棉酚对多克隆激活剂活化人T淋巴细胞的抑制作用

目的:以体外培养的人外周血单个核细胞为材料,研究多酚类抗生育药物棉酚对正常人外周血T淋巴细胞体外活化作用的影响。方法:利用双荧光染色流式细胞术分析棉酚对人T淋巴细胞在丝裂原或佛波醇酯刺激下早期活化抗原CD69表达的影响。结果:100μmol/L的棉酚预先与T细胞温育,能完全抑制10mg/L植物血凝素(PHA)刺激的CD3^＋T细胞活化抗原CD69的表达,又可阻断10^－7mol/L佛波醇酯(PDB)对T细胞的活化作用。这种抑制作用呈剂量依赖性,棉酚对PDB及PHA抑制作用的IC₅₀分别为(35.7±2.9)μmol/L和(32.8±1.5)μmol/L。此外,棉酚对CD3^－的淋巴细胞CD69表达也有类似的抑制作用。然而,它对多克隆激活剂引起的T细胞表面分子CD3的下调无明显影响。结论:在体外活化模型中,棉酚能够同时抑制多克隆激活剂PHA和PDB对T细胞的活化作用,提示其作用部位可能位于PKC或下游,并提示棉酚具有潜在的免疫调节作用。     

正常人外周血TCRVα24+ NKT细胞体外活化特性观察

目的:探讨正常人外周血自然杀伤T(NKT)细胞的数量以及体外活化后表达CD69、IFN-γ和IL-4的规律并与CD3⁺ T细胞进行比较。方法:取正常成人外周血,直接三色荧光标记后溶血获取有核细胞,或以佛波醇酯(PDB)+离子霉素(Ion)刺激并培养6h,经三色荧光标记后溶血并获取有核细胞,以流式细胞术分析NKT细胞和T细胞的数量以及表达CD69和IL-4、IFN-γ的情况。结果:NKT细胞约占外周血T淋巴细胞总数的(1.34±0.42)%(x±s);PDB+Ion活化6h后NKT细胞CD69表达率为(96.71±1.33)%,明显高于对照组(11.47±2.86)%(P＜0.05);同样条件下CD3⁺T细胞CD69表达率分别为(98.60±0.47)%和(1.07±0.45)%(P＜0.05);当莫能菌素(monensin)存在时以PDB+Ion刺激6h后,IL-4阳性NKT细胞的百分比为48.62±2.44,明显高于对照组31.57±3.31(P＜0.05);IFN-γ阳性NKT细胞百分比为46.65±11.91,也高于对照组13.45±6.29(P＜0.01)。CD3⁺T细胞在刺激后表达IL-4和IFN-γ均明显升高,但IL-4表达率远远低于NKT细胞;而且对照组CD3⁺T细胞两种细胞因子表达率都明显低于NKT细胞。结论:正常成人外周血含有少量的NKT细胞,这些细胞IL-4和IFN-γ的表达率明显高于CD3⁺T细胞,是特定微环境里的重要免疫调节细胞。     

鼻息肉组织T淋巴细胞IFN-γ、IL-4的表达

目的:通过检测γ-干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-4(IL-4)两种细胞因子在鼻息肉组织T淋巴细胞(CD3⁺细胞)中的表达, 探讨鼻息肉的可能发病机制。方法:采用流式细胞术检测21例鼻息肉患者鼻息肉组织、外周血中T淋巴细胞IFN-γ、IL-4的分泌情况, 并与正常人下鼻甲粘膜及外周血进行比较。 结果:在正常人下鼻甲粘膜中几乎未见CD3⁺IL-4⁺和CD3⁺IFN-γ⁺细胞。鼻息肉组织中有大量T淋巴细胞浸润, IL-4、IFN-γ的含量分别为(13.606±0.644)%、(32.938±2.477)%;患者外周血中IL-4、IFN-γ的含量分别为(6.686±0.204)%、(64.312±1.611)%, 与之相比, 病人鼻息肉组织中IL-4的含量显著高于外周血(P＜0.05)而IFN-γ的含量明显低于外周血(P＜0.05)。正常人外周血IL-4、IFN-γ的含量分别为(0.560±0.051)%, (0.246±0.020)%, 与之相比, 病人外周血中IL-4、IFN-γ的含量均显著高于正常人(P＜0.05)。结论:鼻息肉患者鼻粘膜局部免疫异常, Th细胞因子分泌优势发生改变, 造成鼻腔粘膜"微环境"改变, 可能与鼻息肉的形成有密切关系。     

