河北省2010—2020年甲型H3N2流感病毒HA基因抗原漂移分析

目的分析河北省甲型H3N2流感病毒HA基因进化分支分布及抗原位点变异特征。方法依据不同流行年度不同地区分布选取46株河北省H3N2毒株, MEGA建立HA基因进化树, BioEdit比对核苷酸和氨基酸序列在抗原决定簇及潜在糖基化位点变异情况, 对2019—2020年流行3C.2a1b+T135K和3C.2a1b+T131K亚组同源建模, 分析突变位点构象差异。结果河北省甲型H3N2流感病毒经历1和5簇(2010—2011), 自2012年春季步入3C簇, 3C-2012/13、3C.3和3C.3a分支在2013—2014年迭代流行, 2014—2017年3C.3a分支均有覆盖, 2015—2016流行年度的3C.2a1分化出2017—2020年优势流行株3C.2a1b+T131K和3C.2a1b+T135K。病毒HA蛋白抗原决定簇A、B、C、D和E均有氨基酸突变, 突变类型包括稳定保留、多样突变和特征突变, 通过建模分析比较3C.2a1b+T135K和3C.2a1b+T131K两个亚组HA蛋白抗原表位空间构象, 50、128、131、135、138和193位点空间结构差异可能导致病毒抗...     

甲型流感病毒H3N2抗原进化研究进展

流感病毒是引起人类呼吸道感染的常见病原体。在4种季节性流感毒株中, 甲型流感病毒H3N2感染已成为季节性流感疾病和死亡的主要原因, 严重影响公共卫生和社会经济。自1968年首次出现并造成大流行后, H3N2一直在人群中反复流行, 不断通过抗原漂移来逃避宿主免疫系统的攻击, 从而导致低疫苗效力。本文从甲型流感病毒H3N2的抗原进化、抗原进化对疫苗株选择的影响及一些预测流感病毒进化的模型等方面进行分析和综述, 为流感病毒抗原进化分析和未来疫苗研发等工作提供参考。     

2021—2022年流感监测季北京市乙型Victoria系流感病毒血凝素基因特性和抗原性分析

目的分析2021—2022年流感监测季北京市乙型Victoria系流感病毒(BV)的血凝素(hemagglutinin, HA)基因特性、抗原性及与流感疫苗组分株的匹配性。方法采集2021—2022年流感监测季流感样病例(influenza like-illness, ILI)咽拭子样本经MDCK和鸡胚培养分离流感病毒, 提取病毒核酸后测序。应用MEGA5.0进行病毒HA基因的核苷酸和氨基酸变异, 采用maximum likelihood方法构建HA基因的遗传进化树, 在线预测N-糖基化位点。SWISS-MODEL同源建模, 建立BV毒株HA的蛋白质三维空间模拟图。通过血凝抑制(hemagglutination inhibition, HI)试验, 进行毒株的抗原性分析。结果共收集402株BV毒株, 选取58株测序获得HA基因全长序列, 与本年度的疫苗组分BV株(B/Washington/02/2019)HA基因相比较显示, 有27个氨基酸位点发生变异, 其中11个变异位点位于4个不同的抗原决定簇。遗传进化树分析显示:3个进化分支的毒株共同流行, 其中54株(54/58, 93.10%...     

9株甲型肝炎病毒流行株全基因组特征分析

目的 分析四川南充和新疆和田甲型肝炎病毒(hepatitis A virus, HAV)分离株全基因组序列特征。方法 收集2006年四川南充同1起暴发的3份和2016年新疆和田6份急性期甲肝患者血清标本,通过核酸提取、逆转录、分段巢式PCR、测序和序列拼接获得9条HAV全基因组序列。利用生物信息学软件进行系统进化、抗原中和位点、重组和选择压力分析。结果 VP1-2A连接区基因分型表明9条HAV序列都属于IA亚型,分为4个不同的分支,其中3条南充序列和3条和田序列属于同一分支;全基因组序列表明,3条南充序列核苷酸和氨基酸同源性分别为99.99%～100%和100%,与3条和田序列全基因组核苷酸和氨基酸差异分别为0.50%～0.57%和0.08%～0.17%。9条HAV全基因组核苷酸和氨基酸同源性分别为98.29%～100%和99.62%～100%,与我国hd9和蒙古MNA12-001关系最近(核苷酸和氨基酸同源性分别为：与hd9 98.60%～99.50%和99.75%～99.92%;与MNA12-001 98.45%～99.32%和99.71%～99.87%)。9条HAV序列在已发表的...     

