大鼠胚胎神经干细胞的分离培养及鉴定研究

目的探讨大鼠胚胎神经干细胞（NSCs）的分离、培养、分化及鉴定的条件与方法。方法分离孕14～16dSD大鼠胚胎脑皮质及皮质下区域NSCs,无血清培养基（DMEM／F12,含bFGF、EGF、B27等）条件下培养,通过有限稀释法克隆、传代,含血清培养基诱导分化,免疫组织化学法鉴定NSCs及诱导分化后的细胞。结果体外培养的NSCs能稳定增殖成神经干细胞球并传代（nestin染色阳性）,经诱导可分化为神经元细胞（NSE染色阳性）、星形胶质细胞（GFAP染色阳性）和少突胶质细胞（CNP染色阳性）。结论采用无血清培养基中加入特定生长因子的培养技术,可在体外大量培养出稳定增殖并具有多向分化潜能的大鼠胚胎NSCs,为进一步研究NSCs的生物特性及应用奠定了基础。     

大鼠神经干细胞体外培养的研究

目的：比较两种不同的分离培养方法对大鼠神经干细胞（NSCs）增殖的影响。方法：分离新生24小时内的SD大鼠脑组织细胞,采用无血清培养技术进行体外扩增培养,分别以机械吹打法和胰酶消化法两种方法进行扩增培养、传代。免疫细胞化学法对NSCs 及其分化后的细胞进行Nestin,NSE,GFAP,CNP的鉴定。结果:分离培养的细胞具有自我更新和增殖能力及Nestin 表达阳性,诱导后可分化为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞。无论第一代或第二代比较,胰酶消化组NSCs 的增殖明显高于机械吹打组。结论:实验中分离培养的细胞为具有自我更新和增殖能力的NSCs ,可诱导分化为终末神经细胞。在两种分离培养方法中,以胰酶消化法培养可获得更多的NSCs 。     

胚胎大鼠大脑额叶皮质神经干细胞的分离、培养与鉴定

目的：探讨从胚胎大鼠大脑额叶皮质分离培养神经干细胞（neural stem cell,NSCs）的方法及NSC。的特性。方法：将14．5d胎龄的大鼠额叶皮质脑组织制备成单细胞悬液,于含EGF和bFGF的DMEM／F12无血清培养液中培养,形成原代细胞球后,进行单细胞克隆传代扩增。免疫荧光组化方法检测克隆球Nestin、Map-2、GFAP抗体标记情况。结果：原代培养2周后,可形成大量悬浮生长的神经球,BrdU和Nestin检测呈阳性,诱导分化后呈Map-2、GFAP阳性。结论：可从胚鼠脑皮质中分离培养纯化、扩增传代获得NSCs,经诱导后可以分化为神经元和星形胶质细胞,可作为细胞替代治疗中枢神经系统疾病的供体来源。     

胰岛素诱导低血糖对新生大鼠海马神经干细胞增殖和分化的影响

目的探讨胰岛素诱导低血糖对新生大鼠海马神经干细胞(NSCs)增殖和分化的影响。方法新生1日龄大鼠禁食24 h后腹腔注射胰岛素50 u.kg-1,血糖值<1.0 mmol.L-1后取脑海马组织在含碱性成纤维生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)和B27的无血清培养基中进行原代和传代培养,并分别对原代和传3代的细胞进行单克隆培养及诱导分化:单克隆培养细胞行巢蛋白(Nestin)免疫细胞荧光染色;诱导分化后的细胞分别行神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫细胞荧光染色,计数NSE阳性细胞比例。结果原代组培养细胞与传代组和对照组原代细胞相比生长较快;单克隆培养的细胞均Nestin阳性表达,诱导分化后的细胞分别呈NSE或GFAP阳性表达;原代组的细胞诱导分化为神经元的比例明显高于传代组和对照组(P<0.05);传代组的细胞诱导分化为神经元的比例与对照组传代细胞比较无统计学意义(P>0.05)。结论低血糖能够短暂地促进新生大鼠海马神经干细胞增殖及提高向神经元分化比例。     

成鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的研究

目的:探讨成年大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的体外培养和向神经元样细胞分化的能力.方法:利用Percoll分离液(1.073×103g/L)梯度分离成年大鼠MSCs,采用3种不同的方法对其诱导分化,免疫细胞化学方法检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、星形胶质细胞特异性标志(GFAP)和神经前体细胞(Nestin)的表达.结果:成功进行了成年大鼠MSCs的原代和传代培养,3种诱导方法均能使MSCs分化为神经元样细胞,都能表达NSE、NF和Nestin,而不表达GFAP.结论:MSCs能在体外分离、扩增、传代,并能向非间充类细胞分化.     

