继续囊胚培养筛选非优质胚胎中具有发育潜能胚胎的可行性研究

目的：探讨继续囊胚培养筛选非优质胚胎中具有发育潜能胚胎的可行性。方法收集生殖中心142例IVF/ICSI治疗周期中受精后第3天（ D3）移植、冷冻保存后剩余的538枚非优质胚胎继续囊胚培养至第6天（D6）,观察其囊胚形成情况,并将其按不同卵裂球数和评级分为4组（4细胞Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级胚胎组、5细胞Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级胚胎组、6～9细胞Ⅲ级胚胎组和＞9细胞Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级胚胎组）,比较4组间囊胚形成的情况。结果非优质胚胎的囊胚形成率为65．6％,优质囊胚率为51．3％,其中4个组的囊胚形成率分别是55．6％、56．6％、70．4％和66．7％,差异有统计学意义（ P＜0．05）;优质囊胚率分别是8．9％、32．6％、61．0％和63．3％,差异有统计学意义（P＜0．05）。结论继续囊胚培养能有效筛选出非优质胚胎中具有发育潜能的胚胎,提高其利用率。     

囊胚期小鼠胚胎体外培养条件的研究

目的探讨体外不同培养条件对小鼠囊胚生长发育的影响。方法将妊娠d4小鼠囊胚分别培养在无血清培养液（组Ⅰ）、有血清培养液（组Ⅱ）和与无血清小鼠子宫内膜上皮细胞的共培养体系（组Ⅲ）中，观察囊胚的脱带率和扩展生长情况。结果组Ⅰ中的囊胚几乎不能脱带、生长，组Ⅱ和组Ⅲ的培养体系可以支持胚胎细胞的生长增殖。培养24h后，组Ⅲ囊胚的脱带率和扩展生长率明显高于组Ⅱ（P〈0.01），且组Ⅲ囊胚出现类似于“植入”的侵入行为。结论囊胚的孵出和生长发育有赖于外界培养条件，而囊胚与子宫内膜上皮细胞的共同培养，更接近体内发育环境，有利于囊胚的生长发育。     

废弃胚胎来源的单个卵裂球的发育规律

目的 通过对单个卵裂球的体外培养发育的观察,评估其细胞增殖、囊胚形成以及细胞发育分化.方法 收集临床体外受精周期中第3天新鲜废弃胚胎,分离单个卵裂球后即移至囊胚培养液中培养.观察卵裂球的生长情况,分析体外发育单个卵裂球的增殖情况、囊胚的形成时间以及效率,并对形成的囊胚进行细胞染色计数,总结单个卵裂球体外培养的发育规律;并且通过免疫荧光检测囊胚的多能性标记物Oct3/4的表达,初步探讨单个卵裂球的发育极性.结果 收集第3天新鲜废弃胚胎,共分离并进入研究的单个卵裂球596个,卵裂球形成细胞融合在分离后的48 h,囊胚形成则在分离后的72 h,而且生成的囊胚体积较小,大部分内细胞团结构不明显,卵裂球增殖率分别34.1％;囊胚形成率为8.6％,而同期收集的废弃胚胎的囊胚形成率为28.7％,组间差异有统计学意义(P ＜0.001);对分离卵裂球培养第4天形成的囊胚进行细胞计数,中位细胞数为24.6;对所形成的囊胚分析Oct3/4的表达发现,只有25.0％囊胚可表达多能性标志物(Oct3/4),而且囊胚表达多能性标记物的细胞数很少(2～5个).结论 普通胚胎发育规律比较,单个卵裂球的囊胚形成时间延迟1d,囊胚形成率较未分离的废弃胚胎低下;而且单个卵裂球的分离培养可能对细胞的全能性或者极性发育存在负面的影响.     

体外受精治疗周期中剩余胚胎囊胚培养的临床价值

目的探讨体外受精治疗周期中d3移植和冷冻后剩余胚胎的体外发育潜能。方法对剩余胚胎继续培养至囊胚期,观察其囊胚发育率和质量,并分析治疗周期中剩余胚胎囊胚形成情况和妊娠结局的关系。结果收集115个IVF／ICSI-ET周期中的603枚剩余胚胎,囊胚培养后获得了222枚囊胚（36．82％）,其中优质囊胚49枚（8．13％）;36个周期（31．30％）共获得53枚冷冻囊胚（8．79％）;12例含有剩余胚胎来源囊胚的解冻移植周期,临床妊娠4例;≥6细胞、2PN来源胚胎囊胚形成率显著高于其他组（P〈0．05）;剩余胚胎有囊胚形成的周期临床妊娠率显著高于无囊胚形成组（P〈0．05）。结论根据d3胚胎形态学评分预测其发育潜能有一定局限性;通过囊胚培养筛选出剩余胚胎中具有发育潜能的并冷冻保存,是提高病人每个治疗周期可用胚胎数的可行方法;剩余胚胎囊胚形成情况可有效预测妊娠结局。     

