were identified and sequenced. Four cDNAs had no obvious homology to the sequences in GenBank. One clone had over 95% homology to a Ca²⁺/calmodulin-insensitive adenylyl cyclase, a recently cloned gene that was isolated from rat brain and was shown to be expressed only in adult brain and lung. Two novel cDNAs were investigated further by Northern blot analysis and were found to be expressed differentially during development; their expression was confined to the forebrain in the adult mouse. Further characterization byin situ hybridization showed that the mRNA corresponding to one clone was localized to a limited number of differentiating functional structures in the developing nervous system. In the adult brain, this message is confined to the forebrain with the highest level of expression in the cortex. These data suggest that the product of this gene is involved in the establishment of neuronal networks during brain development and in synaptic plasticity in the mature cortex. This work demonstrates that RAP-PCR is a powerful method for the simultaneous detection of differences between multiple RNA populations and, as such, can be used to study differential gene expression in the brain.     

p62dok—PTB结构域样新基因片段的克隆

利用ＲＴ－ＰＣＲ方法,从胎儿脾脏和肝脏组织中克隆出一个３４２ｂｐ的基因片段,并测定了其核苷酸序列。在基因库中未见相同序列报道,但该片段与ｐ６２ｄｏｋ－ＰＴＢ结构域苷酸序列有９３％的同源性,提示它是一种新的ｐ６２ｄｏｋ－ＰＴＢ域样基因片段。