NOV在真皮来源大鼠间充质干细胞中的表达及活性检测

目的：检测肾母细胞瘤过度表达（NOV）基因在真皮来源大鼠间充质干细胞（DMSCs）中的表达及活性。方法：NOV基因重组质粒转染DMSCs，在荧光倒置显微镜下观察转染产物，RT—PCR法检测转染细胞中NOV基因表达。收集NOV基因修饰DMSCs的条件培养液（简称NOV—CM），作用于对照组DMSCs及转染了NOV基因的DMSCs（简称NOV—DMSCs），检测NOV基因及其分泌蛋白在DMSCs分化中的活性作用。结果：NOV重组质粒体外转染入大鼠真皮多能干细胞后，转染细胞中检测到NOV基因。免疫荧光检测结果显示，NOV基因修饰及NOV—CM培养DMSCs时，DMSCs向神经元方向分化的比例增高，且细胞突起较长。结论：NOV基因可在DMSCs中稳定表达，可能具有促进DMSCs向神经元分化的作用。     

真皮来源间充质干细胞的分离培养及成神经分化的研究

目的：研究真皮来源间充质干细胞的分离培养方法及其向神经细胞分化的条件及可行性。方法：取大鼠真皮组织，采用贴壁传代培养筛选法，分离培养真皮间充质干细胞，流式细胞术检测细胞周期，经β-巯基乙醇诱导，倒置显微镜下观察细胞形态变化，免疫细胞化学方法对分化细胞进行鉴定。结果：分离的早期贴壁的真皮来源间充质干细胞经过连续传代培养至第4代，细胞形态较为均一，86％的细胞处于G0／G1期，细胞表面波形蛋白表达阳性，但因子Ⅷ和角蛋白表达阴性。经β-巯基乙醇诱导，真皮间充质干细胞可向神经细胞分化，细胞突起增多，具有神经元的形态学特征，分化后的细胞表达神经元标志物——神经元特异性烯醇化酶（NSE）、神经微丝（NF-200）。结论：大鼠真皮组织中存在着成体多能干细胞，一定条件下可分化为神经元。提示真皮可能是成体多能干细胞的又—来源，有望在神经组织修复和再生中发挥作用。     

人转化生长因子β_2基因转染诱导脂肪间充质干细胞向软骨细胞定向分化的实验研究

目的:探讨脂肪间充质干细胞作为软骨组织工程的种子细胞和基因增强的组织工程的可行性。方法:取3周龄Lewis大鼠的腹股沟脂肪垫,消化法获得脂肪间充质干细胞,通过脂质体介导,将hTGFβ2基因转染到体外培养的脂肪间充质干细胞中,采用免疫组织化学染色、RT-PCR和Western blotting的方法检测目的基因与软骨特异性蛋白——Ⅱ型胶原和蛋白多糖表达的情况。结果:从成体大鼠脂肪组织中培养出脂肪间充质干细胞,体外培养呈成纤维细胞样,能大量稳定增殖传代。原代脂肪间充质干细胞能自发分化为脂肪细胞,传代细胞在胰岛素和地塞米松的作用下生成脂滴向脂肪细胞分化;hTGFβ2基因转入脂肪间充质干细胞能获得瞬时及稳定表达,并促使Ⅱ型胶原和蛋白多糖合成。结论:从脂肪组织中可获得具有多分化潜能的间充质干细胞,并能在体外稳定增殖传代,可自发或经诱导后分化为脂肪细胞;pcDNA3.1(+)/hTGFβ2真核表达载体成功转染脂肪间充质干细胞,诱导其向软骨细胞分化。     

间充质干细胞在组织修复与再生中的应用

由于间充质干细胞具有自我更新、多向分化潜能,且容易获取及体外扩增培养,成为近年来成体干细胞研究的热点。间充质干细胞既可以作为修复组织的细胞来源,还可能同时参与多种组织的更新。目前在多个领域显示出重要的应用前景,包括组织工程的种子细胞、基因转染的细胞载体等。     