不同层析介质纯化H5N1型流感病毒的研究

目的分别用新型复合层析介质Capto Core700和传统分子筛介质Sepharose 4FF纯化MDCK细胞制备的H5N1型流感病毒浓缩液, 并比较分离纯化效果。方法用Capto Core700与Sepharose 4FF纯化灭活H5N1型流感病毒浓缩液, 透射电镜分析不同样品中病毒颗粒的形态;分别用单向免疫扩散法(single radial immunodiffusion, SRID)、福林酚法(Lowry法)、双抗体夹心ELISA、qPCR检测不同层析介质纯化前后病毒血凝素含量、总蛋白质含量、宿主细胞蛋白质(host cell protein, HCP)含量和宿主细胞DNA(host cell DNA, HCD)含量, 计算病毒抗原回收率和杂质去除率;用动物实验检测不同纯化病毒的免疫原性, 并用t检验分析两种层析介质纯化效果差异。结果 Capto Core700与Sepharose 4FF纯化的H5N1型流感病毒在透射电镜下均呈典型的流感病毒形态;两种层析介质纯化后病毒血凝素回收率差异无统计学意义(P>0.05), 但前者的杂质(总蛋白质、HCP、HCD)去除率均高于后者,...     

新型冠状病毒和甲型流感病毒双价疫苗研究进展

新型冠状病毒及其变异株在世界范围内的持续蔓延, 对全球经济和公共卫生造成了严重威胁。同属于呼吸道病毒的甲型流感病毒是流感的主要病原体, 其宿主范围广泛, 易发生变异, 每20～40年暴发一次的流感大流行、每年的季节性流感、重症流感或动物流感病毒都严重威胁公众健康。以上两种病原感染后的临床症状极为相似。针对这两种呼吸道疾病的交替流行或共同感染, 开发有效的双价疫苗具有重要意义。本综述主要介绍基于不同平台的新型冠状病毒和甲型流感病毒双价疫苗的研发进展。     

甲型流感病毒血凝素头部蛋白结构域的原核表达及血清学分析

目的在原核系统中表达流感病毒血凝素(hemagglutinin, HA)头部蛋白并进行血清学分析。方法将H1N1和H3N2型流感病毒的HA头部蛋白编码基因克隆到pET-22b(+)原核表达质粒中, 通过IPTG诱导, 在大肠埃希菌BL21中获得含有HA头部与His-Tag的融合蛋白rH1N1-HA和rH3N2-HA。SDS-PAGE分析IPTG诱导前后的融合蛋白, 验证表达的准确性, Western blot验证重组蛋白的表达。纯化重组蛋白, 多剂次免疫家兔, 获得针对H1N1-HA和H3N2-HA头部的多克隆抗体。同时, 重组蛋白免疫BALB/c小鼠, 评价其免疫原性。结果 rH1N1-HA和rH3N2-HA蛋白在小鼠体内诱导了滴度高于40的血凝抑制抗体, 可作为一种保护性抗原。rH1N1-HA和rH3N2-HA蛋白制备的多克隆抗体, 可作为Western blot、ELISA等免疫学应用的重要材料。结论本研究制备的HA头部蛋白可作为一种保护性抗原, 在小鼠体内诱导保护性抗体。HA头部制备的多克隆抗体, 可用于甲型流感病毒的免疫学和血清学研究。     