人外周血CD8+T细胞CD28、CD56及CD57表达水平的老年性改变

目的:通过对健康老年人与青年人外周血CD8⁺T细胞CD28、CD56及CD57表达水平的比较性研究,探讨免疫衰老的细胞学机制。方法:采用三色免疫荧光标记流式细胞术分析青年组(20-35岁)与老年组(60-75岁)外周血CD8⁺CD28⁺、CD8⁺CD56⁺及CD8⁺CD57⁺T细胞水平。结果:老年组外周血CD8⁺CD28⁺T细胞明显低于青年组,阳性百分率分别为34.07±5.29和49.84±7.43(P＜0.05);而老年组CD8⁺CD56⁺T细胞及CD8⁺CD57⁺T细胞均明显高于青年组,前者阳性百分率分别为6.60±2.40和2.10±0.35,后者阳性百分率分别为41.82±6.01和22.89±2.80(P＜0.05)。结论:老年人CD8⁺T细胞CD28、CD56及CD57的表达率均随年龄增长有明显改变;CD28表达下降可能是引起免疫系统功能降低的重要原因,而CD56、CD57表达水平的增加则可能是机体对细胞免疫功能下降的一种代偿性适应。     

Foxp3转染对哮喘小鼠脾淋巴细胞功能的影响

目的: 转染Foxp3至哮喘小鼠脾淋巴细胞,探讨Foxp3表达对脾淋巴细胞功能的影响。方法: 卵白蛋白(OVA)致敏激发制作哮喘小鼠模型,收集培养脾脏淋巴细胞;使用电穿孔法转染真核表达载体pcDNA3.1(-)-Foxp3至脾脏淋巴细胞,并设转染空质粒组和对照组;RT-PCR和Western blotting检测Foxp3的表达;流式细胞术检测转染后CD4⁺CD25⁺ Treg细胞/CD4⁺细胞比例;MTT法检测转染后的脾脏淋巴细胞增殖反应,ELISA检测脾淋巴细胞上清中白细胞介素4(IL-4)和干扰素γ(IFN-γ)的含量。结果: 转染组Foxp3 mRNA 和蛋白的表达水平显著高于空质粒组和对照组;转染Foxp3后CD4⁺CD25⁺ Treg细胞/CD4⁺细胞比例显著高于空质粒组和对照组;与空质粒组和对照组相比,转染pcDNA3.1(-)-Foxp3质粒明显抑制了脾淋巴细胞增殖;转染组细胞上清中IL-4和IFN-γ含量低于空质粒组和对照组。结论: 转染pcDNA3.1(-)-Foxp3至哮喘小鼠脾淋巴细胞,Foxp3得到有效表达。Foxp3的高表达能增加CD4⁺CD25⁺ T细胞的数量,抑制哮喘小鼠脾淋巴细胞的增殖以及Th1和Th2细胞因子的产生。     

