牵张性脊髓损伤后神经细胞中Caspase-3表达及其作用的实验研究

目的:观察大鼠牵张性脊髓损伤后脊髓神经细胞中半胱氨酸天冬氨酶3(Caspase-3)的表达及其在神经细胞凋亡中的作用。方法:大鼠脊髓T13~L2经牵张损伤,皮层体感诱发电位监测P1-N1波幅下降至术前波幅70%后维持10m in,分别于术后6h、1、4、7、14、21d处死取材。采用流式细胞仪、原位末端脱氧核苷酸转移酶介导的生物素脱氧尿嘧啶核苷酸缺口末端标记法(TUNEL法)、免疫组织化学检测等方法观察大鼠脊髓神经细胞中Caspase-3表达变化及神经细胞凋亡情况,测定Caspase-3活性。结果:脊髓损伤后神经细胞凋亡率、TUNEL阳性细胞数、Caspase-3免疫组织化学阳性表达及Caspase-3活性测定均较空白对照组及椎板切除组显著升高(P<0.05或0.01),前三项指标改变趋势大致相同,均为术后7d达高峰,而Caspase-3活性则术后4d达高峰。结论:大鼠牵张性脊髓损伤后神经细胞中Caspase-3表达增高、Caspase-3活性增强,是检测神经细胞凋亡的早期生物学指标,对认识脊髓损伤机制具有一定的意义。     

二甲胺四环素对大鼠脊髓损伤后Caspase-3表达及细胞凋亡的影响

[目的]探讨大鼠脊髓损伤后应用二甲胺四环素（minocyc line）对Caspase-3表达及细胞凋亡的影响。[方法]成年大鼠脊髓损伤后应用二甲胺四环素的治疗组（A组）和应用生理盐水对照组（B组），于损伤后不同时点取材，用HE染色观察损伤脊髓组织病理变化，用免疫组化染色检测Caspase-3表达阳性细胞，原位末端标记法（TUNEL法）标记凋亡细胞。[结果]HE染色镜检发现脊髓组织病理学改变A组明显轻于B组。A、B两组均发现凋亡细胞及Caspase-3表达，神经细胞凋亡指数及Caspase-3表达均B组〉A组（P〈0．01）。[结论]二甲胺四环素能抑制大鼠脊髓损伤后Caspase-3表达及细胞凋亡。     

Observation and establishment of an animal model of tractive spinal cord injury in rats

TDepartmentofOrthopaedics,WestChinaHospital,SichuanUniversity,Chengdu 6 10 0 4 1,China (LiuL ,ChiLT ,TuZQ ,ShengB ,ZhouZKandPeiFX)*Correspondingauthor :Tel:86 2 8 85 4 2 2 4 2 8,E mail:PeiFuxing @16 3.comractivespinalcordinjuryisoneofthecommoncomplicationsofspinalorthomorphia .WiththeappilcationofthreedimensionalinstrumentssuchasCD (cotreldubousse) ,TSRH (TexasScottishRiteHospital)etc .andmonitoringofevokedpotentialduringoperation ,1therangeofoperativeaccommodationsenlargescorr…     