靶向甲型流感病毒N1亚型神经氨酸酶抗体的制备及鉴定

目的制备1株靶向甲型流感病毒N1亚型神经氨酸酶(neuraminidase, NA)的功能性抗体FNA1, 并对其进行鉴定。方法依据单链抗体(single-chain antibody fragment, scFv)序列信息, 合成FNA1重链以及轻链可变区序列, 连入抗体哺乳细胞表达载体pFRT-IgG1κ, 构建重组表达质粒pFRT-IgG1κ-FNA1。利用瞬时高效表达系统ExpiCHO以及亲和纯化技术获取抗体蛋白FNA1。ELISA检测FNA1与甲型流感病毒N1亚型NA抗原的结合, 流式细胞术分析FNA1与细胞膜表面表达N1亚型NA抗原的结合。通过抗体抑制NA蛋白活性试验检测抗体FNA1的体外功能活性。结果蛋白质电泳结果显示制备获取了高纯度FNA1。FNA1特异性识别结合N1亚型的NA抗原, 且呈浓度依赖效应。FNA1能通过结合细胞膜表面表达的N1亚型NA蛋白, 有效阻断细胞膜表面的NA活性, 从而抑制包装的假病毒从细胞表面释放, 继而抑制进一步的靶细胞感染。结论获得1株具有体外功能活性的靶向甲型流感病毒N1亚型NA蛋白的抗体FNA1。     

一例结节性硬化症新生儿的 TSC2基因变异分析

目的分析一例结节性硬化症(tuberous sclerosis complex, TSC)新生儿的临床特点及遗传学特征。方法采集1例以发色黄为首发表现的新生儿及其父母的外周血样, 提取DNA进行基因高通量测序分析。结果基因测序显示患儿TSC2基因第33外显子存在c.3914del(p.P1305Rfs*20)杂合变异, 该变异为移码变异, 可导致多肽链合成提前终止。结论本例TSC新生儿以发色黄为首发表现, 既往未见报道。TSC2基因第33外显子c.3914del(p.P1305Rfs * 20)杂合变异可能为该患儿的致病原因。上述发现丰富了TSC2基因的变异谱。     

Schaaf-Yang综合征患儿1例的临床与遗传学分析

目的探讨1例Schaaf-Yang综合征(SYS)患儿的临床特征与遗传学病因。方法选取2020年11月30日于华中科技大学同济医学院附属武汉儿童医院就诊的1例SYS患儿为研究对象。抽取患儿及其父母外周静脉血样, 应用全外显子组测序对患儿进行基因检测, 采用Sanger测序进行家系验证, 并对候选变异进行生物信息学分析。结果①本例患儿为男性, 1岁9个月, 具有发育迟滞、阴茎短小、特殊面容等临床表现。②基因检测结果提示, 患儿MAGEL2基因存在c.3078dupG(p.Leu1027Valfs*28)新发杂合变异, Sanger测序结果显示患儿父母均未携带该变异, 提示为新发变异。③MAGEL2基因c.3078dupG(p.Leu1027Valfs*28)变异在ESP、1000 Genomes与ExAC等数据库中均未见收载, 根据美国医学遗传学与基因组学学会(ACMG)制定的《ACMG遗传变异分类标准与指南》, 该变异被评级为致病性变异。结论 MAGEL2基因c.3078dupG(p.Leu1027Valfs*28)变异可能为本例SYS患儿的遗传学病因, 进一步拓展了MAGEL2基因变...     

2016—2019年深圳市盐田区甲型H1N1流感病毒NA基因特征研究

目的分析深圳市盐田区2016—2019监测年度甲型H1N1流感病毒NA基因特征。方法选取35株盐田区分离的甲型H1N1流感病毒毒株进行NA基因序列分析、进化分析、抗原决定簇位点、耐药位点和糖基化改变的变异分析。结果进化树分析表明, 本研究所分析毒株分布在6B分支, 2016年上半年毒株分布在6B.2簇;2016年下半年及2017年度毒株分布在6B.1簇;2018—2019年度毒株分布在6B.1A簇。2016年核苷酸同源性为97.87%～98.09%, 氨基酸同源性为96.85%～96.89%, 2016年毒株与同年度疫苗株位于不同分支, 同源性较低。2017年核苷酸同源性为98.62%～99.35%, 氨基酸同源性为99.57%～99.78%;2018年核苷酸同源性为99.35%～99.86%, 氨基酸同源性为99.05%～99.12%;2019年核苷酸同源性为99.20%～99.86%, 氨基酸同源性为99.19%～99.78%。2017—2019年毒株与当年度疫苗株位于同一分支, 同源性较高。与各年度疫苗株相比, 盐田区流感毒株NA蛋白存在29个氨基酸位点变异。抗原决定簇区域:与疫...     

