LY294002抑制PI3K/Akt信号通路对人胃癌SGC-7901细胞的影响

目的 探讨低氧环境下PI3K抑制剂2-(4-吗啉基)- 8-苯基- 4氢-1-苯并吡喃- 4-酮(LY294002)对人胃癌SGC-7901细胞中磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/丝氨酸苏氨酸激酶(Akt)信号通路、细胞生长、细胞凋亡及低氧诱导因子-1α(HIF-1α)mRNA表达的影响.方法 应用LY294002作用于低氧环境中的人胃癌SGC-7901细胞(低氧+LY294002组),采用CCK-8试剂盒检测SGC-7901细胞生长;流式细胞仪检测细胞凋亡百分比;Western blotting检测PI3K和p-Akt蛋白表达;RT-PCR检测HIF-1α mRNA表达.以低氧环境中未加LY294002的细胞作为对照(低氧组).结果 LY294002能抑制低氧环境中SGC-7901细胞增殖,抑制效果在药物作用后第2～6天时最为明显(P＜0.05),低氧+LY294002组中细胞凋亡百分比明显高于低氧组(P＜0.01).LY294002能明显抑制PI3K、p-Akt蛋白以及HIF-1α mRNA的表达,与低氧组比较差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 LY294002能抑制低氧环境中人胃癌SGC-7901细胞生长,促进细胞凋亡,抑制PI3K/Akt信号通路及其下游HIF-1α mRNA的表达.     

大鼠神经干细胞中PI3-K/AKT信号转导通路的研究

目的 应用PI3-K特异性阻滞剂LY294002孵育大鼠神经干细胞(NSCs),探讨PI3-K/AKT信号转导通路在NSCs中的作用.方法 体外分离、培养E15～16 胎鼠NSCs,应用不同浓度(0~40 μmol/L)的LY294002孵育NSCs后进行细胞存活(WST-8检测)、增殖(BrdU免疫组织化学鉴定)、分化(β Tubulin-Ⅲ免疫组织化学鉴定)和AKT磷酸化蛋白水平(Western Blotting)的检测.结果 LY294002对NSCs的存活、增殖和分化的影响呈剂量依赖性.在LY294002较高浓度(25、30、35、40 μmol/L)时,NSCs的存活率明显下降(P<0.05);LY294002为30、35、40 μmol/L时,BrdU阳性细胞数明显少于正常对照组(LY294002 0 μmol/L)(P<0.05);LY294002为35、40 μmol/L时,β Tubulin-Ⅲ的阳性细胞数明显少于正常对照组(P<0.05).LY294002 阻断AKT表达的作用呈剂量依赖性.结论 PI3-K/AKT信号转导通路对大鼠NSCs的存活、增殖、分化起重要作用.     

大鼠神经干细胞中PI3-K/AKT信号转导通路的研究

目的 应用PI3-K特异性阻滞剂LY294002孵育大鼠神经干细胞（NSCs）,探讨PI3-K/AKT信号转导通路在NSCs中的作用。方法 体外分离、培养E15～16 胎鼠NSCs,应用不同浓度（0~40 μmol/L）的LY294002孵育NSCs后进行细胞存活(WST-8检测)、增殖(BrdU免疫组织化学鉴定)、分化(β Tubulin-Ⅲ免疫组织化学鉴定)和AKT磷酸化蛋白水平(Western Blotting)的检测。结果 LY294002对NSCs的存活、增殖和分化的影响呈剂量依赖性。在LY294002较高浓度（25、30、35、40 μmol/L）时,NSCs的存活率明显下降（P<0.05）;LY294002为30、35、40 μmol/L时,BrdU阳性细胞数明显少于正常对照组（LY294002 0 μmol/L）（P<0.05）;LY294002为35、40 μmol/L时,β Tubulin-Ⅲ的阳性细胞数明显少于正常对照组（P<0.05）。LY294002 阻断AKT表达的作用呈剂量依赖性。结论 PI3-K/AKT信号转导通路对大鼠NSCs的存活、增殖、分化起重要作用。     