脐带全层源间充质干细胞分离培养及向成软骨细胞分化的实验研究

目的从人脐带全层中分离培养间充质干细胞(MSCs),并进行成软骨诱导分化,为组织工程软骨和软骨损伤后修复提供种子细胞。方法采用胶原酶消化法从脐带全层中分离培养间充质干细胞,显微镜下观察细胞形态,细胞计数法绘制细胞生长曲线,采用流式细胞仪检测细胞周期及细胞表型,采用微团细胞培养在软骨诱导液中向软骨细胞分化,阿尔辛蓝及甲苯胺蓝染色检测细胞分化情况,RT-PCR法检测诱导后细胞表达聚集蛋白聚糖(ACAN)基因情况。结果人脐带全层来源的MSCs呈成纤维样形态漩涡状贴壁生长,细胞高表达HLA-I类分子、CD73、CD90、CD166及CD105,不表达CD34、CD45、CD14、CD31、CD80、CD86及HLA-DR。细胞诱导分化21d后,阿尔辛兰及甲苯胺蓝染色阳性;RT-PCR检测诱导后的细胞表达ACAN,而对照组无表达。结论人脐带全层为成体MSCs提供一种新而方便的来源,人脐带间充质干细胞(hucMSCs)体外培养能够向软骨细胞分化。     

创伤局部微环境对大鼠真皮多能干细胞生物学性状的影响

目的：研究创伤局部微环境对大鼠真皮多能干细胞生物学性状的影响。方法：将大鼠真皮多能干细胞经荧光染料DAPI标记后，植入受损的皮肤组织，荧光显微镜观察标记细胞的植入情况；体外四唑盐（MTT）法和划痕实验检测急性皮肤创伤伤口液对大鼠真皮多能干细胞增殖和迁移的影响。进一步将大鼠真皮多能干细胞置入透析袋中并植入大鼠背部伤口作用3d，免疫组化法检测碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)，神经生长因子（NGF），一种生长因子的辅受体syndecan-1的表达。结果：移植14d后，DAPI标记的真皮多能干细胞主要位于真皮和皮下组织；体积分数为10％的伤口液在体外促进真皮多能干细胞的增殖和迁移的能力最强；大鼠背部伤口局部微环境作用3d后，真皮多能干细胞高表达bFGF,NGF等生长因子和syndecan-1。结论：创伤局部微环境可通过诱导真皮多能干细胞的增殖，运动和分化而直接参与修复，同时还可通过调控生长因子和辅助受体的表达而间接促进修复。     

共培养系统下骨髓间充质干细胞分化为颌下腺腺泡细胞的实验研究

目的 研究使用共培养系统将骨髓间充质于细胞分化为有分泌功能的颌下腺腺泡细胞的可行性.方法 分离成年SD大鼠骨髓间充质干细胞于体外培养、纯化和鉴定,同时分离新生SD大鼠的颌下腺细胞于体外培养、纯化和鉴定,取颌下腺腺泡细胞第二代和间充质干细胞第一代置于共培养系统诱导干细胞定向分化.使用免疫细胞化学法分析骨髓间充质干细胞是否表达淀粉酶抗体.结果 纯化后的颌下腺腺泡细胞呈铺路石样形态,原代至第5代培养基及细胞内均可检测到淀粉酶表达;体外培养的骨髓间充质干细胞呈梭形,呈束状、漩涡状排列,可成功诱导成脂肪细胞,油红-O染色显示含有脂滴;共培养后的骨髓间充质干细胞表达淀粉酶抗体,约30%的骨髓间充质干细胞在共培养1周后转化为腺泡细胞,约50%的骨髓间充质干细胞在共培养2周后转化为腺泡细胞.结论 成功构建大鼠颌下腺腺泡细胞和骨髓间充质干细胞的体外培养体系,并证明大鼠骨髓间充质干细胞具有转化为腺泡细胞的能力,因此骨髓间充质干细胞将有望应用于涎腺组织工程.     