两种2-细胞鼠胚体外培养方法比较

目的应用鼠胚质控中的小鼠胚胎体外培养模型,探讨两种胚胎培养方式（四孔皿与微滴法）在单胚观察时间上的差异以及对2-细胞鼠胚体外发育潜能的影响。方法取6-8周龄的昆明白雌性小鼠。采用HMG10IU促排卵,48 h后注射HCG 10IU促卵泡成熟,取形态正常的2-细胞鼠胚。每5-10个胚胎培养在含500μL培养基的四孔皿中（A组）,或单个胚胎接种在含50μL的培养微滴中（B组）。培养后,每隔24 h在倒置显微镜下观察一次,计算单胚观察时间,并检测24 h时的≥4细胞胚形成率、48 h的融合胚形成率7、2 h的囊胚与扩张囊胚形成率、96 h囊胚孵化率。结果两种培养方式于同一试验条件下分别试验5次,A组培养83个胚胎,B组培养69个2-细胞鼠胚。在每一个观察点上,微滴培养的单胚观察时间远超过四孔皿培养（P〈0.001）。但两组各时间点的胚胎发育率相似,无显著差异（P〉0.05）。结论尽管微滴单胚培养方式的胚胎暴露培养箱外时间长,但与四孔皿多胚培养方式比较,两者间2-细胞鼠胚的体外发育潜能相似。     

基于体外鼠胚实验评估辅助生殖实验室质量

目的 通过监测体外鼠胚胎培养实验中卵裂率和囊胚率,评估本院新建的生殖胚胎实验室是否符合人类胚胎体外培养要求。方法 采用SPF级昆明系小鼠行体内和体外受精实验,雌鼠通过腹腔注射PMSG 10 U/只,48 h后腹腔注射hCG 10 U/只进行促排卵,促排卵后,体外受精组经手术获得精子和卵子行体外受精培养;体内受精组在雌鼠促排卵后,将雌鼠和雄鼠合笼饲养过夜,第二天清晨处死可见阴栓的雌鼠,手术获取受精原核胚进行培养,观察两组胚胎培养过程中的发育情况。结果 体外受精实验进行20个周期,共获卵946枚,受精率、囊胚率分别为（79.02±4.05）%、（80.12±5.27）%。体内受精实验进行14个周期,共获卵618枚,其受精率、囊胚率分别为（80.65±4.22）%、（81.35±3.06）%,两组间受精率和囊胚率比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 通过监测体外鼠胚培养实验中卵裂率和囊胚率评估我院生殖胚胎实验室环境,结果表明符合各项指标质控标准。     

高糖对小鼠囊胚细胞凋亡调控蛋白Fas表达的影响

目的:探讨高浓度葡萄糖对小鼠囊胚发育及凋亡调控蛋白Fas表达的影响。方法:通过促超排卵,获取妊娠3.5 d小鼠囊胚,随机分成空白对照组、低糖组和高糖组,分别培养在含0、7.5、28.0 mmol/L葡萄糖的M199培养基中,24 h后吸出囊胚。SP法检测囊胚组织Fas蛋白的表达水平。结果:空白组中囊胚细胞胞浆可见少量浅棕黄色颗粒,低糖组无着色,高糖组棕黄色颗粒较多;Fas表达分别呈弱阳性、阴性、强阳性;高糖组Fas表达水平较空白组和低糖组均高(P<0.01)。结论:高浓度葡萄糖可诱导凋亡蛋白Fas表达,致囊胚细胞数目减少而影响囊胚正常发育和着床。     

胰岛素样生长因子-Ⅱ对小鼠早期胚胎体外发育的影响

目的 探讨胰岛素样生长因子-Ⅱ(IGF-Ⅱ)对小鼠早期胚胎的影响,为人类胚胎培养系统的优化提供依据.方法 在mKSOM培养基中加入不同浓度的IGF-Ⅱ,Xgd,鼠1-细胞胚胎进行体外培养,观察囊胚发育率、孵化率及胚胎细胞数的变化.结果 小鼠1-细胞胚胎体外培养120 h后,IGF-Ⅱ添加组囊胚发育率、孵化率显著高于对照组,但囊胚细胞计数与对照组无明显差别.结论 添加IGF-Ⅱ对小鼠胚胎发育具有一定的促进作用.     