脑缺血后脑红蛋白的保护作用及信号转导机制

目的 观察脑红蛋白(Ngb)的神经保护作用并探讨其与磷脂酰肌醇3激酶/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(PI3-K/Akt)信号通路的关系.方法 健康雄性SD大鼠随机分为5组(n=12):①假手术组,②缺血组,③Hemin组,④LY(LY294002)组,⑤Hemin+ LY组,应用大脑中动脉线栓法(MCAO)制作大鼠局灶性脑缺血模型,评定大鼠神经功能并计算脑梗死体积,Western blot方法检测Ngb蛋白表达和PI3-K/Akt活性变化.结果 脑缺血后Ngb蛋白表达增加,Hemin可诱导Ngb高表达,磷酸化Akt (pAkt)水平亦同时升高,脑梗死体积减小,神经功能改善;LY294002特异性阻断了PI3-K/Akt信号通路的活化,加重了脑损伤,不能抑制Ngb表达.结论 细胞存活信号通路PI3-K/Akt可能介导了脑缺血后Ngb的神经保护作用.     

LY294002抑制PI3K/Akt信号通路对人胃癌SGC-7901细胞的影响

目的探讨低氧环境下PI3K抑制剂2-（4-吗啉基）-8-苯基-4氢-1-苯并吡喃-4-酮（LY294002）对人胃癌SGC-7901细胞中磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）／丝氨酸苏氨酸激酶（Akt）信号通路、细胞生长、细胞凋亡及低氧诱导因子-1α（HIF-1α）mRNA表达的影响。方法应用LY294002作用于低氧环境中的人胃癌SGC-7901细胞（低氧＋LY294002组）,采用CCK-8试剂盒检测SGC-7901细胞生长;流式细胞仪检测细胞凋亡百分比;Western blotting检测P13K和p-Akt蛋白表达;RT—PCR检测HIF-1α mRNA表达。以低氧环境中未加LY294002的细胞作为对照（低氧组）。结果LY294002能抑制低氧环境中SGC-7901细胞增殖,抑制效果在药物作用后第2～6天时最为明显（P〈0．05）,低氧＋LY294002组中细胞凋亡百分比明显高于低氧组（P〈0．01）。LY294002能明显抑制PI3K、p-Akt蛋白以及HIF-1α mRNA的表达,与低氧组比较差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论LY294002能抑制低氧环境中人胃癌SGC-7901细胞生长,促进细胞凋亡,抑制PI3K／Akt信号通路及其下游HIF-1α mRNA的表达。     

青蒿琥酯通过PI3K-Akt通路促进大鼠室管膜下区神经干细胞增殖的体外研究

目的 探讨青蒿琥酯(artesunate,ART)对室管膜下区(subventricular zone,SVZ)神经干细胞(neural stem cells,NSCs)增殖的影响.方法 不同浓度的ART(400 nmol/L、800 nmol/L、1.6 μmol/L、3.2 μmol/L)作用于NSCs 24 h后,采用CCK-8法检测其对NSCs增殖的影响.促增殖作用明显的800 nmol/L ART组加入10 μmol/L PI3K-Akt通路阻断剂(LY294002),采用CCK-8法检测该通路对NSCs增殖的影响;分别设置空白对照组、LY294002组、800 nmol/L ART组、800 nmol/L ART+ LY294002组,待细胞培养24h时,行Ki-67免疫荧光染色观察ART对NSCs增殖的影响及PI3K-Akt通路在其中的作用,同时采用Western blot检测各组Nestin、Akt及p-Akt蛋白的表达水平.结果 ①CCK-8法检测结果显示800 nmol/L ART组在波长450 nm处的光密度值较空白对照组明显升高,在加入LY294002后,其光密度值明显下降(P＜0.05),与空白对照组水平相当;②Ki-67免疫荧光染色结果提示800 nmol/L ART可促进NSCs增殖,LY294002可抑制这一作用;③Western blot检测结果显示:神经干细胞表面标志蛋白Nestin及p-Akt蛋白表达水平在800 nmol/L ART组明显上调,在加入LY294002后两者表达水平均下调(P＜0.05).结论 ART可在体外促进SVZ区NSCs的增殖,其机制与PI3K-Akt信号通路相关.     