碱性成纤维细胞生长因子对大鼠牵张性脊髓损伤后细胞凋亡及基因表达的影响

目的观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对牵张性脊髓损伤后细胞凋亡及相关基因表达的影响,探讨bFGF对脊髓损伤保护作用的分子机制。方法大鼠脊髓T13～L2经牵张损伤,皮层体感诱发电位(CSEP)监测P1～N1波幅下降至术前波幅70%后,于损伤平面以下经蛛网膜下腔置细导管,治疗组分别于术后即刻1、2、3、4、8、12及24h经细导管注入bFGF溶液20μl(含bFGF20μg),对照组在相同时间注入等量生理盐水,然后于术后6h、1、4、7、14及21d处死取材,采用原位末端标记法(TUNEL)及免疫组织化学观察脊髓细胞凋亡及p53、bax、bcl2表达的变化情况,应用电生理观察大鼠的神经功能情况,并进行对比分析。结果术后4、7、14、21d,治疗组TUNEL法染色阳性细胞数明显低于对照组(P<0.01)。术后4、7、14、21d,治疗组p53、bax的阳性细胞数明显低于对照组,治疗组各时相点bcl2的阳性细胞数明显高于对照组,治疗组大鼠的神经功能恢复与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)。结论bFGF能通过抑制p53、bax蛋白的表达及促进bcl2蛋白表达来抑制牵张性脊髓损伤后细胞凋亡,从而保护损伤的脊髓组织,这可能是bFGF对脊髓损伤具有的保护作用机制之一。     

继发性脊髓损伤的细胞凋亡研究现状

细胞凋亡，又称程序性细胞死亡，在继发性脊髓损伤过程中起着关键作用。本文对继发性脊髓损伤细胞凋亡的作用、诱导因素和防治途径作一综述。     

神经毒素在脊髓损伤中的作用

目的 探讨神经毒素兴奋性氨基酸（ＥＡＡ）和神经肽在脊髓损伤的作用。方法 应用高效液相色谱法检测脊髓损伤后伤段组织中谷氨酸（Ｇｌｕ）天门冬氨酸（Ａｓｐ）两种ＥＡＡ的含量变化；应用放射免疫分析技术测定脊髓损伤段组织中神经肽之一强腓肽ＤｙｎＡ１－１３含量的变化；观察了蛛网膜下腔注射Ｇｌｕ，ＤｙａｎＡ１－１３兴奋性氨基酸受体拮抗剂３－（２－羧基哌嗪）丙基－１－磷酸（ＣＰＰ），ＤｙｎＡ１－１３抗血清（Ａｎ－     

Effect of nerve growth factor on neuronal apoptosis after spinal cord injury in rats

OBJECTIVE: To explore the molecular mechanism of the protective effect of nerve growth factor (NGF) on injured spinal cord. METHODS: The posterior T(8) (the 8th thoracic segment) spinal cords of 60 Wistar rats were injured by impacts caused by objects (weighing 10 g) falling from a height of 2.5 cm with Allen's way. Solution with nerve growth factors (NGF) was given to 30 rats (the NGF group) through a microtubule inserted into the subarachnoid cavity immediately, and at 2, 4, 8, 12 and 24 hours after spinal cord injury (SCI) respectively. Normal saline (NS) with same volume was given to the other 30 rats (the NS group) with the same method. And 5 normal rats were taken as the normal controls. The expression of bcl-2 and bax proteins in spinal cord was detected with immunohistochemistry. The apoptotic neurons in spinal cord were measured with terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end-labeling of DNA fragments (TUNEL) staining. RESULTS: The positive expression of bcl-2 protein was strong in the normal controls, but decreased in the NS group, and increased significantly in the NGF group as compared with that of the NS group (P<0.01). The positive expression of bax protein was also strong in the normal controls, but increased in the NS group, and decreased significantly in the NGF group as compared with that of the NS group (P<0.01). Apoptotic neurons were found in the NS group, and they decreased significantly in the NGF group as compared with that of the NS group (P<0.01). CONCLUSIONS: NGF can protect the injured nerve tissues through stimulating the expression of bcl-2 protein, inhibiting the expression of bax protein and inhibiting the neuronal apoptosis after SCI.     

