骨髓间充质干细胞和成纤维细胞的蛋白质组学比较

目的: 采用蛋白质组学方法研究人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)和成纤维细胞中的蛋白表达差异.方法: 对hBMSCs和成纤维细胞的蛋白样本进行双向凝胶电泳分离,通过比较两种细胞的蛋白组学图谱,确定差异表达的蛋白点;而后对差异点进行基质辅助激光解析电离飞行时间质谱分析和蛋白数据库信息检索;最后选取其中的5种蛋白进行Western Blot实验验证蛋白质组学的研究结果.结果: 在hBMSCs和成纤维细胞中鉴定出29种差异表达蛋白,其中有17种蛋白在两种细胞中有显著差别地表达,另外12种蛋白在两种细胞中有相同丰度地表达.Western Blot的实验结果进一步验证了蛋白质组学分析的结果.结论: hBMSCs与成纤维细胞中蛋白的差异表达体现了两种细胞在细胞形态、结构和功能上的异同性,这对于研究hBMSCs向成纤维细胞分化以及应用hBMSCs构建组织工程瓣膜具有重要意义.     

米诺环素微环境对体内外骨髓间充质干细胞的影响

 目的研究米诺环素在体内外干扰骨髓间充质干细胞后对其生长的影响。方法大鼠脊髓损伤后,经口给予米诺环素,并将带有GFP基因的SD大鼠骨髓间充质干细胞局部移植到损伤脊髓,在体外培养大鼠骨髓间充质干细胞并给予不同剂量的米诺环素进行干预。利用荧光显微镜计数细胞,采用MTT法描绘细胞生长曲线来观察干细胞的生长状况。结果米诺环素联合骨髓间充质干细胞治疗实验性脊髓损伤,在损伤中心可以观察到更多的移植细胞,体外培养的骨髓间充质干细胞在合适剂量米诺环素的干预下呈现出更加旺盛的生长趋势。结论合适剂量的米诺环素可以促进体内移植的骨髓间充质干细胞在损伤脊髓内更多地迁移到损伤中心,而对于体外培养的骨髓间充质干细胞米诺环素会促进其增殖。     

碱性成纤维细胞生长因子对羊骨髓间充质干细胞体外增殖和分化的影响

目的：探讨碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）对羊骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外增殖与分化的影响。方法：体外分离培养的羊原代BMSCs分为实验组和对照组,实验组添加bFGF(2 μg•L^-1)于L-DMED培养液中,对照组使用L-DMED常规培养液。分别测定2组BMSCs生长曲线以及碱性磷酸酶（ALP）活性。应用诱导剂对2组细胞进行成骨、成脂肪诱导,分别在显微镜下观察其分化潜能。 结果：单个核细胞接种大约1周成纤维细胞样集落开始出现,2周后形成的集落数量增加,每个集落的体积变大。当第1代BMSCs细胞生长到汇合期时,实验组细胞数是对照组的2.5倍。于第16天实验组ALP活性比对照组明显降低（P＜0.05）。2组BMSCs经成骨诱导培养3周后,经Von Kossa染色,已经成骨的细胞内均可见钙盐沉积;已经成骨的细胞内油红-“O”染色显示,成脂肪诱导培养2周后,2组BMSCs均能分化形成脂肪细胞,2组每高倍视野下脂肪细胞计数差异无显著性（P>0.05）。 结论：bFGF能提高羊BMSCs集落形成数量及扩增效率,并抑制其ALP活性,同时保持了BMSCs向成骨细胞、脂肪细胞的分化潜能。     

心肌微环境对胎盘间充质干细胞向心肌细胞分化的影响

目的 观察心肌微环境对胎盘间充质干细胞(human placenta-derived mesenchymal stem cells,hPDMSCs)向心肌细胞分化的影响.方法 用心肌细胞培养上清液模拟心肌微环境诱导hPDMSCs向心肌细胞分化,同时设置20％DMEM培养的对照组.每天于显微镜下观察细胞形态学变化,每两天台盼蓝拒染法计数细胞,免疫组织化学法检测α-横纹肌肌动蛋白的表达,免疫荧光法检测心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I,cTnI)的表达,RT-PCR法检测心钠素(atrial natriuretic factor,ANF)、β-肌球蛋白重链(beta-myocin heavy chain,β-MHC)mRNA的表达.结果 对照组细胞保持较快的增殖速度,不表达α-横纹肌肌动蛋白、cTn I、ANF、β-MHC;心肌细胞培养上清液模拟的心肌微环境组细胞增殖速度较慢,表达α-横纹肌肌动蛋白、cTn I、ANF、β-MHC.结论 心肌微环境能够诱导hPDMSCs向心肌细胞分化.     