BMP12转染骨髓间充质干细胞的瞬时表达

目的 以骨形态发生蛋白12(BMP12)基因转染骨髓间充质干细胞,探讨骨髓间充质干细胞定向分化为肌腱细胞的可行性。方法 将携带有BMP12基因的质粒pEGFP-C1,采用电穿法转染骨髓间充质干细胞,转染后于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)表达情况。结果 转染后6h可见细胞内有GFP表达,12h后达高峰,持续约3天,其后有些细胞荧光开始减退。结论 BMP12基因转染骨髓间充质干细胞后,骨髓间充质干细胞内有GFP表达,提示细胞转染成功,骨髓向间充质干细胞定向分化为肌腱细胞具有可行性。     

HMGB1促进人骨髓间充质干细胞迁移的实验研究

目的：构建人高迁移率族蛋白（HMGB1）全长编码基因的原核表达载体，诱导和纯化重组蛋白，分析其对人骨髓间充质干细胞的迁移作用。方法：RT—PCR方法从人的单个核细胞中扩增出HMGB1全长编码基因，克隆于原核表达载体pET-24a—d（＋），经IPTG诱导表达，通过亲和层析方法纯化得到携带（His）。标签的HMGB1融合蛋白；RT—PCR方法检测间充质干细胞HMGB1受体的表达；观察HMGB1对人骨髓来源间充质干细胞的迁移作用。结果：构建了融合蛋白HMGB1的原核表达载体，获得了高度纯化的HMGB1融合蛋白。RT-PCR方法检测到间充质干细胞表达HMGB1的某些受体如RAGE和TLR-4。HMGB1在体外能够诱导人骨髓来源的间充质干细胞的迁移。结论：重组HMGB1蛋白能够诱导骨髓间充质干细胞的迁移，此作用有可能通过RAGE和（或）TLR-4介导。     

应用间充质干细胞治疗急性辐射损伤的研究现状与进展

间充质干细胞是一类来源广泛的低免疫原性多能干细胞, 具有多向分化、造血支持、免疫调控等特点, 且易于分离、扩增和外源基因转染, 在临床治疗中有广泛的应用价值, 其用于急性放射损伤治疗的报道也较多。笔者主要介绍了间充质干细胞治疗急性放射损伤的研究现状和相关进展。     

EGFP标记的VEGF165重组质粒的构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达

目的构建pIRES2-EGFP-VEGF165真核表达质粒,并在大鼠骨髓间充质干细胞内表达。方法应用DNA重组方法构建pIRES2-EGFP-VEGF165,并将其转染到大鼠骨髓间充质干细胞内,采用ELISA和MTT法检测转染后细胞培养上清液中VHGF165的含量及生物活性。结果成功构建了pIRES2-EGFP-VHGF165,将其转染骨髓间充质干细胞后,VEGF蛋白表达水平明显增高．转染后的细胞培养上清具有促使内皮细胞增殖的生物活性。结论成功构建了真核表达质粒pIRES2-EGFP-VEGFl65．将其转染骨髓间充质干细胞后可高水平地表达具有生物学活性的VEGF蛋白。     

骨形态发生蛋白4重组腺病毒的构建及其对NIH3T3细胞成骨分化作用的研究

目的:构建骨形态发生蛋白4(BMP4)重组腺病毒,探讨其对NIH3T3成纤维细胞向成骨方向分化的影响。方法:将BMP4基因克隆连接到载体pAdTrack-CMV中,在细菌BJ5183中与pAdEasy腺病毒基因组进行同源重组,得到BMP4重组腺病毒基因组,通过转染HEK293细胞包装出重组腺病毒。利用BMP4重组腺病毒转染NIH3T3细胞,采用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)和western-blot检测BMP4在细胞中的mRNA和蛋白表达。Gomori改良钙钴法检测BMP4重组腺病毒转染后的NIH3T3细胞碱性磷酸酶表达;von kossa染色检测BMP4重组腺病毒转染后NIH3T3细胞的成骨分化情况。结果:获得了BMP4转移质粒pAdTrack-BMP4和BMP4重组腺病毒基因组,并包装出重组腺病毒。BMP4在转染后的NIH3T3细胞中得到表达,表达的BMP4蛋白具有生物学活性。转染后的NIH3T3细胞碱性磷酸酶表达增加。BMP4促进了NIH3T3细胞向成骨方向分化,形成钙结节。结论:本实验成功构建了BMP4重组腺病毒;BMP4重组腺病毒可促进NIH3T3细胞向成骨方向分化。     