双酚A对小鼠囊胚发育和植入的影响

目的 研究双酚A(BPA)对囊胚发育和植入的影响。方法 对妊娠鼠进行完全随机化分组,分为100、300、600 mg/(kg·d)BPA组和对照组,将BPA处理组的孕鼠从妊娠的0.5~3.5 d灌服100、300和600 mg/(kg·d)BPA,着床点染色,统计胚胎的着床数和着床率,检查植入前囊胚的发育和孵化情况,激光扫描共聚焦显微镜观察孵化囊胚的卵裂球分布和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3的表达。结果 300 mg/(kg·d)BPA显著降低了孕鼠的着床点数和着床率,而600 mg/(kg·d)BPA处理的孕鼠未观察到着床点,抑制了胚胎的植入。不同浓度的BPA对妊娠第4天囊胚发育率和囊胚总细胞数无影响,但300和600 mg/(kg·d)BPA显著降低了囊胚的孵化率,提高了孵化囊胚中凋亡细胞的数量。结论 高浓度的BPA损伤了附植前囊胚的发育,影响了胚胎的植入。     

解冻囊胚体外培养时间与妊娠结局的关系

目的比较冻融囊胚周期解冻后体外培养的时间对妊娠结局的影响。方法回顾性分析155例首次接受冻融胚胎移植周期(FET)的患者,其中38个囊胚解冻周期在排卵或肌注黄体酮后4天进行解冻复苏,培养16~18 h后进行移植(16~18 h组),117个囊胚解冻周期在排卵或肌注黄体酮后4天进行解冻,培养2~3 h后移植(2~3 h组),对两组患者平均年龄、原发不孕比例、自然周期比例、移植胚胎枚数、移植优质囊胚比例、移植日内膜厚度、临床妊娠率、胚胎种植率、流产率等数据进行对照分析。结果两组患者平均年龄、原发不孕比例、自然周期比例、移植胚胎枚数、移植优质囊胚比例、移植日内膜厚度均无统计学差异(P>0.05),16~18 h组临床妊娠率、种植率与2~3 h组无统计学差异(P>0.05);16~18 h组的流产率显著高于2~3 h组(P<0.05)。结论解冻囊胚培养2~3 h移植,能够有效降低流产率,改善妊娠结局。     

Relevance of Hepatocyte Growth Factor and Fibroblast Growth Factor on Mouse Preimplantation Embryo Development

Objective To explore the effect of hepatocyte growth factor （HGF） and fibroblast growth factor （FGF） on preimplantation embryo development of mouse.
Methods Mated mice were killed by cervical dislocation to collect two pronucleous （2 PN） zygotes from oviduct of pregnant 1 d NMRI mice and were cultured to the hatching blastocyst stage and the number of embryo in different stages was recorded under an invert microscope. The cleavage rates of formed 2 PN zygotes were compared with blastocyst and hatching blastocyst stage in drops of T6 medium with or without HGF or FGF （0 ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/ml, 50 ng/ml, 1 000 ng/ml）.
Results HGF and FGF enriched embryo culture media promotea the aevetopment from 2 PN stage embryos to blastocyst. Adding 20 ng/ml of FGF or HGF to the culture medium significantly increased the percentage of 2PN embryos that developed into blastocysts （P〈0.05）, but culture of embryos in drops of T6 medium with HGF （20 ng/ml） had no improvement in in-vitro hatching.
Conclusion Exogenous HGF and FGF at low concentrations promote in-vitro mouse blastocyst formation.     

Transforming growth factor-α promotes mouse blastocyst outgrowth and secreti on of matrix metalloproteinases

Objective To study the effect of transforming growth factor-α (TGF-α) on early stage of embryo implantation.Methods Mouse blastocysts were cultured in vitro in medium containing various concentrat ions of TGF-α. Blastocyst implantation capacity was evaluated by calculating the percentage of embryos with attachment or outgrowth. Matrix metalloprotein ases (MMPs) secretion of blastocysts was observed using gelatin zymography. Results There was no significant difference in the percentage of attachment betwee n control and TGF-α treated groups, but the percentage of outgrowth of TGF-α treated groups was significantly higher than that of the control group after 24 h culturing. Gelatin zymography showed that blastocysts cultured in TGF-α treated groups started secreting MMPs earlier than those in the control group.Conclusion TGF-α is involved in regulating the mouse embryo implantation process by promo ting blastocyst outgrowth and secreting matrix matalloproteinases.     