蒿本内酯介导PI3K/AKT/mTOR信号通路对脑缺血再灌注损伤大鼠的神经保护机制研究

目的:探究蒿本内酯介导PI3K/AKT/mTOR信号通路对脑缺血再灌注损伤大鼠的神经保护作用机制.方法:40只大鼠随机分为假手术组、模型组、蒿本内酯组和蒿本内酯+PI3K抑制剂LY294002组,每组各10只.采用改良大脑中动脉线栓法制作大鼠缺血再灌注损伤模型,比较各组大鼠神经行为学评分、脑梗死体积比值、细胞凋亡阳性细胞数,检测脑组织中凋亡相关因子以及PI3K/AKT/mTOR信号通路的表达水平.结果:蒿本内酯组神经行为学评分、脑梗死体积比值、细胞凋亡阳性细胞数低于模型组和蒿本内酯+PI3K抑制剂LY294002组(P＜0.05);蒿本内酯组大鼠脑组织中凋亡相关因子Bcl2 mRNA水平高于模型组和蒿本内酯+PI3K抑制剂LY294002组(P＜0.05),而Bax、caspase3 mRNA水平低于模型组和蒿本内酯+PI3K抑制剂LY294002组(P＜0.05);蒿本内酯组大鼠脑组织中凋亡相关因子Bcl2蛋白及p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达高于模型组和蒿本内酯+PI3K抑制剂LY294002组(P＜0.05),Bax、caspase3蛋白表达低于模型组和蒿本内酯+PI3K抑制剂LY294002组(P＜0.05).结论:蒿本内酯可通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路来抑制神经细胞凋亡,进而发挥对脑缺血再灌注损伤大鼠的神经保护作用.     

Ghrelin对脂肪间充质干细胞神经分化的影响

目的：探讨Ghrelin联合LY294002对脂肪间充质干细胞(ADSCs)神经分化的影响,并阐明其作用机制。方法：倒置相差显微镜下观察ADSCs形态表现,流式细胞术鉴定ADSCs表面抗体阳性表达率,将第4代ADSCs分为对照组(不进行干预)、LY294002组[给予40μmol·L^-1磷酸酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B (Akt)通路特异抑制剂LY294002]、Ghrelin组(给予0.1μmol·L^-1Ghrelin)、Ghrelin+LY294002组(给予40μmol·L^-1LY294002+0.1μmol·L^-1Ghrelin)。倒置相差显微镜下观察各组ADSCs神经分化后的形态表现,免疫荧光染色法检测各组ADSCs中神经元特异性烯醇化酶(NSE)、巢蛋白(Nestin)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)阳性细胞百分率,Western blotting法检测各组ADSCs中PI3K/Akt通路蛋白表达水平,并计算磷酸化PI3K (p-PI3K)/PI3K和磷酸化Akt (p-Akt)/...     

骨桥蛋白通过PI3K/AKT/mTOR信号通路调控低氧诱导的肺动脉平滑肌细胞自噬和增殖的机制探讨

背景 骨桥蛋白(osteopontin,OPN)可参与低氧引起的血管重塑,使肺动脉压力升高。但OPN调控低氧诱导的肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs)自噬在低氧性肺动脉高压(hypoxic pulmonary hypertension,HPH)形成中的作用机制尚不明确。目的 探讨低氧条件下OPN对PASMCs增殖及通过PI3K/AKT/mTOR通路对PASMCs自噬的调控作用。方法 原代分离PASMCs,采用免疫细胞化学法进行平滑肌细胞鉴定。将细胞分为常氧对照组(Normoxia)、低氧对照组(Hypoxia)、低氧+OPN干扰空病毒组(H+OPN EV)、低氧+OPN干扰慢病毒组(H+OPN shRNA)、低氧+PI3K抑制剂LY294002组(H+LY)。各组分别用EdU阳性标记率法检测细胞增殖能力;Western blot法检测各组PASMCs中的OPN、PI3K、AKT、mTOR及自噬相关蛋白Beclin1、LC3B的表达;透射电镜、免疫荧光法观察各组PASMCs自噬情况。结果 与Normoxia组相比,...     