自噬蛋白p62在急性脊髓损伤大鼠脊髓组织中的表达

目的观察p62在早期急性脊髓损伤(SCI)模型大鼠脊髓组织中的表达变化,探讨p62在急性SCI的作用。方法将SD大鼠随机分为假手术组和造模后1、3、7、14 d组,每组6只。采用高空重物坠落击打方法造成大鼠SCI。采用Basso、Beattie、Bresnahan(BBB)评分法评估大鼠神经功能,取损伤的脊髓组织进行HE染色,观察病理学改变。通过实时荧光定量PCR、蛋白质印迹法和免疫组织化学方法检测急性SCI后大鼠脊髓组织中p62的表达变化。结果造模后1、3、7、14 d组BBB评分分别为(2.00±0.89)分、(4.67±1.03)分、(7.83±0.75)分、(14.50±1.05)分,均低于假手术组(21.00分),差异有统计学意义(P 0.05)。造模后1、3、7、14 d组损伤的脊髓组织神经元和白质髓鞘发生肿胀,随时间的延长逐渐出现变性和坏死。造模后1、3、7、14 d组p62表达逐渐增加,并呈持续增长趋势。结论 p62在大鼠发生急性SCI后表达持续增加,提示p62在急性SCI后发挥一定作用。     

大鼠慢性脊髓受压及减压后骨骼肌细胞的凋亡

目的：研究大鼠慢性脊髓损伤受压及减压后骨骼肌细胞的凋亡。方法：45只SD大鼠分成3组：①受压组15只，作成慢性脊髓受压损伤模型；②减压组25只，在压迫模型作成10d后取出压迫装置；③正常对照组5只，不做任何处理。应用HE染色、TUNEL和原位杂交技术研究慢性脊髓受压及减压后肌细胞的萎缩和凋亡。结果：正常组鲜见凋亡细胞，受压组出现骨骼肌细胞凋亡，bcl-2 mRNA表达减弱，BaxmRNA表达增强；减压后肌细胞凋亡数量明显减少，bcl-2 mRNA表达增强而Bax mRNA表达减少。结论：慢性脊髓受压肌细胞凋亡是失神经骨骼肌萎缩的机制之一，bcl-2和Bax基因参与肌细胞的凋亡。     

白细胞介素-10对大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡的影响

目的 观察白细胞介素-10(IL-10)对大鼠脊髓损伤(SCI)后脊髓细胞凋亡的影响,探讨IL-10对脊髓损伤的保护作用。方法 将SD大鼠随机分为3组:单纯SCI组(A组)、IL-10治疗组(B组)及假损伤组(Sham组)。除Sham组不致伤脊髓外,A、B两组应用改良的Allen打击法制作大鼠急性 SCI模型,B组大鼠于 SCI后 30 min腹腔注射 10 μg IL-10,再分别于伤后 12、24、48 h、4、8、16和 24 d应用苏木素-伊红(HE)染色、原位末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸生物素缺口末端标记技术(TUNEL检测法)及开放野行为评分(BBB评分)观察IL-10治疗后脊髓细胞凋亡的变化及神经功能的恢复情况。结果 假损伤组未见凋亡细胞。A组大鼠伤后 12 h即可见零星的凋亡细胞,至 24 h渐增多,伤后 48 h脊髓组织凋亡细胞率达峰值。B组伤后 24、48 h及4d细胞凋亡率比单纯SCI组明显减少,差异具有显著性(P<0.01或P<0.05)。B组脊髓功能恢复亦比A组有明显提高(P<0.05)。结论 SCI后早期应用IL-10可抑制大鼠脊髓细胞凋亡,从而对脊髓损伤起到保护作用。     

bcl-xL基因转染对脊髓损伤半胱氨酸蛋白酶-3表达的影响

目的 探讨bcl—xL基因转染对大鼠脊髓损伤Caspase-3表达的影响和对神经细胞的保护作用。方法 制备大鼠胸段脊髓T8,9压迫损伤模型，随机分为2组：对照组．bcl—xL组，将阳离子脂质体质粒混合后直接注入大鼠损伤脊髓，伤后1、3和7d利用半定量逆转录-聚合酶链式反应（RT—PCR）和免疫组织化学检测bcl—xL和Caspase-3表达情况；TUNEL法检测细胞凋亡，观察对神经细胞的保护作用。结果 与对照组相比，bcl—xL组各时间段Caspase-3表达明显降低（P〈0．05），TUNEL阳性凋亡的神经细胞明显减少（P〈0．05）。结论 外源性bcl—xL基因体内转染在损伤脊髓的过度表达可减少脊髓不完全性损伤后凋亡，可能与其下调Caspase-3的有关。     

