胰蛋白酶消化法体外培养和鉴定人脐静脉血管内皮细胞

背景:体外建立稳定可靠的人脐静脉血管内皮细胞模型,目前培养方法缺乏统一的标准。目的:探索脐静脉内皮细胞的体外培养的方法。方法:采用2.5g/L胰蛋白酶和0.02%EDTA消化、分离、体外原代培养及消化传代脐静脉内皮细胞,简化完全培养液组分(不添加血管内皮细胞生长因子、肝素等辅助因子),当原代培养细胞80%以上汇合,根据细胞特有的形态学特征和Ⅷ因子进行内皮细胞的鉴定。结果与结论:种植在培养瓶中的内皮细胞2h贴壁生长,24h换液后内皮细胞80%融合,细胞状态好,内皮细胞呈单层铺路石样外观,经过镜下观察和Ⅷ因子相关抗原鉴定证明是脐静脉内皮细胞。证实用胰蛋白酶灌注脐静脉是一种简单、实用的获得人脐静脉血管内皮细胞的方法,可靠性大,成功率高,可以构建体外研究血管内皮细胞的模型。     

人脐静脉内皮胞细体外培养及鉴定

目的探索人脐静脉内皮细胞体外培养及鉴定的方法。方法采用0.1%Ⅰ型胶原酶分离脐静脉内皮细胞,加入含10%胎牛血清及人AB血清的M1640培养基,在37℃,5%CO2孵箱中培养,以免疫组化方法对内皮细胞进行鉴定。结果原代培养细胞在接种4 h后开始贴壁生长,5～7 d后融合成单层,倒置相差显微镜下观察细胞呈鹅卵石状排列,有接触抑制现象,免疫组化显示细胞胞浆中人Ⅷ因子相关抗原阳性。结论用胶原酶灌注消化脐静脉是获得内皮细胞的一种可靠的方法,有助于体外研究血管内皮细胞模型的构建。     

血管内皮细胞生长因子对人脐静脉间充质干细胞生长增殖的影响

背景:在体外构建组织工程材料的过程中,快速获得足够数量且纯度高的种子细胞极为重要,但目前人脐静脉间充质干细胞原代培养的增殖率仍较低.目的:观察血管内皮细胞生长因子对人脐静脉间充质干细胞原代生长、增殖的影响.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008 03/07在辽宁医学院解剖学实验室完成.材料:正常健康产妇顺产或剖宫产的新生儿脐带20条,由锦州市凌河区妇幼保健院及辽宁医学院附属第一医院提供.方法:采用胶原酶消化法分离人脐静脉间充质干细胞,以1×105L-1的密度接种于24孔培养板,设立2组,实验组加入150 g/L 血管内皮细胞生长因子,对照组不加入任何细胞因子.主要观察指标:观察细胞形态变化,MTT法检测细胞生长曲线,免疫细胞化学法鉴定细胞CD166的表达.结果:接种后6 h细胞开始贴壁,48 h后细胞完全贴壁生长,出现呈椭圆形、多角形的内皮细胞,以及呈梭形的成纤维样细胞,有的形成漩涡状生长集落;原代培养1周后细胞以梭形为主;传代后24 h细胞基本完成贴壁,48 h细胞开始分裂增殖,5～7 d可见多核的成纤维样细胞贴壁,呈长杆状、三角形、梭形等.与对照组比较,实验组细胞生长状态较好,增殖较快,单位时间内获得的细胞数量明显增加(t=2.235,P＜0.05),CD166阳性细胞率显著升高(t=-1.638,P＜0.01).结论:血管内皮细胞生长因子可促进入脐静脉间充质干细胞贴壁,且更有利于间充质干细胞的增殖和纯化.     