转化生长因子-α促进小鼠胚泡扩展和基质金属蛋白酶分泌

目的　研究转化生长因子 α(transforminggrowthfactor α ,TGF α)在胚胎植入早期阶段的作用。方法　小鼠胚泡体外培养于含或不含各种浓度的TGF α培养液中。用粘附、扩展胚胎的百分数来评价胚泡的着床能力。用明胶酶谱法来检测胚泡分泌基质金属蛋白酶情况。结果　实验组与对照组的胚泡粘附率无明显差异 ,但是培养 2 4h后 ,实验组胚泡扩展率显著高于对照组。明胶酶谱结果显示实验组胚泡分泌基质金属蛋白酶 (matrixmetalloproteinase ,MMPs)早于对照组。结论　TGF α通过促进胚泡扩展和基质金属蛋白酶分泌参与到胚泡植入进程的调节当中。     

不同浓度表皮生长因子对小鼠2-细胞胚胎体外发育的影响

目的:研究不同浓度表皮生长因子(ep iderm al growth factor,EGF)对ICR小鼠2-细胞胚胎体外发育的影响。方法:在mKSOM培养液中添加不同浓度(0.1,1.0,10和100 ng/m l)的EGF对小鼠2-细胞胚胎进行体外培养72 h、96 h,观察囊胚发育率、孵化率和胚胎细胞数的变化。结果:实验组加入四种不同浓度EGF胚胎培养72 h后,其囊胚率分别为93.8%、92.4%、91.8%、91.2%;96 h后其孵出率分别为61.1%、61.8%、63.0%、60.1%,均显著高于对照组(79.9%、43.1%,P<0.05),囊胚细胞数分别为73.1±13.4、73.8±7.0、74.3±12.2、77.6±8.2,与对照组(72.1±6.9)比较,差异无显著性(P>0.05);四个实验组间差异亦无显著性(P>0.05)。结论:EGF浓度在0.1,1.0,10和100 ng/m l范围内可提高体外培养鼠胚的囊胚率与孵出率;胚囊细胞数无变化;不同浓度EGF对早期鼠胚未见有毒性作用。     

序贯培养体系和单一培养体系对人卵母细胞受精和早期胚胎发育的影响

目的：比较在体外受精/卵胞质内单精子显微注射（IVF/ICSI）治疗周期中序贯培养体系和单一培养体系对人类早期胚胎发育的影响，为人类辅助生殖技术中胚胎培养体系的选择和评估提供参考。方法：选取155例行IVF/ICSI助孕的患者，将同一个患者的卵子分为2组，分别在Vitrolife的序贯培养体系G-IVF/G1/G2培养液（序贯培养组）和Irvine的单一培养体系CSCC培养液（单一培养组）中进行体外受精和胚胎培养，观察2组不同培养体系中胚胎受精和胚胎早期发育情况。结果：与单一培养组比较，序贯培养组受精率、双原核（2PN）受精率和多核受精率差异均无统计学意义（P>0.05）。在IVF患者中，序贯培养组和单一培养组的卵裂率、可用胚胎率、优质胚胎率和囊胚形成率比较差异均无统计学意义（P>0.05）；在ICSI患者中，序贯培养组和单一培养组的卵裂率、可用胚胎率和囊胚形成率比较差异均无统计学意义（P>0.05），但序贯培养组优质胚胎率明显高于单一培养组（P=0.015）。在IVF和ICSI患者中，单一培养组第3天胚胎致密化的比例均明显高于序贯培养组（P=0.001）。在序贯培养组中胚胎形态表面光滑均匀，单一培养组中胚胎表面较为粗糙且有颗粒状。结论：G-IVF/G1/G2序贯培养体系和CSCC单一培养体系对人卵母细胞受精和早期胚胎发育的影响无明显差异。     