腺苷治疗大鼠脊髓损伤的初步研究

目的 通过观察大鼠脊髓损伤后内源性细胞外腺苷含量的变化以及外源性腺苷对脊髓损伤后脊髓组织细胞外钙离子和神经功能的影响,探讨腺苷在脊髓继发性损伤中的作用。 方法 ＳＤ大鼠５８只,制作成Ｔ１３脊髓腹侧压迫模型,用微透析技术每２０ｍｉｎ连续收集脊髓损伤后脊髓组织细胞外液,用高效液相色谱法仪紫外检测法检测细胞外液腺苷的含量;伤前１５ｍｉｎ蛛网膜下给予非特异性腺苷受体激动剂２－氯腺苷,伤后立即开始每１０ｍｉ     

脊髓牵拉性损伤动物模型的建立

目的：建立大鼠脊髓牵拉性损伤的模型,探讨实验性脊髓牵拉性损伤的病理生理改变及临床意义。方法：双侧椎板切除显露大鼠脊髓的全宽、用模拟神经拉钩特制的牵开器由侧方牵拉脊髓,实现水平方向的脊髓牵拉性损伤,并用磁刺激运动诱发电位和行为学功能试验指标进行综合评价。结果：选用不同的牵拉比率（２０％、３０％和４０％）可以稳定地复制出不同程度的牵拉性脊髓损伤,其神经电生理的改变与行为学功能的改变有相关性。结论：此模     

bFGF对大鼠牵张性脊髓损伤后脊髓神经元影响的实验研究

目的探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对牵张性脊髓损伤后神经元影响的作用。方法大鼠脊髓T13～L2经牵张损伤,CSEP监测P1～N1波幅下降至术前波幅70%后,于损伤平面以下经蛛网膜下腔置细导管,治疗组分别于术后即刻、1、2、3、4、8、12及24h经细导管注入bFGF溶液20μl(含bFGF20μg),对照组在相同时间注入等量生理盐水,然后于术后1d、4d、7d、14d及21d处死取材(n=4)。应用行为学及CSEP检查大鼠功能恢复情况,应用尼氏染色法观察神经元及尼氏体密度,并用计算机图像分析系统进行定量分析。结果bFGF治疗组大鼠的神经功能恢复与对照组相比差异有显著意义。尼氏染色的图像分析显示:bFGF治疗组的神经元截面积及尼氏体密度与对照组比较差异有显著意义(P<0.01)。结论bFGF对大鼠牵张性脊髓损伤后脊髓功能及神经元形态的恢复有明显的促进作用。     

创伤性上升性脊髓缺血损伤

脊椎损伤后,脊髓损伤平面上升较为少见。作者报告了５例,其中Ｔ１０－１１骨折脱位２例：１例于伤后２周内,截竣平面上升至Ｃ２,呼吸麻痹死亡,１例上升至颈部脊髓,双上肢无力;另３例为Ｔ１２骨折２例,Ｌ３骨折１例：其中截竣平面上升至Ｔ９至１例,Ｔ８者２例。５例患者双下肢皆呈软竣,１例死亡患者尸检见脊髓完整,Ｔ９－１０段脊髓前后动静脉血栓,其向上至Ｃ３,向下至Ｓ１,脊髓前血管、中央血管、髓内小血管多处 栓,     