人脐静脉内皮细胞体外培养、鉴定与形态学特征观察

目的：建立人血管内皮细胞的培养模型，为体外研究动脉硬化发病机制提供重要的实验手段。方法：采用1．25g／L胰蛋白酶(2．5g／L胰蛋白酶：0．2g／LEDTA：1：1V／V)消化、分离和传代人脐静脉内皮细胞，并用光镜、电镜和免疫组化等方法进行内皮细胞的形态观察和鉴定。结果：原代培养的内皮细胞在接种后约2h开始贴壁生长，光镜下内皮细胞呈铺路石状镶嵌排列；免疫组化可见内皮细胞胞浆中人第Ⅷ因子相关抗原呈阳性反应；电镜下可见胞浆中有W-P小体，证实培养的细胞为内皮细胞。结论：用胰酶灌注消化脐静脉可获得高纯度的内皮细胞，细胞存活率高。本方法为血管内皮细胞的研究提供了实验模型。     

人脐静脉内皮细胞体外培养、鉴定与形态学特征观察

目的:建立人血管内皮细胞的培养模型,为体外研究动脉硬化发病机制提供重要的实验手段。方法:采用1.25g/L胰蛋白酶(2.5g/L胰蛋白酶:0.2g/LEDTA=1∶1V/V)消化、分离和传代人脐静脉内皮细胞,并用光镜、电镜和免疫组化等方法进行内皮细胞的形态观察和鉴定。结果:原代培养的内皮细胞在接种后约2h开始贴壁生长,光镜下内皮细胞呈铺路石状镶嵌排列;免疫组化可见内皮细胞胞浆中人第VIII因子相关抗原呈阳性反应;电镜下可见胞浆中有W-P小体,证实培养的细胞为内皮细胞。结论:用胰酶灌注消化脐静脉可获得高纯度的内皮细胞,细胞存活率高。本方法为血管内皮细胞的研究提供了实验模型。     

外加直流电场对内皮细胞增殖与迁徙的影响

背景:已有研究证明,电刺激可以引起内皮细胞的增殖、趋阴迁徙,同时伴随细胞分泌物释放的增加,从而调节血管张力和血管平滑肌细胞的生长,介导血管收缩和舒张.目的:观察外加直流电场对人脐静脉内皮细胞HY926增殖和迁徙的影响.方法:MTT法检测在外加电压3,5, 8,10 V作用12 h后人脐静脉内皮HY926细胞的增殖情况.并选择内皮细胞增殖最佳的外加电压5 V,在5 V外加电压作用10 h内追踪人脐静脉内皮HY926细胞的运动轨迹,包括细胞的平均累计移行距离和平均移行速率,细胞的平均最终位移大小及其方向,以及所有单个细胞每小时的平均追踪sine值.结果与结论:在外加电压3,5,8,10 V下作用12 h,人脐静脉内皮细胞生长均受到不同程度的抑制,但在外加电压5 V,电场强度163.46 mV/cm时内皮细胞增殖情况最好.在该生理电场下培养72 h,发现细胞生长贴壁生长、增殖正常,初步说明该生物反应器的细胞相容性良好,并且随时间的延长,内皮细胞的平均移行速率呈下降趋势.在5 V外加电压作用10 h后,内皮细胞整体明显持续朝向阴极方向迁徙.提示外加直流电场对人脐静脉内皮细胞增殖有显著的抑制作用,并且可诱导细胞定向向阴极迁徙.     

高糖对人脐静脉内皮细胞c-Jun表达影响

目的:观察高糖对人脐静脉内皮细胞c-Jun表达的影响.方法:提取、分离人脐静脉内皮细胞,体外培养至第3代,分别用5.5,11.0,22.0,44.0 mmol/L葡萄糖培养液培养内皮细胞,并设22.0 mmol/L 甘露醇培养液培养者为对照组.以22.0 mmol/L葡萄糖分别作用0,0.5,1.0,2.0 h,应用RT-PCR和免疫细胞化学方法检测c-Jun mRNA和蛋白表达水平.结果:高搪以浓度依赖方式上调人脐静脉内皮细胞c-Jun mRNA的表达,22.0 mmol/L葡萄糖达到最强刺激效应,与5.5 mmol/L 葡萄糖组及对照组比较差异均有统计学意义(P<0.01).22.0 mmol/L葡萄糖刺激0.5 h c-JunmRNA表达升高,刺激1.0 h达高峰,2.0 h开始下降.22.0 mmol/L葡萄糖刺激2 h后,人脐静脉内皮c-Jun蛋白表达增加.结论:高糖可上调人脐静脉内皮细胞c-Jun mRNA和蛋白表达.     