The research of effects and mechanism of the proliferation at myocardium microvascular endothefial cells on hypoxia-reoxygen

目的:研究缺氧复氧对大鼠心肌微血管内皮细胞(MMECs)活力的影响及机制.方法:培养大鼠MMECs,制作缺氧复氧模型模拟缺血再灌注损伤.随机分为4组(n=24),正常对照组(N组)不作任何处理、缺氧复氧组(HR组)、LY294002预先给药+缺氧复氧组(LY294002组)、PDTC预先给药+缺氧复氧组(PDTC组),均进行缺氧2h复氧2h.复氧2h时后MTT法测定细胞活力,Hoechst染色观察凋亡细胞显微结构.结果:与N组比较,HR组细胞活力降低(P＜0.01);与HR组比较,LY294002组细胞活力降低(P＜0.05),PDTC组细胞活力降低(P＜0.01);与LY294002组比较,PDTC组组细胞活力降低(P＜0.01).结论:缺氧复氧可导致MMECs活力明显降低;PI3K/Akt/NF-κB信号通路参与了缺氧复氧调控过程,该通路可促进MMECs活力增强.     

条件培养基对神经干细胞增殖与分化作用的影响

目的：观察大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）条件培养基对体外培养神经干细胞（NSCs）增殖与分化作用的影响。方法用 BMSCs 条件培养基分别在增殖与分化条件下培养 NSCs,观察 NSCs 形态变化。用 MTT 法及 NSCs 球数目和直径的统计分析了解 NSCs 增殖情况,同时行免疫荧光及 Western blot 法鉴定其分化情况。结果原代培养获得大量未分化且悬浮生长的 NSCs 球,并能分化为神经元细胞、星形胶质细胞及少突胶质细胞。BMSCs 条件培养基组能够促进 NSCs 球的吸附贴壁,但与对照组相比光密度（OD）值差异无统计学意义,NSCs 球数目和直径差异亦无统计学意义。另外,BMSCs 条件培养基组少突胶质细胞特异性蛋白MBP 表达量高于对照组（P <0.05）,星形胶质细胞特异性蛋白 GFAP 表达量低于对照组（P <0.05）,而神经元特异性蛋白 MAP-2表达量未见明显异常。结论大鼠 BMSCs 条件培养基促进 NSCs 向少突胶质细胞方向分化,但不抑制其增殖作用。     

Accutase 消化传代对人胚胎纹状体来源神经干细胞凋亡的影响

目的：观察人类胚胎纹状体来源神经干细胞(neural stem cells,NSCs)经消化酶accutase消化传代后是否 发生了大量细胞凋亡。方法：提取人13~18周自然流产胚胎脑组织纹状体的NSCs,体外形成神经球并培养至3~5 代。经消化酶accutase消化后传代,运用活性caspase-3染色、TUNEL(TdT-mediated dUTP nick end labeling)染色等方 法对多聚甲醛固定的NSCs进行凋亡检测,同时采用Annexin V和Hoechst33342/PI等联合染色方法对活细胞进行凋亡 鉴定,以确定NSCs在体外传代后的凋亡情况。结果：在传代后检测的3个时间点(1,24,72 h)中TUNEL染色和活 性caspase-3染色均高度重合。传代后1 h,TUNEL和活性caspase-3染色所检测到的凋亡率为20%~25%,传代后24 h增 高为75%~80%(P<0.01),而传代后72 h,由于存活下来的细胞开始增殖,所以整体凋亡率降为60%~70%,明显低于 24 h(P<0.01)。结论：由人类纹状体来源NSCs形成的神经球,经accutase消化传代后24 h内即发生大量细胞凋亡。对于 体外培养的NSCs,抑制其凋亡可能是促使其自我更新和增殖,最终起到提高细胞扩增能力的有效手段。     