pTet-on骨骺干细胞株的建立和pTRE-甲状旁腺相关蛋白(1-36)反应质粒的构建

目的 建立pTet-on骨骺干细胞株,克隆甲状旁腺相关蛋白[PTHrP(1-36)]基因并构建反应质粒pTRE-PTHHrP(1-36).方法 用脂质体介导的基因转染技术将pTet-on质粒转染于永生化骨骺干细胞,G418筛选得到稳定克隆,再瞬时转染pTRE-2Hyg-Luc质粒并筛选出高水平诱导、低背景表达的永生化骨骺干细胞系.以RT-PCR方法获得带有酶切位点PTHrP(1-36)基因片段,与载体pTRE-2Hyg均双酶切后连接,转化扩增后对重组质粒进行提取和酶切、测序鉴定.结果 筛选到1株诱导后荧光素酶的表达活性增加50倍的骨骺干细胞系;经酶切图谱分析和DNA序列测定证实目的基因已经插入重组质粒.结论 筛选得到的永生化骨骺干细胞株受强力霉素诱导后能够低背景、高水平表达;成功克隆PTHrP(1-36)基因并构建了反应质粒pTRE-PTHrP(1-36),为进一步精确调控PTHrP(1-36)基因的表达奠定了基础.     

HGF非融合蛋白真核表达载体的构建及其在骨骼肌细胞中的表达

目的构建以HGF为目的基因、以EGFP为报告基因的非融合蛋白真核表达载体pCMV-HGF-IRES-EGFP,并观察HGF基因在原代培养的大鼠骨骼肌细胞中的表达。方法利用BamHI单酶切质粒pcDNA3-HGF,得到HGF基因片段,将其正向插入到真核表达载体pCMV-IRES-EGFP的CMV后方BamHI的单克隆位点。脂质体介导转染至原代培养的大鼠骨骼肌细胞,在荧光显微镜下观察EGFP的表达,并用ELISA法检测HGF的表达情况。结果构建了HGF的非融合蛋白真核表达载体pCMV-HGF-IRES-EGFP,转染原代培养的大鼠骨骼肌细胞24~72h后,见30%的细胞表达EGFP。ELISA检测细胞培养液证实转染后第1天即有HGF的表达,第4天HGF浓度为(5402.0±227.9)ng/L。结论成功构建了非融合蛋白真核表达载体pCMV-HGF-IRES-EGFP,其在原代培养的大鼠骨骼肌细胞中能有效表达。     

重组腺病毒Ad-huVEGF121的制备

目的：构建能够用于骨缺血研究的能表达huVEGF121的重组腺病毒载体。方法：将huVEGF121克隆至穿梭质粒，线性化后转染含骨架质粒的BJ5183菌，构建重组腺病毒质粒。酶切及PCR法鉴定；将其线性化后转染293细胞，通过观察绿色荧光监测病毒产生，免疫组化检测VEGF121表达。结果：成功的将hu—VEGF121克隆至穿梭质粒pTrack—CMV，正确构建了重组腺病毒质粒，感染293细胞得到大量病毒。结论：成功构建了huVEGF121重组腺病毒，为缺血性骨病的进一步研究奠定了基础。     

具有多种剪接形式的RNA结合蛋白基因的克隆、表达及其细胞内定位

目的：构建具有多种剪接形式的RNA结合蛋白（RBPMS）基因的真核表达载体,并在真核细胞中进行表达,确定RBPMS在细胞中的定位.方法：采用PCR技术,从人卵巢文库中扩增RBPMS基因的完整编码序列,将所扩增基因克隆到带FLAG标签的真核表达载体上,转染人胚肾细胞293T,Western印迹鉴定RBPMS的表达.然后将所扩增基因克隆到带绿色荧光标签的pEGFP-C1表达载体上,转染乳癌细胞ZR75-1,观察RBPMS在细胞中的定位情况.结果：经限制性内切酶分析和DNA序列测定鉴定构建的重组表达载体正确,Western印迹实验证明RBPMS表达成功,通过激光共聚焦显微镜观察,RBPMS分布在胞质中,在40%～50%细胞中RBPMS呈聚集状分布.结论：成功构建了RBPMS基因的真核表达载体,该基因产物分布在胞质中,在40%～50%细胞中RBPMS呈聚集状分布.     

