携带融合基因CTLA4-Ig重组腺病毒载体的构建及表达

目的　为进行基因转移阻断T细胞共刺激通路诱导移植免疫耐受的研究 ,构建携带融合基因CTLA4 Ig的重组腺病毒载体。方法　构建含人CTLA4 Ig的重组腺病毒载体质粒pShuttle Tracker CMV CTLA4 Ig ,与腺病毒骨架质粒 pAdEasy 1 △E1、△E3共转化大肠杆菌BJ5 183 ,经细菌内同源重组 ,获得重组腺病毒质粒pAd Tracker CTLA4 Ig ,转染 2 93细胞 ,制备携带CTLA4 Ig的重组腺病毒 ,体外感染L O2细胞 72h后ELISA检测其外分泌性表达。 结果　获得携带CTLA4 Ig的重组腺病毒 ,滴度为 6× 10 1 3 PFU L ;在其感染的L O2细胞培养上清中能检测到可溶性重组蛋白CTLA4 Ig的表达 (P N =4.6 ,阳性 )。结论　制备的重组腺病毒在体外能有效感染L O2细胞 ,受感染细胞能表达、分泌可溶性的融合蛋白CTLA4 Ig ;为进行体内移植免疫耐受的基因治疗研究奠定基础。     

hTERT启动子调控的腺病毒载体的构建及在前列腺癌细胞中的表达

目的　构建人端粒酶逆转录酶 (hTERT )启动子调控的表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的腺病毒系统 ,并研究其在前列腺癌细胞株PC 3中的表达。方法　构建带有hTERT启动子的腺病毒穿梭载体pDC3 15 Tp EGFP ,细胞重组技术获得腺病毒AdhTERT EGFP ,体外转染PC 3及人胚肺成纤维细胞株MRC 5 ,通过RT PCR和倒置荧光显微镜分别在mRNA和蛋白质水平检测EGFP的表达。带有小鼠巨细胞病毒 (mCMV)启动子的腺病毒Ad EGFP作为阳性对照。结果　成功构建出腺病毒AdhTERT EGFP ,滴度为 4.2× 10 9空斑形成单位 (pfu) /ml,分别转染PC 3和MRC 5 ,前者表达EGFP的阳性细胞数为 (66.4% 3 .3 ) % ,而后者不表达EGFP(P <0 .0 1) ;对照病毒Ad EGFP在PC 3和MRC 5中分别有 (88.1± 2 .2 ) %及 (89.2± 3 .1) %的细胞表达EGFP ,两者表达量差异无统计学意义。结论　该腺病毒系统中hTERT启动子调控下游基因可选择性地在前列腺肿瘤细胞中表达 ,在正常细胞中不表达 ,具有明显的靶向性。     

突变型低氧诱导因子-1α腺病毒载体的构建及常氧表达

目的 为了在常氧条件下观察低氧诱导因子-1α( HIF-1 α)在骨缺损部位促新血管生成作用,构建能够同时表达突变型HIF-1α和人源化绿色荧光蛋白(hrGFP)的腺病毒载体并检测其在兔骨髓间充质干细胞(MSCs)中的表达。方法 利用聚合酶链式反应(PCR)定点突变人HIF-1α编码区(CDS)第402、564和803位氨基酸,将突变后HIF-1α和hrGFP重组入pAdEasy-1系统,包装病毒并测定滴度。以感染复数(MOI)=100将腺病毒转染MSCs,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot方法检测转染细胞中HIF-1αmRNA和蛋白表达。结果 (1)第402、564和803位氨基酸均定点突变为丙氨酸。(2)A、B两组HIF-1α mRNA表达量明显高于C、D两组,差异有统计学意义(P＜0.01);A组HIF-1α蛋白表达量明显高于其他3组,差异有统计学意义(P＜0.01)。结论 (1)腺病毒载体Ad-HIF-1 αmu-IRES-hrGFP-1构建成功。(2)突变后HIF-1α基因能够在常氧条件下大量且高效表达。     