H.polygyrus感染对T细胞介导的炎症性肠病的影响及其作用机制研究

目的: 研究多形螺旋线虫(H. polygyrus)感染对CD4⁺辅助性T细胞介导的小鼠炎症性肠病(IBD)的影响及其作用机制。方法: 用卵清蛋白(OVA)特异性的CD4⁺辅助性T细胞转入重度联合免疫缺陷(SCID)小鼠中制作IBD模型。将IBD小鼠感染H. polygyrus,14 d后处死小鼠,观察结肠的组织学变化,用ELISA法和流式细胞术检测肠系膜淋巴结中干扰素-γ(IFN-γ)和白细胞介素-4(IL-4)的表达。另外,对感染H. polygyrus的IBD小鼠注射IL-4单克隆抗体以阻断IL-4的分泌,9 d后处死小鼠,观察相同的指标。结果: 与无感染组相比,感染H. polygyrus的IBD小鼠结肠病损明显加重,肠系膜淋巴结中IL-4水平明显增高,IFN-γ水平明显降低(均P<0.05)。在IL-4阻断实验中,与无IL-4阻断组相比,IL-4阻断组结肠病损明显减轻,IL-4水平明显降低,IFN-γ水平明显增高(均P<0.05)。结论: H. polygyrus感染在CD4⁺ T细胞介导的IBD模型早期加重了炎症反应,其作用可能是通过诱导Th2细胞因子的分泌、抑制Th1细胞因子的分泌来实现的,提示用蠕虫治疗IBD时需谨慎。     

术前输注供者CD80low/CD86low树突状细胞，延长小鼠同种异体移植心脏存活

目的:应用B7-1和B7-2反义寡核苷酸(ASB7-1/ASB7-2oligo)抑制CD80(B7-1)、CD86(B7-2)在供体小鼠骨髓树突状细胞(DC)上的表达,观察这类DC对同种异体小鼠心脏移植存活时间的影响并探讨其机理。方法:小鼠B7-1和B7-2反义寡核苷酸在lipofectamine协助下分别转染供体鼠C57BL/10J(B10)小鼠骨髓DC,流式细胞仪检测其CD80/CD86的表达,证实为CD80^low/CD86^low。将各组DC经尾静脉输注到受体小鼠C3H/HeJ(C3H)体内,1周后进行心脏移植术,观察存活时间;体外实验观察各组DC对同种异体T细胞的激活作用,包括混合淋巴细胞反应、细胞毒性效应、及IL-2的产生。结果:ASB7-1和ASB7-2分别显著抑制DC表达CD80/CD86;转输这些CD80^low/CD86^lowDC可使小鼠心脏移植物存活时间显著延长,分别为(18.6±0.89)d和(23.67±10.73)d,与转输成熟骨髓DC(IL-4DC)组和生理盐水注射组(6.22±0.97)d、(11.17±1.72)d比较,均有显著差异(P<0.01);CD80^low或CD86^lowDC对异体T细胞激活作用较弱,表现为T细胞增殖能力、IL-2产生及细胞毒杀伤均明显低。结论:应用反义寡聚核苷酸转染供者DC,降低其CD80或CD86的表达,可以抑制供者特异性的免疫应答,延长移植物存活时间。     

正常成人外周血Th1/Th2细胞亚群体外活化的研究

目的:探讨CD4⁺T细胞在体外活化的条件下向Th1或Th2极化的规律。方法:用Ficoll-Hypaque梯度离心法分离出正常成人抗凝外周血单个核细胞(PBMC)和血浆,将PBMC置于含或不含有自身血浆环境中,并在植物血凝素(PHA,20mg/L)的刺激下进行培养,培养24、48、72h后收获细胞,分别用双色免疫荧光标记,以流式细胞术对CD4⁺T细胞表达表面分子CCR3、CCR5进行分析。结果:CD4⁺T细胞受自身血浆和PHA刺激后向Th1/Th2两个方向极化,24、48、72h后极化率分别达到(13.28±1.59)%/(12.70±1.65)%、(17.19±1.03)%/(17.50±1.30)%、(19.49±2.87)%/(18.58±1.49)%;而只有PHA刺激的极化率很低,两组有显著性差异(P＜0.01);Th1∶Th2之比约等于1。结论:正常成人外周血CD4⁺T细胞可以在体外自身血浆和PHA的条件下明显极化,而且Th1/Th2细胞处于等值的平衡状态。     