人骨髓间充质干细胞对非特异性间质性肺炎患者成纤维细胞的影响

目的研究骨髓间充质干细胞（BMMSC）对非特异性间质性肺炎（NSIP）患者异常肺成纤维细胞的影响,探讨BMMSC在间质性肺纤维化的治疗机制。方法体外原代培养人BMMSC、NSIP患者的肺成纤维细胞,以及正常的肺成纤维细胞。BMMSC和正常肺成纤维细胞分别与NSIP肺成纤维细胞以Transwell孔共培养,24 h后留取上清,采用ELISA法检测上清中转化生长因子β1（TGF-β1）和干扰素诱导蛋白10（IP-10）等细胞因子水平,液相芯片技术检测上清中IL-6、IL-8、单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）等炎性因子水平。Transwell孔共培养48 h后提取肺成纤维细胞蛋白,Western blot检测肺成纤维细胞分泌的α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达水平。结果 NSIP肺成纤维细胞与正常肺成纤维细胞相比,能够高分泌炎性因子IL-6、IL-8和趋化因子MCP-1,高表达α-SMA。BMMSC与NSIP肺成纤维细胞以Transwell孔共培养24 h后,TGF-β1及IP-10高表达,显著下调NSIP肺成纤维细胞高水平分泌的IL-6、IL-8和MCP-1炎性因子水平,并明显下调NSIP肺成纤维细胞α-SMA的高表达。结论间充质干细胞能够下调NSIP肺成纤维细胞高水平分泌的多种炎性细胞因子,抑制NSIP肺成纤维细胞α-SMA的高表达。     

骨髓间充质干细胞转分化为心肌细胞调控机制及其微环境

心血管系统疾病已成为现代社会严重影响人类健康的重大疾病.在心血管系统疾病中,慢性心功能不全和心肌梗死是最为严重的两种疾病,其特征是心肌细胞死亡导致细胞数量减少和心肌功能低下,由于心肌细胞通常被认为是终末分化的细胞,心肌细胞死亡就意味着心肌细胞数量的减少,因此植入适宜的外源性细胞,增加梗死区心肌细胞数量,将是修复或重建心脏功能、具有潜在临床应用价值的方法.     

不同氧浓度微环境对大鼠骨髓间充质干细胞成骨及成脂肪分化的影响

目的 观察不同氧浓度微环境对间充质干细胞分化的影响,对比分析间充质干细胞在体外常规培养与机体生理的微环境中分化情况的差异.方法 从大鼠骨髓中分离获取间充质干细胞;体外培养扩增后,取第3代骨髓间充质干细胞,以5×105/mL浓度接种到6孔培养板中,贴壁后分别加入成骨和成脂诱导分化因子;并分别给予高压氧(1.5kPa,60min)和低压氧(-1.5kPa,60min)处理, 1次/d×5d.诱导2周后进行钙结节茜素红染色和Von Kossa染色检测成骨分化情况;油红染色检测脂肪样细胞形成数量.结果 与常规分化组比较,高压氧组钙化结节数量明显增加约为常规组的(1.5±0.1)倍(P<0.01);脂肪样细胞数量也明显增加,约为常规组的(1.6±0.2)倍(P<0.01).低压氧组钙化结节数量明显减少约为常规组的(0.6±0.2)倍(P<0.01);脂肪样细胞数量明显减少,约为常规组的(0.5±0.1)倍(P<0.01).结论 高浓度氧微环境可以促进大鼠骨髓间充质干细胞成骨和成脂分化,低浓度氧则表现为抑制.     