难治性癫痫患儿的基因变异特征分析

目的分析不同年龄段难治性癫痫(RE)患儿的基因变异特征, 为精准诊疗提供一定的数据支撑。方法选取2018年1月1日至2019年11月21日于浙江大学医学院附属金华医院就诊的117例RE患儿为研究对象, 根据发病年龄分为<1岁、1～<3岁、3～<12岁和≥12岁4组。回顾性分析患儿的临床资料、全外显子组测序数据、携带基因变异患儿的父母测序结果等资料。结果本研究纳入RE患者共117例, 其中男性67例, 女性50例。发病年龄范围为4日龄～14岁。117例RE患儿中, 33例携带致病性或可能致病性变异, 检出率为28.21%(33/117)。<1岁组、1～<3岁组和≥3岁组的检出率分别为53.85%(21/39)、12.00%(3/25)和16.98%(9/53), 差异有统计学意义(χ2=19.202, P<0.001)。有、无共患病患儿的检出率分别为33.33%(12/36)和25.93%(21/81), 差异无统计学意义(χ2=0.359, P=0.549)。33例携带基因变异患儿中, 27例为单核苷酸多态性变异(SNV)或插入缺失(InDel)变异...     

新型冠状病毒和甲型流感病毒双价DNA疫苗的构建与免疫原性研究

目的构建新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)和甲型流感病毒双价DNA疫苗, 并在小鼠模型中评价其免疫原性。方法将SARS-CoV-2 Beta突变株S1蛋白编码序列和甲型流感病毒Cambodia (H3N2)株HA蛋白编码序列进行密码子优化合成, 采用Over-lapping PCR方法, 将两个编码基因通过自裂解2A肽(self-cleaving 2A peptides)序列连接成S1-2A-HA片段, 构建能同时表达S1蛋白和HA蛋白的双价DNA疫苗, 命名为pVRC-S1-2A-HA, 间接免疫荧光和Western blot验证S1蛋白和HA蛋白的表达。将DNA疫苗以肌肉注射加电转途径(IM+EP)免疫BALB/c小鼠, 间接ELISA、假病毒中和试验和血凝抑制试验检测小鼠体液免疫应答, IFN-γ ELISPOT、胞内细胞因子染色(intracellular cytokine staining, ICS)和CBA法检测小鼠细胞免疫应答。结果双价DNA疫苗pVRC-S1-2A-HA可...     

2009-2011年广东省甲型H1N1流感病毒血凝素基因的进化特征

目的 了解2009-2011年广东甲型H1N1流感病毒血凝素基因的HA1进化特征。方法 选取广东甲型H1N1流感病毒83株,提取病毒RNA,经RT-PCR反应扩增HA1并测序,测定的序列用生物信息软件分析,与GenBank中相关序列比较,并对推导的编码氨基酸序列进行进化分析。结果 2009-2011年广东甲型H1N1流感病毒HA1基因的进化速率是5.2× 10-3,高于人季节性H1N1病毒;变异氨基酸多数位于HA蛋白表面,其中部分位于抗原决定簇;在两例死亡病例分离株HA1的第222位氨基酸发生D222G/D222N变异。结论 遗传进化分析表明,甲型H1N1流感病毒发生了一定程度的变异,造成2011年初在广东的再次流行。HA1的第222位氨基酸变异可能与疾病的严重程度有关。     