心理应激对正常人外周血T淋巴细胞体外活化表面分子表达的作用

目的:探讨心理应激增加对感染的易感性的细胞和分子免疫学机理。方法:采用双荧光染色流式细胞分析法对20名健康大学生志愿者(男女各半)在应激前后进行外周血淋巴细胞免疫表型及T细胞体外丝裂原刺激早期活化抗原表达分析。连续一周期末考试被设定为心理应激。结果:免疫表型分析显示,应激前后CD2、CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD16、CD56等淋巴细胞的表面分子阳性的细胞的百分比的差异无统计学显著性;与应激前的结果相比,应激后的T细胞在体外培养条件下多克隆刺激剂活化后CD69的表达明显降低,植物血凝素(phytohemagglutinin,PHA)组CD69⁺CD3⁺/CD3⁺的百分率由应激前的28.1±4.1降低到应激后的17.6±3.8,佛波醇酯(phorbol 12,13-dibutyrate,PDB)组CD69⁺CD3+/CD3⁺的百分率由应激前的80.7±6.8降至应激后的65.8±7.9,而在没有刺激剂作用的条件下,T细胞CD69表达率应激前后的差别无显著。结论:应激对免疫系统的影响并不在于改变外周血淋巴细胞各亚群的比例的层面上;心理应激能降低健康人T细胞体外活化的反应性,这可能与心理应激个体对感染的易感性增加有关。     

2型糖尿病患者CD14CD16单核细胞的水平及其对LPS和IL-15刺激的反应

目的: 研究2型糖尿病(T2DM)患者外周血CD14⁺CD16⁺单核细胞的比例及脂多糖(LPS)联合白细胞介素 15(IL-15)对其的影响,以了解炎症性免疫反应在T2DM中的可能作用机制。方法: 对28例T2DM患者和20例健康志愿者外周血用流式细胞术检测CD14⁺CD16⁺单核细胞的比例,并分离其外周血单个核细胞(PBMC),用LPS和IL-15干预4 h,收集PBMC和培养上清。分别采用Western blotting检测PBMC内STAT5和p-STAT5蛋白表达。免疫荧光检测p-STAT5蛋白表达,ELISA法检测外周血25-羟维生素D₃ 和IL-6浓度,免疫比浊法检测其外周血C-反应蛋白(CRP)水平, ELISA法检测LPS和IL-15干预后细胞培养上清IL-6和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的浓度。结果: T2DM组外周血CD14⁺CD16⁺单核细胞数量明显高于正常对照组(P<0.01),并与血清CRP和IL-6水平呈正相关(r=0.394,P<0.05和r=0.741,P<0.01),与25(OH)D₃浓度呈负相关(r=0.409,P<0.01),且25(OH)D₃水平与CRP和IL-6水平均呈负相关(r=-0.479和r=-0.774,均P<0.01),LPS联合IL-15刺激后PBMC的p-STAT5蛋白表达水平和PBMC培养上清IL-6、MCP-1浓度明显高于正常对照组(P<0.01),且T2DM患者p-STAT5的表达存在激活现象。结论: T2DM患者体内存在单核细胞功能紊乱,这种功能紊乱可能与活性维生素D₃不足有关,二者可能参与了T2DM患者体内免疫炎症反应并与微炎症互为因果,从而导致了T2DM及其并发症的发生发展;其作用机制可能与STAT5信号通路的激活有关。     

重组病毒趋化因子vMIP对脂多糖刺激的细胞免疫功能的影响

了解重组病毒趋化因子vMIP作用前后及内毒素刺激后细胞内细胞因子IL-4和IFN-γ水平的变化,探讨vMIP对免疫功能的影响。方法:通过放射性配体－受体结合实验、ELISA法及流式CD4⁺T细胞的细胞内染色法检测外周血单个核细胞的培养上清IL-12水平及细胞内细胞因子IFN-γ及IL-4分泌水平的变化。结果:通过竞争结合细胞膜表面趋化因子受体,vMIP-II可减缓高浓度LPS引起的爆发式细胞因子IL-12、IFN-γ产生;vMIP可促进IL-12、IFN-γ和IL-4分泌。结论:病毒趋化因子vMIP-II可调节CD4⁺T细胞分泌IFN-γ和IL-4,从而下调过激的炎症反应,并对感染性休克可能有拮抗作用。     