大鼠骨髓间充质干细胞培养方法的比较

目的：比较4种培养条件下大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）的生长与增殖性差异。方法采用密度梯度离心法提取大鼠BMSCs ,分别在DMEM-LG培养基、DMEM/F12培养基、DMEM-LG＋10 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子（ bFGF）与DMEM/F12＋10 ng/mL bFGF培养条件下贴壁培养,观察各代细胞的形态特征,绘制第4代细胞的生长曲线,利用流式细胞仪对各培养条件下的BMSCs进行细胞表面标志CD45、CD29和CD90的检测。结果不同培养条件下的 BMSCs 生长速度不同。加入 bFGF 培养条件下细胞增殖速度较单用 DMEM -LG 或DMEM/F12培养条件下更快（P＜0．05）。 DMEM-LG＋10 ng/mL bFGF的培养效果最佳,细胞密度高,生长状态良好。4种条件下培养的细胞均阳性表达CD29及CD90,阴性表达CD45。结论短期培养过程中加入bFGF不引起BMSCs分化,DMEM-LG＋10 ng/mL bFGF是较理想的BMSCs培养条件。     

骨髓间充质干细胞自体移植提高猪皮肤创面修复质量的初步研究

目的　探讨骨髓间充质干细胞 (MSCs)局部移植对提高猪皮肤烫伤创面组织修复质量的作用 ,为临床皮肤损伤后功能性修复提供新的治疗方法。方法　抽取 6只小型香猪的骨髓 ,经体外培养并纯化MSCs,应用 5 溴脱氧尿嘧啶 (BrdU)标记技术进行标记。猪背部皮肤中线两侧各制备 6个面积为 2 5 4cm2 的深Ⅱ0 烫伤创面 ,将已标记的MSCs( 2× 10 6)以注射方式回植到提供骨髓猪的创面下 ,将创面随机分为 6组 ,即空白对照组、MSCs治疗组、MSCs 碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)治疗组、bFGF治疗组、MSCs 表皮细胞生长因子 (EGF)治疗组以及EGF治疗组。分别于伤后 7、14、2 1、4 2d采用大体观察、常规组织学检查、免疫组织化学及免疫荧光化学染色动态观察创面愈合情况。结果　实验猪皮肤烫伤后 7d开始 ,各组创面逐渐缩小 ,伤后 2 1d ,大部分创面愈合。虽然不同时间点各治疗组创面面积缩小率差异无显著意义 ,但以MSCs bFGF治疗组最为明显 ,伤后第 14天和 2 1天创面缩小的面积比其他 5组大 15 %～ 2 0 %。半定量评价结果显示MSCs bFGF治疗组肉芽组织中血管密度较大 ,为 ,而其他组别仅为 ～ 。再上皮化的新生表皮在MSCs bFGF治疗组较其余 5组厚 ,并有上皮角形成。半定量分析可见神经纤维在MSCs bFGF治疗组较其他 5     

骨髓间充质干细胞抑制皮肤瘢痕形成的机制研究

目的 探讨骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)抑制皮肤瘢痕形成的机制研究,为增生性瘢痕的防治提供实验基础。方法 C57BL/6小鼠随机分为空白对照组、移植对照组、模型组以及MSCs移植组(n=6)。对照组和移植对照组小鼠每日于背部经皮下注射1mlPBS,3h后移植对照组经皮下注射1×10⁶个MSCs,对照组给予相同剂量的PBS,模型组和MSCs移植组小鼠每日于背部经皮下注射1ml(1mg/ml)博来霉素,3h后MSCs移植组经皮下注射1×10⁶个MSCs,模型组给予相同剂量的PBS,共计3周。RT-PCR检测与瘢痕形成相关的基因表达,免疫组织化学法检测皮肤纤维化程度指标α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达。结果 BM-MSCs下调了TGF-β1、Ⅰ型胶原及HSP47的表达,并且促进了MMP-2、MMP-9及MMP-13的表达,也使得α-SMA的表达下调。结论 MSCs可以重塑细胞外基质以及抑制肌成纤维细胞生成,从而抑制皮肤瘢痕形成,为MSCs在皮肤创伤修复领域中的应用提供了新的实验基础。     

大鼠骨髓间质干细胞脑内移植后分化行为的观察

目的:研究大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)植入大鼠脑内后,在脑微环境作用下的分化行为.方法:梯度离心法分离、培养、纯化MSC,Hoechst33342标记后植入大鼠海马CA4区;1,2,4周后处死大鼠取脑,制作冷冻切片;观察Hoechst33342阳性细胞,免疫荧光法CY3显示神经元特异性烯醇酶(neurone specific enolase, NSE)、神经巢蛋白(nestin)、神经胶质酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)、神经生长因子(nerve growth factor, NGF)阳性表达细胞.结果:MSC植入后可见大量细胞存活,沿针道、注射区向周围散在分布,植入细胞有呈红色荧光的NSE,nestin,GFAP及NGF阳性表达细胞.结论:MSC植入动物脑内后能够存活,并分化为神经系统样细胞,表达功能产物NSE、nestin、GFAP及NGF.     