新生大鼠海马区神经干细胞分离培养和单细胞克隆系建立及鉴定

目的:分离培养新生大鼠海马区神经干细胞(Neural stem cells,NSCs),建立NSCs单细胞克隆系。方法:取新生SD大鼠海马组织分离NSCs后无血清技术培养,建立其克隆系并行单细胞传代克隆培养。采用细胞免疫荧光和RT-PCR等技术对NSCs进行鉴定,分子标志物选择Nestin和Sox2。NSCs诱导分化的神经元的鉴定,标示物选择早期神经元特异性微管蛋白(β-tubulin),星形胶质细胞标示物为特异性胶质酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP),少突胶质细胞特异性标记蛋白为髓鞘相关蛋白(cyclic nucleotide phosphodiesterase,CNP)。结果:无血清培养法可维持NSCs生长和促进其增殖。成功建立NSCs单细胞克隆系,传代可获得大量亚克隆NSCs株团。单细胞克隆NSCs球团经早期酶消化结合后期机械吹打法传代,分散为单细胞或类单细胞后,增殖及分化能力依然存在。单细胞克隆系株经Nestin和Sox2细胞免疫荧光或RT-PCR检测均为阳性表达。在加有胎牛血清培养基条件下进行诱导分化,来自单细胞克隆系的细胞株同样可分化为神经元样、星形胶质细胞样和少突胶质细胞样3种神经细胞,即β-tubulin、GFAP、CNP免疫荧光染色分别呈阳性。结论:无血清培养可成功建立新生SD大鼠海马区NSCs单细胞克隆系,并可稳定传代增殖,并在一定条件下可诱导分化为成熟的神经元和神经胶质细胞。     

大鼠胚胎神经干细胞的培养及分化的观察

目的探索大鼠胚胎神经干细胞的培养、传代和冻存、复苏的方法,以及观察胚胎神经干细胞在自然条件下分化为神经元细胞和神经胶质细胞的过程.方法从胚胎大鼠脑组织中分离得到神经干细胞,采用无血清培养技术进行培养、传代和鉴定.诱导分化后采用SABC法对分化的细胞进行神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经胶质酸性蛋白(GFAP)检测以作细胞鉴定.结果成功培养出大鼠胚胎神经干细胞,并对其进行传代、冻存及复苏,培养的细胞能分化为神经元细胞和神经胶质细胞.结论大鼠胚胎神经干细胞能在体外适宜的培养条件下进行长期的培养、传代及冻存、复苏,并具有多向分化潜能.     

胚胎小鼠神经干细胞的培养和诱导分化

目的 探索体外培养和诱导分化胚胎小鼠神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的方法 .方法分离12.5 d ICR小鼠胚胎的大脑皮质,通过Accutase酶消化法和机械消化法,将组织消化成单个细胞,置于完全培养基中培养,3d后神经干细胞增殖成神经球;将传代的神经球消化,通过诱导培养基诱导其分化;采用细胞免疫荧光染色和qRT-PCR技术检测巢蛋白(Nestin)、中间微管相关蛋白2(Map2)和胶质纤维酸性蛋白(Gfap)的表达,鉴定NSCs、分化形成的神经元和星形胶质细胞.结果 NSCs能被Nestin特异性标记,诱导分化后的细胞可被Map2和Gfap抗体特异识别;qRT-PCR结果显示,诱导后Nestin的表达水平降低,而Map2和Gfap的表达水平升高.结论 通过Accutase酶消化法联合机械消化法分离小鼠胚胎脑皮质,进行体外培养,可获得具有自我更新能力和多向分化潜能的NSCs.     

大鼠胚胎脊髓源性神经干细胞的培养和分化

目的探讨大鼠脊髓源性胚胎神经干细胞体外分离培养增殖及分化,为进一步的实验研究提供基础。方法取孕14~16 d的SD大鼠胚胎脊髓在条件培养基中培养增殖传代分化,用神经干细胞特异性抗体—巢蛋白(Nestin)鉴定克隆细胞,用特异性的单克隆抗体鉴定克隆球诱导分化后的细胞。用Brdu免疫荧光对神经干细胞传代能力检测。结果获得了大量能自我增殖并分化的神经干细胞,分化后主要产生神经元特异性微管相关蛋白染色阳性的神经元质纤维酸性蛋白阳性的星型胶质细胞和少突胶质细胞三种神经组织细胞。Brdu免疫荧光显示神经球中绝大多数细胞为Brdu阳性细胞,其细胞核中可见荧光标记物。结论大鼠胚胎脊髓能分离、培养出神经干细胞,并能诱导分化为神经元、星型胶质细胞和少突胶细胞。     

EPO对鼠胚脑皮质神经干细胞抗凋亡作用的研究

目的探讨促红细胞生成素（erythropoietin,EPO）对体外培养神经干细胞（neural stem cells,NSCs）凋亡的影响,为NSCs移植治疗脑损伤和脑部疾病提供实验依据。方法孕14 d（El4）大鼠取鼠胚脑皮质悬浮培养、贴壁诱导分化。采用光电镜观察,用免疫细胞化学染色以Nestin蛋白作为鉴定NSCs的标记物,以MAP2、GFAP蛋白检测NSCs的分化。取第3代（P3）NSCs向悬浮培养基中分别添加不同剂量的EPO,EPO浓度分别为0.5U/ml,5U/ml,50U/ml,500U/ml,并设不添加EPO的对照组,通过Caspase-3蛋白检测NSCs的凋亡。结果 1）提取和分离E14d SD大鼠的胚脑皮质,在添加B27、bFGF、EGF的无血清培养基中培养,可形成大量悬浮的神经球并可进行体外扩增传代,神经球内的细胞均呈Nestin阳性、BrdU阳性。在添加10%胎牛血清的培养基中,神经干细胞可自然分化为神经元和神经胶质细胞。2）加入≥5U/ml EPO,神经球内Caspase-3的表达显著下降（P〈0.01）。结论 1）大鼠胚胎脑皮质体外培养可得到大量增殖的NSCs并能分化为神经元和神经胶质细胞,为NSCs的研究提供了适宜的细胞培养模型。2）加入≥5U/ml EPO可降低体外培养的鼠胚脑皮质NSCs的凋亡率。