肿瘤相关巨噬细胞在晚期卵巢癌组织中的浸润与肿瘤浸润淋巴细胞表型、免疫效能之间的关系

目的:探讨晚期卵巢癌组织中浸润的肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophage,TAM)与肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocyte,TIL)表型及免疫效能的关系。方法:免疫组化方法分析175例低分化卵巢癌组织病理切片中TAM分布密度,以中位数为界限将病例分为TAM高密度组和TAM低密度组,对照组为32例良性卵巢病变组织;应用流式细胞术分析TAM高密度组与TAM低密度组中TIL的CD8⁺和CD25⁺表型变化情况;体外扩增培养TIL后取细胞培养上清液,ELISA法分析各组TIL中白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素-10(IL-10)、转化生长因子β(TGF-β)和干扰素γ(IFN-γ)细胞因子表达变化。结果:175例低分化卵巢癌组织中TAM平均浸润密度为62.8/高倍镜视野(HP,×400),中位数为53.3/HP,其中TAM高密度组87例,TAM低密度组88例;对照组TAM平均浸润密度10.5/HP(P<0.05)。CD8⁺在TAM高密度组中表达平均值为24%,在TAM低密度组中表达平均值为52%(P<0.05);CD25⁺在TAM高密度组中表达平均值为48%,在TAM低密度组中表达平均值为25%(P<0.05);对照组中CD8⁺和CD25⁺的TIL平均浸润密度为7%, TAM高密度组及TAM低密度组中CD8⁺和CD25⁺的TIL平均浸润密度显著高于对照组(P<0.05)。与TAM低密度组比较,TAM高密度组中TIL的杀伤性细胞因子IL-2和IFN-γ表达明显减少(P<0.05),而抑制性细胞因子IL-10和TGF-β表达明显增加(P<0.05)。结论:高密度TAM浸润的卵巢癌组织中,CD25⁺的TIL表型增多,CD8⁺的TIL表型减少,抑制性细胞因子IL-10和TGF-β表达增加,杀伤性细胞因子IL-2和IFN-γ表达减少,提示TAM浸润密度与TIL表型及免疫效能相关。     

同种异基因移植引流淋巴结及外周血T细胞活化分析

目的:研究同种异基因移植早期局部引流淋巴结和外周血T细胞的活化情况。方法:以小鼠前臂皮下非血管化心肌移植为模型,利用流式细胞术分析前臂引流淋巴结及外周血不同T细胞亚群的CD69表达水平。结果:同种异基因移植后72h,引流淋巴结CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞的CD69表达百分率均明显高于移植前(P＜0.01),且CD8⁺T细胞的表达水平高于CD4⁺T细胞(P＜0.01);各组外周血CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞的CD69表达百分率均无显著差异;局部应用弗氏完全佐剂和全身应用CsA可分别增强和抑制同种异基因移植后CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞的CD69表达(P＜0.05或P＜0.01)。结论:局部引流淋巴结T细胞CD69的表达水平可及时反映受者T细胞对同种异基因抗原的识别情况。     

镁对哮喘患者外周血CD4+ CD25+调节性T细胞凋亡及Foxp3表达的影响

目的:观察镁对分离培养的健康人和哮喘患者外周血CD4⁺CD25⁺调节性T细胞凋亡及叉头框蛋白3(Foxp3)表达的影响。方法:经磁珠分离法分离出健康人和哮喘患者外周血CD4⁺CD25⁺T细胞,分镁剂干预组(10 mmol/L)及空白组培养72 h后,用流式细胞仪检测CD4⁺CD25⁺T细胞的凋亡率及Foxp3表达情况。结果:(1)健康人外周血CD4⁺CD25⁺T细胞的纯度为77.4％~92.3%,哮喘患者CD4⁺CD25⁺T细胞的纯度为75.2％~93.8％。(2)CD4⁺CD25⁺T细胞占外周血CD4⁺T细胞的比例在健康组为4.12%~7.98%,在哮喘组为4.51%~8.68%,两者没有显著差异(P＞0.05)。(3)镁(10mmol/L)可以诱导健康组及哮喘组外周血CD4⁺CD25⁺T细胞凋亡率增加(P＜0.05),但对Foxp3的表达无影响(P＞0.05)。结论:镁促进CD4⁺CD25⁺T调节细胞凋亡增加可能为其治疗支气管哮喘的作用机制之一。     