大鼠骨髓间充质干细胞分化成心肌细胞的实验研究

目的 采用5-氮杂胞苷(5-aza)诱导骨髓间充质干细胞分化成心肌细胞。方法 分离培养骨髓间充质干细胞,采用密度为1．073的percoll分离液分离大鼠骨髓间充质干细胞并进行体外培养和连续传代,在第3代细胞以5-氮杂胞苷进行诱导,用免疫组化的方法鉴定心肌特异性肌钙蛋白I的表达。结果 诱导前,骨髓间充质干细胞形态均一,呈多突起扁平形态,诱导后细胞形态发生变化,细胞之间形成连接,排列方向渐趋一致,免疫组化显示表达阳性。结论 5-aza可诱导骨髓间充质干细胞分化成心肌细胞。     

骨髓基质干细胞的成软骨能力

目的 综述近年骨髓基质干细胞成软骨分化的研究进展。方法 广泛查阅近期有关骨髓基质干细胞成软骨分化的研究文献。着重阐述与成软骨分化有关的生长因子及分化后的组织成分。结果 骨髓基质干细胞取材方便，体外扩增迅速，在特定的软骨培养液和生长因子作用下，可形成软骨样组织。作为自体来源的细胞可修复动物关节软骨缺损，避免了免疫反应。结论 骨髓基质干细胞扩增后数量多，具有明确的成软骨能力，作自体移植无免疫反应，用于软骨组织工程有广阔的前景。成软骨分化的调控机制和应用值得进一步研究。     

人骨髓间充质干细胞向汗腺细胞诱导培养中基因表达方式的研究

目的通过诱导人骨髓间充质干细胞（hMSCs）向汗腺细胞（hSGCs）分化并检测经诱导后细胞的基因表达变化,探讨hMSCs的可塑性分化机制。方法分离纯化并体外扩增hMSCs,设立对照组（DM组）和向hSGCs诱导的SG组、EGF10组和EGF20组等四组不同培养基体系,观测细胞形态学变化和采用流式细胞仪、RT-PCR等方法检测融合细胞的基因和蛋白表达特征。结果细胞在不同条件培养液中诱导培养均能存活;诱导培养2d后细胞数量开始扩增,细胞形态也由间充质干细胞的长梭状开始向hSGCs的扁平状转变,在SG组尤其明显;诱导培养1周后细胞数量扩增明显;与汗腺发生形成密切的基因EGF和EGFR出现高丰度表达,并且表达了仅hSGCs才有表达的CK7蛋白。结论 hMSCs在不同介质诱导培养下可在形态学和分子水平上呈现向hSGCs横向分化的潜能,hMSCs的可塑性现象丰富了皮肤创面修复和汗腺再生理论。     

体外诱导人骨髓间质干细胞分化为肝细胞样细胞

目的:探讨人骨髓间质干细胞(MSCs)在体外特定条件下是否可以转化为肝细胞样细胞.方法:分离培养人骨髓间质干细胞,采用肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)及CCl4损伤的小鼠肝脏共培养等诱导方式,在不同时间点分别用RT-PCR和荧光定量PCR检测肝细胞特异性基因的表达,免疫组织化学染色检测肝细胞标志. 结果: 在HGF和bFGF诱导第7天时甲胎蛋白(alpha fetal protein,AFP)、细胞角蛋白18(cytokeratin-18, CK18)和色氨酸2,3-双加氧酶(tryptophan 2,3-dioxygenase,TDO)基因表达阳性,CK18和TDO的表达随诱导时间延长增高;第7天诱导细胞组织化学染色AFP、白蛋白(ALB)、肝细胞核因子(hepatocyte nuclear factor,HNF)、肝细胞特异性抗原(HSA)和CK18表达阳性.与损伤小鼠肝组织共培养21 d后细胞表达AFP和TDO.结论:HGF和bFGF联合诱导以及与CCl4损伤肝组织共培养的方法可体外促进人MSCs分化为肝细胞样细胞,可为肝脏疾病或肝损伤的干细胞治疗提供细胞来源.     