PTX阻断溶血磷脂酸对大鼠胚胎神经干细胞的促增殖作用

目的 观察溶血磷脂酸(lysophosphtidic acid,LPA)对大鼠胚胎神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的增殖的影响以及百日咳毒素(pertussis toxin,PTX)对LPA作用的影响.方法 体外培养神经干细胞,对生成的神经干细胞球进行计数显示增殖情况.结果 ①在特殊的无血清培养液中加入低浓度LPA(0.01-1.0μmol/L)后,神经干细胞球数量呈剂量依赖性增加,表明LPA对NSCs有显著的促增殖作用;②培养液中同时加入LPA和PTX后,神经干细胞球计数显示LPA引起的NSCs的增殖被抑制了98%.结论 PTX阻断了LPA对大鼠胚胎神经干细胞的促增殖作用,从而推测LPA的促增殖作用可能主要通过PTX敏感的Gi-Ras-Raf-MAPK信号转导途径实现.     

Culture and Identification of Monoclonal Neural Stem Cells Derived from Cerebral Cortex

It is traditionally believed that that the nerve generation of central nervous system stops before or soon after birth. But studies in recent years have demonstrated that the embryonic and adult mammalian central nervous system contains neural stem cells (NSCs) which have the capa- bility of self-renewal and multi-directional differentiation. The NSCs generally exist in ependyma, subependymal region, cerebral cortex, cornu, hindbrain and spinal cord etc, and usually remain quiescent. But whe…     

神经干细胞的分离培养及超微结构研究

目的研究神经干细胞分离培养及其超微结构特征。方法从胚胎大鼠的大脑皮质、室管膜下区等神经组织分离神经干细胞，用无血清培养技术在体外进行培养、扩增和传代。采用免疫荧光技术，鉴定神经干细胞和分化的神经细胞，同时进行电镜结构观察。结果从胚胎大鼠的大脑皮质、室管膜下区等组织获得了大量神经干细胞，可自我增殖并多向分化。神经球表面呈微绒毛结构，内层细胞结合较为松散．可见凋亡小体。部分细胞分化为具有突起和轴突样结构的细胞。结论分离培养的神经干细胞具有自我增殖和多向分化潜能，并具有与功能相对应的超微形态结构。     

不同胎龄小鼠脑组织中神经干细胞所占比例的研究

目的详细了解并比较不同胎龄小鼠全脑和大脑皮层组织中神经干细胞(neural stem cells,NSCs)所占比例,为后期优化分离培养NSCs提供直接量化数据。方法分离不同胎龄小鼠全脑(胎龄12.5、14、16和18d)和大脑皮层(胎龄14、16和18 d)组织,消化成单细胞悬液,贴壁培养3~4 h,细胞免疫荧光标记NSCs特异性标记物Nestin,统计分析各组中NSCs所占比例。另外,通过实时荧光定量PCR技术检测Nestin mRNA在不同胎龄(12.5、14、16和18 d)小鼠大脑皮层中的表达水平。结果细胞免疫荧光结果显示,分离培养的不同胎龄小鼠全脑和大脑皮层组织中均有Nestin阳性细胞。在分离培养的小鼠全脑组织中胎龄12.5 d组NSCs所占比例最高,为53.42%±1.57%;胎龄18 d组NSCs所占比例最低,为25.96%±1.31%,而胎龄14 d组和16 d组位于二者之间。在分离培养的不同胎龄小鼠大脑皮层组织中,胎龄14 d组NSCs所占比例最高,为33.65%±0.29%;胎龄18d组比例最低,为25.29%±0.28%,胎龄16 d组位于二者之间(26.82%±0.30%)。实时荧光定量PCR结果显示,当把胎龄12.5 d组的小鼠大脑皮层组织中Nestin mRNA表达水平设定为1,胎龄14 d组的小鼠大脑皮层组织中Nestin mRNA的相对表达量为0.83±0.04,胎龄16 d组为0.77±0.05,胎龄18 d组为0.44±0.05。因此,随着小鼠胎龄增加,小鼠大脑皮层中的Nestin mRNA的表达水平逐渐下降。结论在小鼠大脑发育过程中,随着胎龄增加,分离培养的小鼠全脑和大脑皮层组织中神经干细胞比例逐渐降低。     