BCR-ABL-SEA DNA疫苗诱导BALB/c小鼠的免疫应答

目的: 了解BCR-ABL-SEA双表达DNA疫苗诱导BALB/c小鼠特异性细胞和体液免疫应答效应。方法: 用已成功构建的重组双表达BCR-ABL 多肽和 SEA多肽的质粒BCR-ABL-pIRES-SEA (B-P-S)免疫小鼠,间隔14 d共3次。相同方法用单表达BCR-ABL 多肽或 SEA多肽的质粒BCR-ABL-pIRES 和SEA-pIRES免疫小鼠作对照。利用CCK-8 比色法检测小鼠脾脏T 细胞对K562细胞株的杀伤活性;流式细胞术测定小鼠脾脏CD4⁺与CD8⁺T细胞表达情况;ELISA法检测小鼠血清中干扰素γ(IFN-γ)和白细胞介素4(IL-4)生成情况;间接免疫荧光法检测血清中抗BCR-ABL抗体。结果: 免疫后第7周时,双表达重组质粒B-P-S组小鼠脾脏CTL细胞针对K562杀伤率、血清中INF-γ含量均明显高于单表达BCR-ABL-pIRES组和SEA-pIRES组(P<0.05);CD4⁺/CD8⁺T细胞比值、血清中IL-4含量各组之间无明显差异(P>0.05);荧光显微镜检测到血清中有抗BCR-ABL抗体。结论: 所构建的BCR-ABL-SEA重组双表达质粒可诱导小鼠产生特异性细胞和体液免疫应答效应。     

慢性乙肝患者外周血CD4CD25FOXP3 Tregs及HBV抗原特异性CTLs的检测和分析

目的: 检测慢性乙肝(CHB)患者外周血中CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺调节性T淋巴细胞(Treg细胞)和乙肝病毒(HBV)特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)的表达及意义。方法: 收集28例CHB患者和15例健康人外周血单个核细胞标本,运用流式细胞仪对Treg细胞亚群进行定量分析,同时采用酶联免疫斑点法检测HBV抗原特异性CTLs,并结合丙氨酸氨基转移酶(ALT)和 HBV DNA的临床情况进行分析。结果: CHB组CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺ Treg细胞的频率显著高于健康对照组 (3.14%±0.97% vs 1.95%±0.68%,P＜0.05);HBV抗原特异性CTL斑点计数为阳性(19.28±3.85)。CHB组Treg的频率与乙肝病毒载量呈正相关(r=0.831, P＜0.01),与HBV特异性CTL斑点计数值呈负相关(r＝-0.540,P＜0.01)。结论: CHB患者外周血CD4⁺CD25⁺FOXP3^＋Treg细胞表达升高并与病毒载量相关,而与HBV反应的CTLs数量呈负相关,提示Treg细胞可通过抑制细胞免疫反应影响病毒清除。     

Th17细胞联合CD3+CD8-IL-21+T细胞升高与宫颈癌发生发展的关系

目的: Th17细胞在免疫调节中起重要作用,而IL-21与Th17在分化调节和功能行使上密切相关。本研究旨在探讨Th17在宫颈癌发生发展中的作用。方法: 选取37例宫颈癌患者、25例宫颈上皮内瘤变(CIN)患者和18例健康志愿者作为研究对象,用流式细胞分析术检测外周血中Th17细胞及CD3⁺CD8^-IL-21⁺T细胞的比例。分析两者与临床病理指标之间的关系。结果: 与健康对照组相比,Th17细胞及CD3⁺CD8^-IL-21⁺ T细胞比例(占淋巴细胞百分比)在CIN组(P<0.01,P<0.05)及宫颈癌组(P<0.01,P<0.05)均明显升高。此外,2种细胞的比例都与临床分期有关,在晚期宫颈癌组明显升高(均P<0.05),并且有淋巴结转移组或脉管浸润组都明显高于相对应的无转移组(P<0.01, P<0.05)或无浸润组(均P<0.01)。此外,在健康对照组和宫颈癌组,Th17与CD3⁺CD8^-IL-21⁺ T细胞呈正相关,CD3⁺CD8^-IL-21⁺ T细胞的比例还与肿瘤大小有关(P<0.01)。结论: Th17和CD3⁺CD8^-IL-21⁺ T细胞在宫颈癌患者外周血中的比例上调,在宫颈癌的发生发展中可能起着重要作用。     