TGF-β1改善体外培养小鼠胚胎种植率及其作用机制的研究

目的 探讨TGF-β1在体外对小鼠胚胎发育及胚胎种植的影响及其作用机制.方法 ①收集小鼠2-细胞期胚胎,在含不同剂量TGF-β1的M16培养液中进行体外培养,观察胚胎发育情况,并进行胚胎移植,观察着床率;②测定移植后小鼠外周血及胚胎种植部位母胎界面IL-10/INF-γ水平.结果 ①1 ng/mL和10 ng/mL TGF-β1能提高2-细胞期胚胎体外发育速率、质量和胚胎着床率.其中TGF-β1 10 ng/mL时作用最显著,TGF-β1浓度过高对体外胚胎发育不利;②M16+TGF-β1 10 ng/mL组体外培养囊胚移植后母胎界面INF-γ低于M16组,差异有统计学意义[(30.89±11.31) pg/mL vs. (43.23±18.09) pg/mL,P<0.05].两组间IL-10水平无明显差异.结论 ①小鼠胚胎体外培养基中加入适宜浓度TGF-β1可提高2-细胞期胚胎体外发育速率、质量和胚胎着床率;②TGF-β1可能通过促进体外胚胎发育速率和质量,改善胚胎和内膜发育同步性,促进母胎界面Th1/Th2平衡向Th2偏移而促进胚胎着床.     

瘦素对小鼠着床前胚胎发育影响的体外研究

目的　探讨瘦素在体外对小鼠着床前胚胎发育的影响。方法　 1收集小鼠 2 -细胞胚胎 ,在不同剂量瘦素的 CZB培养液中进行体外培养 ,观察胚胎发育情况 ,并进行胚胎移植 ,观察着床率 ;2收集小鼠 2 -细胞胚胎在空白 CZB培养液中体外培养至桑葚胚期 ,再分别置入不同剂量瘦素的 CZB培养液中进行体外培养 ,观察胚胎进一步发育情况。结果　瘦素能提高 2 -细胞胚胎体外发育的质量、发育率和胚胎着床率。当瘦素剂量为 10 ng/ ml时平均胚胎形态学评分 (AES)为 16 .0 8± 0 .37,剂量为 5 0 ng/ ml时 AES为 17.5 7± 0 .4 2 ,两者间差别有统计学意义(P<0 .0 5 )。但剂量进一步增加 ,促进作用不再递增。瘦素对桑葚胚体外进一步发育无显著影响。结论　瘦素参与了小鼠着床前胚胎的发育 ,能提高胚胎发育质量、发育率 ,有利于胚胎的进一步着床。     

表皮生长因子对小鼠早期胚胎体外发育影响的研究

目的：探讨表皮生长因子对小鼠植入前胚胎体外发育的影响。方法：用添加不同浓度EGF(epidermal growth factor)的CZB培养液对小鼠早胚进行体外培养，观察囊胚发育率和胚胎细胞数的变化。结果：HCG(human chorionic gonadotropin)注射后138h，0．1ng／ml EGF添加组扩张囊胚率、孵化囊胚率显著高于其他各组。100．0ng／ml EGF添加组扩张囊胚率和孵化囊胚率显著低于其余各组，且囊胚细胞死亡较多。结论：EGF通过刺激囊胚期细胞分化而促进胚胎体外发育。但高浓度EGF抑制胚胎体外发育并使早期胚胎受损。     

序贯培养对小白鼠胚胎体外发育的影响

目的:探索序贯培养技术对小白鼠胚胎体外发育的影响。方法:将 2 -细胞期的小鼠胚胎随机分为序贯培养组与传统培养组进行培养 ,观察分析两组的 8-细胞期胚胎形成率、桑椹期胚胎形成率及囊胚形成率。结果:序贯培养组 8-细胞期胚胎形成率、桑椹期胚胎形成率及囊胚形成率分别为 70 .5 %、6 8.2 %、6 5 .9% ,传统培养组分别为 4 5 .7%、4 5 .7%、34.3%。两组比较 ,序贯培养组高于传统培养组 ,差异有统计学意义 (P <0 .0 5 )。结论 :采用适当的培养液进行序贯培养 ,更适合小白鼠胚胎的体外发育     

Effect of an Improved Mechanical Method for Assisted Hatching on the in vitro Development of Mouse Embryos

Implantation of embryo occurs after its escape from the zona pellucida (ZP), the pro- cess of which is called hatching. In vivo hatching is viewed as a prerequisite for successfuldialogue between the embryo and the endometrium. It has been speculated that…