联合应用PARP-1与Caspase-3抑制剂对脊髓损伤大鼠神经细胞凋亡的影响

目的:探讨联合应用多聚腺嘌呤二核苷酸核糖聚合酶-1(PARP-1)抑制剂3-氨基苯甲酰胺(3-aminobenzamide,3-AB)和Caspase-3抑制剂Z-DEVD-FMK对脊髓损伤大鼠神经细胞凋亡的影响。方法:120只成年健康SD大鼠随机分为假手术组(A组)、模型组(B组)、PARP-1抑制剂组(C组)和联合用药组(D组),每组30只。以Allen′s打击法制备大鼠脊髓损伤模型,每组分别于造模后1d、3d、7d取5只大鼠行BBB评分,处死后利用免疫组化方法检测损伤部位脊髓内PARP-1、凋亡诱导因子(AIF)、Caspase-3及Bcl-2的表达;各时间点各组剩余大鼠处死后利用Western blotting检测PARP-1、Caspase-3蛋白表达水平,实时荧光定量PCR检测PARP-1、AIF、Caspase-3及Bcl-2的m RNA水平,采用原位末端标记(TUNEL)法检测神经细胞凋亡情况。结果:造模后1d时B、C、D组大鼠BBB评分均为0分;3d时三组间的评分无统计学差异;7d时D组及C组明显高于B组,且D组最高(P0.05)。免疫组化及Western blotting结果显示,脊髓损伤后1~7d,B组脊髓组织中PARP-1、AIF及Caspase-3表达逐渐增强,Bcl-2表达逐渐减弱(P0.05);与B组比较,D组及C组的PARP-1、AIF、Caspase-3表达均显著降低,且D组最低(P0.05);而D组及C组的Bcl-2表达显著高于B组,且D组最高(P0.05)。实时荧光定量PCR检测各目的基因表达水平与其蛋白水平一致。TUNEL结果显示,B组脊髓损伤后3d凋亡细胞最多,7d时数量减少,但仍保持在较高水平(P0.05);D组及C组凋亡细胞指数均显著低于B组,且D组最低(P0.05)。结论:联合应用PARP-1抑制剂3-AB和Caspase-3抑制剂Z-DEVD-FMK可有效抑制大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡,其机制可能与PARP-1、AIF、Caspase-3的表达抑制及Bcl-2的表达上调有关。     

大鼠牵张性脊髓损伤后细胞凋亡及相关基因表达的实验研究

目的观察大鼠牵张性脊髓损伤后细胞凋亡现象,检测脊髓损伤后凋亡相关基因的表达。方法大鼠脊髓T13～L2经牵张损伤,皮层体感诱发电位(CSEP)监测P1N1波幅下降至术前波幅70%后,分别于术后30min、6h、1、4、7、14、21d处死大鼠,取材(n=4)。应用流式细胞仪、原位末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导dUTP标记(TUNEL)技术观察脊髓细胞凋亡情况,用免疫组化检测p53、bax和bcl2的表达。结果流式细胞仪及TUNEL法检测显示,损伤组术后6h凋亡细胞开始增多,术后7d细胞凋亡率达高峰,随后开始回落,持续21d,与空白对照组及椎板切除组比较,差异有显著性意义(P<005,001)。TUNEL法染色显示,白质中出现大量胶质细胞凋亡。免疫组化染色显示损伤组术后6h开始,p53、bax和bcl2阳性表达开始增多,p53阳性细胞数术后4d达高峰,bax和bcl2术后7d达高峰,损伤组各时相点的阳性表达与空白对照组与椎板切除组比较差异有显著性意义(P<005,001)。结论牵张性脊髓损伤后存在细胞凋亡现象,从形态上看包括神经元和胶质细胞凋亡,细胞凋亡是牵张性脊髓损伤继发损害中细胞死亡的一种重要形式,也是继发损伤期的重要病理变化。凋亡相关基因p53、bax大量表达,可能在脊髓细胞凋亡过程中起重要作用。     