慢病毒转染人骨髓间质干细胞研究

目的:分离培养人骨髓来源间质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)并进行慢病毒载体介导的基因转染研究。方法:采取全骨髓贴壁培养法分离培养人骨髓MSCs。利用脂质体法进行慢病毒感染人骨髓MSCs。结果:分离培养出人骨髓来源的MSCs,并用携带绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的慢病毒成功感染人骨髓MSCs。结论:获得人骨髓MSCs并进行慢病毒载体介导的基因修饰,为间质干细胞基因工程和组织工程研究奠定了基础。     

Biological features of mesenchymal stem cells from human bone marrow

Objective To study the biological characteristics of mesenchymal stem cells (MSCs) from human bone marrow. Methods A culture of mesenchymal stem cells was initiated from bone marrow low-density mononuclear cells separated by Percoll Centrifugation and maintained in low-glucose Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) with 10% selected fetal calf serum. Cell growth pattern and its responses to cytokines were evaluated by trypan blue exclusion and MTT test, respectively. Cell cycle and surface antigenic features were analyzed by flow cytometry technique. Cytochemistry characteristics of MSCs were determined.Results Easy-handling methods to isolate and culture expand MSCs were developed in this study. MSCs were unique in their phenotypes. They were positive for CD29, CD44, CD166, and negative for CD34, CD45, HLA-DR and Ulex europaeus. Cytochemistry evaluation showed that MSCs were homogeneously positive for acid α-naphthl acetate esterase (ANAE), glycogen (periodic acid Schiff reaction, PAS), and negative for acid phosphatase (ACP) and the Sudan black reaction (SB). Around 5% of them were positive for alkaline phosphatase (ALP). The cells had a population doubling time of 30 hours and cell cycle analysis showed that approximately 10% of them were in S phase. MSCs grew at significantly different rates when incubated in the presence of various recombinant human cytokines, of which interferon γ, tumor necrosis factor α, stem cell factor and insulin-like growth factor promoted the proliferation of MSCs dramatically, while others tested had no effects on cell growth. Conclusions MSCs are a homogenous population of cells that have unique growth, phenotypical and cytochemical characteristics. Furthermore, the diverse responses of MSCs to different cytokines provide a clue for the selection of optimal expansion and maintenance of MSCs.     

骨髓间充质干细胞的免疫调节活性

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是一种多潜能的非造血干细胞,可以向多系分化,如骨、脂肪和软骨,并优先归巢于损伤组织,有利于组织修复。体外研究显示它们不诱导免疫应答,对识别、清除同种异体抗原的免疫细胞具有抑制作用。在动物实验中,骨髓间充质干细胞可以诱导外周免疫耐受并向损伤处迁移,抑制致炎细胞因子的释放,促进损伤组织修复。这种独特作用说明它们在细胞治疗和自身免疫性疾病治疗中发挥了积极作用。     

hPDGF-A/hBD2双基因转染对大鼠骨髓间充质干细胞生物学特性的影响

目的 探讨hPDGF-A/hBD2腺病毒双基因转染大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenehymal stem cells,BMSCs)后,对BMSCs本身生物学特性的影响.方法 体外分离培养大鼠BMSCs,应用GFP标记的腺病毒表达载体系统Adv-hPDGF-A-IRES-hBD2.以脂质体法转染293细胞,再以病毒上清液感染BMSCs,对转染目的 基因后的BMSCs进行形态学观察,绘制生长曲线,测定其细胞周期以及向成脂、成骨、成肌诱导分化和鉴定.结果 hPDGF-A/bBD2双基因成功转入BMSCs后,未发现其对细胞活性有明显作用,基因修饰后的BMSCs仍具有成体干细胞所具备的增殖能力,以及向成脂、成骨、成肌等方向分化的潜能.结论 BMSCs是重组腺病毒转染的良好靶细胞,hPDGF-A/hBD2基因修饰的BMSCs仍可作为满意的细胞治疗的种子细胞.