携带人VEGF_(165)和ANG-1双基因的腺病毒载体的构建及目的基因的表达

[目的]构建并鉴定携带人血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)和血管生成素-1(ANG-1)双基因共表达重组腺病毒载体pAd-VIA。[方法]采用基因克隆技术克隆目的基因VEGF165、ANG-1基因,将得到的基因通过引入内部核糖体进入位点序列(IRES),亚克隆至含有报告基因EGFP的穿梭载体pTrack-CMV中,构建携带双基因的腺病毒穿梭载体pTrack-CMV-VIA。进而使用AdEasyTM腺病毒系统重组并包装腺病毒。通过绿色荧光蛋白(GFP)表达、酶联免疫吸附分析(ELISA)方法检测制备的腺病毒pAd-VIA感染的大鼠骨髓基质干细胞中外源基因VEGF165及Ang-1的表达。[结果]该重组腺病毒质粒经测序、酶切鉴定,证明基因序列正确。转染QBI-293A细胞后,可观察到GFP明显表达。重组合腺病毒载体pAd-VIA获得成功包装,扩增后病毒滴度为2×1010PFU/ml,大鼠骨髓基质干细胞转染48 h后,绿色荧光蛋白表达阳性,ELISA结果显示转染组在感染48 h后,培养细胞上清中的VEGF165浓度为(42.5±2.082)ng/105细胞,ANG-1浓度为(16.67±2.08)ng/105细胞,未转染组几乎未检测到外源基因的表达,有统计学差异(P0.05)。[结论]成功构建携带人VEGF165、ANG-1双基因共表达重组腺病毒载体,为组织工程人工骨血管化的研究奠定基础。     

前列腺特异性膜抗原启动子增强子调控重组质粒的构建及鉴定

目的探讨前列腺特异性膜抗原(PSMA)启动子和增强子调控目的基因表达的前列腺细胞特异性，了解增强子增强转录效率的能力。方法采用PCR方法从前列腺癌细胞DNA中分别扩增PSMA启动子和增强子序列，先后克隆到含有报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的质粒载体，脂质体介导基因转染不同癌细胞并观察GFP在不同细胞的表达情况。结果成功构建质粒pEGFP—PS—MAPro和pEGFP-PSMAEP，转染结果显示PSMA表达阳性的LNCaP细胞中存在GFP的有效表达，且pEGFP—PSMAEP的调控转录能力较pEGFP—PSMAPro强20倍。结论PSMA启动子增强子调控GFP表达的重组质粒的构建证明该调控序列具有前列腺细胞特异性，增强子能够明显增强启动子的转录效率，增加了目的基因的表达水平。PSMA启动子和增强子的共调控可以保证基因表达的强度和细胞特异性，为前列腺癌基因靶向性治疗研究提供实验依据。     

人IL-1受体拮抗蛋白重组逆转录病毒载体的构建、鉴定及在骨关节炎软骨细胞中的表达

目的 构建含人IL-1受体拮抗蛋白(IL-1 receptor antagonist, IL-1Ra)逆转录病毒表达载体(PLXRN-IL-1Ra),体外转染人骨关节炎(osteoarthritis, OA)软骨细胞,研究其相关特性.方法 利用细菌内同源重组技术快速构建PLXRN-IL-1Ra逆转录病毒重组质粒,经测序及酶切鉴定正确后转染PT67细胞,包装成为重组PLXRN-IL-1Ra逆转录病毒,并使用小鼠肾成纤维细胞系NIH/3T3对病毒进行滴度测定.实验分为3组未转染组(A组)、PLXRN空质粒转染组(B组)、PLXRN-IL-1Ra转染组(C组),病毒感染人OA软骨细胞后,RT-PCR检测细胞内IL-1Ra基因的转录和表达;ELISA法检测细胞培养上清液中人IL-1Ra蛋白表达.结果 酶切鉴定及基因测序证实重组逆转录病毒质粒中含有人IL-1Ra cDNA,测定包装的病毒滴度为3 × 104 CFU/mL.原代软骨细胞体外培养呈多角形或梭形,甲苯胺蓝染色见细胞内有紫色异染颗粒.RT-PCR结果显示在C组出现311 bp人IL-1Ra mRNA片段,A、B组未见人IL-1Ra mRNA的表达带,GAPDH在各组均有表达.ELISA检测发现C组细胞上清有一定量的人IL-1Ra表达,蛋白浓度为(60.47±15.13)ng/L,A组和B组均无人IL-1Ra表达.结论 构建的IL-1Ra逆转录病毒表达载体成功地感染人OA软骨细胞,并在体外获得稳定表达,为将表达人IL-1Ra基因的人OA软骨细胞用于OA基因治疗提供了实验依据.