人LDLR基因的克隆及在Hepa1-6细胞中的表达

目的 :从能感染HCV的人肝癌细胞HepG2中克隆出人LDLR基因 ,构建其真核表达质粒 ,并在小鼠肝癌细胞Hepa1 6中进行表达。方法 :从HepG2中提取总RNA ,采取逆转录PCR(RT PCR)方法得到人LDLR的cDNA。将获得的人LDLR基因克隆到真核表达载体pcDNA3中 ,进行酶切和序列鉴定。将重组质粒pcDNA3 hLDLR和空载体转入Hepa1 6 ,G4 18筛选 ,并用RT PCR和FACS检测人LDLR基因转录和蛋白的表达。结果 :人LDLR的cDNA已插入载体pcDNA3构建成真核表达质粒pcDNA3 hLDLR ,双酶切和测序表明 ,克隆的人LDLR与已登录GenBank的序列存在核苷酸多态性 ,但编码的氨基酸序列完全一致 ,该序列的GenBank登录号为gi|2 16 2 96 4 7|gb|AY114 15 5 .1,并且真核表达质粒的构建正确。用脂质体介导的方法转入Hepa1 6后 ,用RT PCR和FACS检测表明 ,细胞可表达人LDLR。结论 :成功地构建了真核表达质粒pcDNA3 hLDLR ,为进一步研究HCV和人LDLR的相互作用 ,以及建立可能的HCV细胞感染模型奠定了基础。     

登革3型病毒NS1基因重组质粒DNA的构建及其免疫原性观察

目的：构建登革3型病毒NS1基因的真核重组表达质粒，观察其免疫原性，为登革新型疫苗的研究提供依据。方法：从感染鼠脑中提取登革3型病毒RNA，经RT－PCR获得NS1基因片段，然后将其克隆到真核表达载体中。用电穿孔法将重组质粒NDA转入COS7细胞，通过免疫荧光法检测外源基因在真核细胞中的表达，将重组质粒DNA免疫BALB／c小鼠，观察其免疫原性。结果：通过酶切鉴定和序列测定证实了NS1基因片段已经插入真核表达载体，用免疫荧光法证明转染了重组质粒的COS7细胞的胞浆中有特异荧光。重组质粒DNA免疫小鼠后可观察到诱发产生的细胞免疫应答。结论：含有登革3型病毒NS1基因的真核重组表达质粒可以在COS7细胞中进行表达，而且能够诱导小鼠产生细胞免疫应答。     

人端粒酶反转录酶基因转染对人胎儿表皮干细胞增殖的影响

目的 探讨外源性人端粒酶反转录酶(hTERT)基因转染对人胎儿表皮干细胞增殖的影响.方法 采用脂质体转染法,将含有hTERT基因的质粒pIRES2-EGFP-hTERT和卒载体质粒pIRES2-EGFP分别导人体外培养的人胎儿表皮干细胞,并用G418筛选法进行抗性克隆的筛选.用RT-PCR和Western blot检测表皮十细胞hTERT mRNA及其蛋白的表达,端粒重复序列扩增法(TRAP)-ELISA检测其端粒酶活性,流式细胞仪检测细胞周期.结果 非转染组和空载体质粒转染组表皮干细胞弱表达hTERT mRNA和蛋白,而质粒转染组表皮干细胞强表达hTERT mRNA和蛋白;与非转染组和窄载体质粒转染组比较,质粒转染组表皮干细胞端粒酶活性的表达量显著升高,G_0/G_1期细胞比例明显下降,而S、G_2/M期细胞比例升高,增殖指数增加.结论 外源性hTERT基因转染能有效增强体外培养的人表皮干细胞hTERT mRNA和蛋白的表达及端粒酶活性,细胞增殖能力明显增强.