唐山市甲型H1N1流感病毒血凝素基因序列分析

目的 分析2010—2016年唐山市甲型H1N1流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)基因序列进化特征.方法 选取唐山市3家哨点医院流感样病例分离到的24株甲型H1N1病毒,通过RT-PCR和测序方法获得HA基因的全长序列,运用分子生物学软件和统计学软件对序列进行拼接、比对和分析.结果 同源进化分析显示,24株甲型H1N1流感病毒HA基因与疫苗株A/California/7/2009的核苷酸和氨基酸的同源性分别为97.0%~99.0%和97.0%~98.5%.进化分析显示,2010—2016年唐山地区流行的甲型H1N1流感病毒属于1、7、6三个基因分支,其中6分支毒株分为6C、6B、6B.1和6B.2亚支.氨基酸位点分析显示,不同毒株与疫苗株比较存在8~16处氨基酸位点改变,其中7个变异涉及3个抗原表位:H138Q/Y和S203T突变位于Ca区,N125S、K153E、S162N、K163T/Q突变位于Sa区,S185T突变位于Sb区同时也位于受体结合部位;2015—2016流行季6B.1分支毒株抗原位点S162N突变增加了新的潜在糖基化位点.结论 与疫苗株比较,随着时间推移唐山地区甲型H1N1流感病毒发生了抗原漂变,未来仍应关注6B分支流行株的变化.     

北京市通州区外环境禽流感病毒的流行分布及基因特征分析

目的通过对2021—2022年北京市通州区农贸市场的外环境及相关人员标本的禽流感病毒检测结果及基因特征分析, 为我市禽流感防控策略提供依据。方法 2021—2022年共采集外环境及食品涂抹标本2 184例, 相关人员咽拭子标本124例。利用实时荧光RT-PCR法对标本进行核酸检测, 采用illumina二代测序平台对病毒载量高的阳性标本进行全基因组测序, 分析其基因特征。结果实时荧光RT-PCR核酸检测结果显示, 外环境及食品涂抹标本检出2例H5N8阳性、78例H7N9阳性、177例H9N2阳性、2例H5N8和H9N2共感染、1例H7N9和H9N2共感染, 124例人员标本检测结果均为阴性。对病毒载量高的阳性标本进行全基因组测序分析, 1例H5N8病毒的HA基因属于为2.3.4.4分支, HA基因的HA0裂解位点序列为多个连续性碱性氨基酸(REKRRKR/ GLF), 2例H7N9病毒的HA基因与Yangtza river delta属于同一分支, HA基因的HA0裂解位点序列为多个连续性碱性氨基酸(VPKRKRTAR/GLF), 均属于高致病性禽流感病毒。遗传进化树分析提示, H5N...     

一个颈动脉体瘤家系的基因变异研究

目的对1个颈动脉体瘤家系进行变异检测,明确其病因。方法对家系成员进行查体、彩超检查、CT扫描,对先证者进行外显子组测序,再用Sanger测序进行验证,对候选变异进行功能预测,并在家系成员中进行验证。结果先证者携带SDHD基因第3外显子剪接区c.170-1G>T杂合变异,15个家系成员携带致病变异,其中6人已死于心脑血管病,现存9人均已发生颈动脉体瘤、高血压。本家系符合常染色体显性遗传规律。结论 SDHD基因c.170-1G>T杂合变异可能是导致本家系发病的原因,颈动脉体瘤患者除了常规临床检查还应进行基因诊断。     

中国人群Waardenburg综合征的临床及基因变异特点分析

Waardenburg综合征(Waardenburg syndrome, WS)是一种较为罕见的遗传病, 又称听觉-色素综合征, 呈常染色体显性或隐性遗传。在中国人群中WS的致病基因主要包括PAX3、MITF、SOX10和EDNRB。本文对中国人群WS相关的基因变异、分子机制及研究现状做一综述。     

一例先天性肾性尿崩症新生儿的 AVPR2基因变异分析

目的对1例新生儿期诊断的先天性肾性尿崩症患者及其父母进行AVPR2基因的变异检测。方法收集患儿的临床资料, 采集患儿及其父母的外周血样, 提取基因组DNA, 用PCR扩增AVPR2基因的全部编码区并进行Sanger测序。结果患儿出生后不久即出现反复发热、多尿、血钠增高。B超随访提示患儿存在一过性肾积水和输尿管扩张, 用氢氯噻嗪治疗部分有效。DNA测序发现患儿及其母亲均携带AVPR2基因第2外显子c.890-899delACCCGGAGGC大片段缺失移码变异, 既往未见报道。结论 AVPR2基因第2外显子c.890-899delACCCGGAGGC大片段缺失移码变异可能是患儿先天性肾性尿崩症的病因。