蜂胶乔松素对脂多糖诱导人脐静脉内皮细胞的保护作用

目的:观察蜂胶乔松素对脂多糖诱导人脐静脉内皮细胞的影响,探讨其对人脐静脉内皮细胞可能的保护作用。方法:实验于2006-03/10在泰山医学院生命科学研究所(省重点实验室)完成。①实验材料:取出生1h内新生儿脐带,患者知情同意。②实验分组及方法:培养人脐静脉内皮细胞,建立脂多糖损伤模型(以10mg/L的脂多糖培养液培养细胞12h),实验分为空白对照组(加等量D-Hank’s液)、脂多糖组(10mg/L)、乔松素组(加10mg/L脂多糖预孵育12h后,按50,100,200mg/L分别加入乔松素),各组设8个复孔,共同孵育24h。③实验评估:光镜下观察细胞形态,MTT法观察乔松素对人脐静脉内皮细胞活性的影响,ELISA方法检测培养上清中血管假血友病因子的含量,TUNEL检测细胞凋亡率。结果:①细胞形态:空白对照组细胞紧密贴壁,呈铺路石状生长。脂多糖组可见多数细胞呈圆形;乔松素组见上述细胞较脂多糖组明显减少。②乔松素对人脐静脉内皮细胞活性、凋亡及血管假血友病因子含量的影响:与对照组比较,脂多糖组能明显诱导人脐静脉内皮细胞的凋亡(P<0.01),不同浓度乔松素组可改善内皮细胞形态,组织活性明显升高(P<0.05),同时抑制内皮细胞血管假血友病因子的释放(P<0.05),使脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡细胞数明显减少(P<0.05)。结论:乔松素能增强人脐静脉内皮细胞活性,抑制脂多糖诱导人脐静脉内皮细胞的凋亡,从而发挥可能的内皮细胞保护功能。     

搏动信号对人脐静脉内皮细胞一氧化氮合成酶表达的影响

目的:观察搏动信号对人脐静脉内皮细胞中反映内皮细胞活性的内皮型一氧化氮合酶mRNA表达的影响。方法:实验于2004-06/2005-03在湘雅二医院心胸外科生物材料研究室和上海生物工程有限公司进行。将取自剖宫产产妇自愿捐献的无菌脐带的人脐静脉内皮细胞培养、传代,传4代后分为两组:①搏动培养组:先静放6～8h待细胞贴壁后,用自行设计的细胞搏动培养装置,进行搏动培养。搏动参数:搏动频率150次/min,搏出量0.3mL/次,搏动产生的压力30/9mmHg(1mmHg=0.133kPa)。②静态培养组:不进行搏动,其余条件同搏动培养组。每组每个时间点5个样本。用反转录-聚合酶链反应方法,分别在第1,2,4,6,9,12,15,18天检测两组的人脐静脉内皮细胞的内皮型一氧化氮合酶mRNA的表达水平(相对吸光度值)。结果:人脐静脉内皮细胞的内皮型一氧化氮合酶mRNA表达:①培养第1,4天,静态培养组明显高于搏动培养组(1.0±0.55比1.10±0.35;1.17±0.23比1.42±0.44,P<0.05)。②培养第2天两组比较差异不显著(1.16±0.18比1.25±0.35,P>0.05)。③培养第6,9,12,15,18天,搏动培养组明显高于静态培养组(1.52±0.14比1.27±0.30;1.60±0.19比1.16±0.33;1.68±0.44比0.99±0.31;1.7±0.24比1.1±0.94;1.7±0.16比1.0±0.28,P<0.05)。结论:搏动信号能提高人脐静脉内皮细胞的内皮型一氧化氮合酶的表达。提示搏动信号在维持细胞发挥正常的生理功能方面起到重要的作用,能增强细胞的生物活性。     

人脐静脉血管内皮细胞分离与原代培养体会

目的:探讨分离人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)和原代培养的可靠方法与经验.方法:利用0.1%胶原酶消化、分离、体外原代培养脐静脉血管内皮细胞,0.125%胰酶-0.02%EDTA溶液消化传代,根据细胞特有的形态学特征和Ⅷ因子、CD31细胞免疫组化及对乙酰化LDL高摄取试验进行内皮细胞鉴定.结果:脐静脉血管内皮细胞的体外原代培养、传代生长均良好,呈典型的铺路石样形态学表现,Ⅷ因子、CD31细胞免疫组化显示阳性反应,及Dil-Ac-LDL摄取荧光检测提示其具有强摄取能力,从而鉴定为血管内皮细胞.结论:本方法获得的HUVEC量多,方法简单、可靠,为血管内皮细胞的研究提供实验模型.