大鼠脊髓损伤后血脊髓屏障通透性变化的观察

目的：探讨脊髓损伤后血脊髓屏障通透性变化的机理。方法：采用美国纽约大学（New York University,NYU)脊髓损伤模型,选用体重300－350克雄性成年Wistar大鼠35只,随机分为对照组5只;脊髓损伤组30只,分为伤后4、6、12、24、48、72h6组,每组5只,应用NYU脊髓损伤模型,采用免疫组织化学方法,观察脊髓损伤后不同时间免疫球蛋白G（immunglobularprotein,G,IgG)、补体3的C片断（c fragment of complement3,C3c)的表达变化。结果：脊髓损伤后C3c、IgG渗入了脊髓损伤区域、损伤区域周边及血管,脊髓损伤不同时间段这些区域的免疫标记不同。结论：脊髓损伤后C3c、IgG参与了血脊髓屏障的破坏,参与了脊髓损伤后神经细胞的继发性损伤。     

山莨菪碱对牵张性脊髓损伤的防治作用

目的：探讨山莨菪碱（６５４２）对牵张性脊髓损伤的防治效果。方法：日本大耳白兔４８只,随机分为对照组、实验组。实验组于伤前１２、８、４ｈ各肌注６５４２１ｍｇ／ｋｇ;伤后１５ｍｉｎ开始每１ｈ静脉滴注６５４２０３ｍｇ／ｋｇ,持续５ｈ,此后每间隔４ｈ肌注６５４２１ｍｇ／ｋｇ到２ｄ。对照组用等量体积的生理盐水替代６５４２。采用脊髓功能监护、形态学、脊髓组织生化测定、运动功能评定等方法评定６５４２对牵张性脊髓损伤的防治作用。结果：实验组动物伤后８ｈ运动功能障碍率低于对照组,丙二醛（ＭＤＡ）含量低于对照组,过氧化物岐化酶（ＳＯＤ）含量高于对照组（Ｐ＜００５）;神经元及神经纤维变性、坏死,灰质出血范围轻于对照组。结论：伤前应用６５４２能保护脊髓微血管,抑制脊髓继发病理损害,促进脊髓功能恢复。     

Pregabalin as a neuroprotector after spinal cord injury in rats

The over-expression of excitotoxic neurotransmitter, such as glutamate, is an important mechanism of secondary injury after spinal cord injury. The authors examined the neuroprotective effect of pregabalin (GP) which is known as to reduce glutamate secretion, in a rat model of spinal cord injury. Thirty-two male Sprague–Dawley rats were randomly allocated to four groups; the control group (contusion injury only), the methylprednisolone treated group, the minocycline treated group and the GP treated group. Spinal cord injury was produced by contusion using the New York University impactor (25 g-cm, at the 9th–10th thoracic). Functional evaluations were done using the inclined plane test and a motor rating scale. Anti-apoptotic and anti-inflammatory effects were evaluated by in situ nick-end labeling staining technique (TUNEL) and immunofluorescence staining of cord tissues obtained at 7 days post-injury. Pregabalin treated animals showed significantly better functional recovery, and anti-apoptotic and anti-inflammatory effects. Mean numbers of TUNEL positive cells in the respective groups were 63.5 ± 7.4, 53.6 ± 4.0, 44.2 ± 3.9 and 36.5 ± 3.6. Double staining (TUNEL and anti-CC1) for oligodendrocyte apoptosis, was used to calculate oligodendrocyte apoptotic indexes (AI), using the following formula AI = (No. of doubly stained cells/No. of anti-CC1 positive cells) × 100. Mean group AIs were 88.6, 46.7, 82.1 and 70.3%, respectively. Mean numbers of activated microglia (anti-OX-42 positive cells) in high power fields were 29.8 ± 3.9, 22.7 ± 4.1, 21.0 ± 3.9 and 17.8 ± 4.3, respectively. This experiment demonstrates that GP can act as a neuroprotector after SCI in rats, and its anti-apoptotic and anti-inflammatory effects are related to its neuroprotective effect. Further studies are needed to unveil the specific mechanism involved at the receptor level.