LIF对人胚神经干细胞增殖和分化的影响

目的:探讨LIF对人胚神经干细胞(NSCs)增殖和分化的影响。方法:从孕24周流产胎儿脑组织中分离NSCs,并分4组培养。对照组用基础培养液,第1,2,3实验组分别于基础培养液中加入20μg/L EGF和B27,20μg/L LIF和B27,20μg/L LIF、20μg/L EGF及B27。观察细胞生长情况并在不同时间进行细胞计数。诱导细胞分化后,显微镜下观察。结果:培养3 d细胞开始分裂并聚集成球,后逐渐增大,培养10 d,第1,2,3实验组和对照组神经球形成数分别为(21.5±7.8),(23.8±5.4),(25.2±6.3)和(24.8±6.9),各组间差异无统计学意义。分化实验显示含LIF培养的神经干细胞分化少。结论:在体外,LIF能够促进神经干细胞的增殖并抑制神经干细胞的分化。     

N-硝基-L-精氨酸对人胚胎神经干细胞增殖的作用

目的:探讨一氧化氮合酶(NOS)抑制剂N-硝基-L-精氨酸(L-NNA)对人胚胎神经干细胞的增殖作用。方法:取4月龄(120±15d)正常孕妇引产胎儿的大脑皮质组织分离细胞,用无血清的条件培养基,培养原代神经干细胞并用间接免疫荧光化学法进行鉴定。第5天时,在培养基中加入不同浓度的L-NNA,继续培养24h后,用Griess还原法检测培养液中一氧化氮含量;用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)测定细胞活力。结果:加入不同浓度L-NNA24h后,培养液中一氧化氮量随L-NNA浓度的增高而降低,且显著低于对照组(P<0.05)。MTT法显示经L-NNA作用后的神经干细胞活细胞数较对照组明显增加(P<0.05),并呈浓度相关性。结论:L-NNA对培养状态下的人胚胎神经干细胞增殖有促进作用。     

右美托咪定减轻皮质酮抑制神经干细胞的增殖作用及机制

目的：探讨右美托咪定（DEX）减轻皮质酮（CORT）抑制神经干细胞（NSCs）的增殖作用及其可能的作用机制。方法：取孕15 d SD大鼠，分离胎鼠大脑皮质培养原代NSCs，进行NSCs标志蛋白神经上皮干细胞蛋白（Nestin）和胚胎干细胞关键蛋白（SOX2）染色鉴定；RT-PCR法检测肾上腺α-2受体各亚型α-2A受体、α-2B受体及α-2C受体在NSCs上的表达；将NSCs分为Control组、DMSO组、CORT组（CORT 1 μmol/L孵育24 h）和DEX组（DEX 0.01、0.1、1 μmol/L预处理1 h后，再加入CORT继续孵育24 h）。LDH法检测NSCs的细胞毒性；EdU法检测细胞增殖能力；Western blot检测NSCs GSK-3β/β-catenin通路GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin和Cyclin D1表达水平。结果：分离的原代细胞经Nestin蛋白和SOX2蛋白染色鉴定NSCs的纯度超过97%；RT-PCR结果显示肾上腺α-2受体的3种亚型在NSCs上均有表达；LDH法显示各组之间LDH的释放量差异无统计学意义。EdU法显示与Control组比，CORT组的NSCs增殖能力显著被抑制（P＜0.05）；与CORT组相比，当DEX剂量增加至1 μmol/L时，NSCs的增殖能力有所恢复（P＜0.05）。Western blot结果表明与Control组、DMSO组比，CORT组p-GSK-3β、β-catenin、Cyclin D1蛋白的相对表达量显著下降（P＜0.05），与CORT组比，1 μmol/L DEX预处理后，p-GSK-3β、β-catenin、Cyclin D1蛋白的相对表达量有所提升（P＜0.05），Total GSK-3β蛋白在各组间的相对表达量没有明显变化；PI3K磷酸化抑制剂LY294002拮抗DEX对NSCs增殖的保护作用（P＜0.05）。结论：DEX可以减轻CORT抑制NSCs的增殖作用，其机制与GSK-3β/β-catenin信号通路有关。