不成熟CD8α+DC经同种白血病抗原冲击后移植物抗白血病效应的体外研究

目的: 观察不成熟CD8α⁺树突状细胞(DC)体外经同种异基因白血病细胞全抗原冲击后的移植物抗白血病(GVL)效应。方法: C57BL/6(H-2^b)小鼠的骨髓细胞以GM-CSF +IL-4 +SCF +Flt3L体外诱导不成熟CD8α⁺DC,第3 d加入0 mg/L、2.5 mg/L、5 mg/L、10 mg/L和20 mg/LBALB/c(H-2^d)小鼠来源的同种异基因EL9611红白血病细胞抗原冲击,冲击后DC与同系(H-2^b)T细胞按DC/T 1∶1、2∶1、4∶1比例共培养,MTT法观察T细胞增殖情况,ELISA法检测上清中IFN-γ和IL-10的含量,LDH释放法检测T细胞对EL9611细胞的杀伤活性。以成熟DC为对照,观察同种异基因不成熟CD8α⁺DC体外对EL9611白血病细胞的GVL效应。结果: 同种红白血病全抗原冲击后不成熟CD8α⁺DC可有效刺激同系T细胞增殖,作用随DC/T比例增加而增加,增殖效应在 小剂量抗原(≤5 mg/L)冲击时更明显(P<0.05);Ag冲击后不成熟CD8α⁺DC刺激T细胞分泌IFN-γ和IL-10明显增高(P<0.05),IL-10的分泌与不成熟CD8α⁺DC发挥GVL效应存在一定的负相关关系,Ag冲击浓度较低而IL-10分泌少时,T细胞增殖活性较强。杀伤实验结果显示,白血病特异性T细胞对EL9611靶细胞的杀伤活性随抗原冲击浓度的增加而升高,浓度为2.5 mg/L时,杀伤率即可达90%,非特异性杀伤实验显示白血病特异性T细胞对同种异基因正常脾细胞的杀伤活性低于对照组(P<0.05),表明杀伤作用为抗原特异性杀伤,对正常细胞无明显杀伤。结论: 经同种异基因白血病抗原冲击后不成熟CD8α⁺DC体外能刺激同系T细胞产生一定的GVL效应。     

肝癌细胞冻融抗原负载树突状细胞瘤苗的制备与活化

目的: 探讨制备肝癌树突状细胞(DCs)瘤苗和体外诱导DCs活化的优化方法。方法: 取健康人新鲜血50mL, Ficoll密度梯度离心分离外周血单个核细胞(PBMC), 制备肝癌细胞冻融抗原, 采用不同因子组合培养PBMC, 诱导和激活DCs, A组: rhGM-CSF+IL-4; B组: rhGM-CSF+IL-4+冻融抗原负载;C组:rhGM-CSF+IL-4+TNF-α; D组: rhGM-CSF+IL-4+TNF-α+冻融抗原负载。结果: 各组均诱导出DCs, 并高表达CD11c和CD54, 冻融抗原可明显上调CD86、CD80、HLA-DR表达和IL-12 p40分泌(P<0.01), TNF-α促进CD86表达的作用更显著, 但对IL-12分泌无影响, 依次用TNF-α诱导和冻融抗原负载可进一步促进CD86表达和IL12 p40分泌(P<0.05)。CD54和HLA-DR双标记免疫细胞化学染色显示, 各组DCs大多为CD54⁺。表达HLA-DR的DCs均为CD54⁺HLA-DR⁺, 其中, A组CD54⁺HLA-DR⁺细胞数量最少, D组最多, 平均每个细胞HLA-DR的表达水平也与此对应。结论: 采用rhGM-CSF、IL-4诱导的未成熟DCs, 依次使用TNF-α刺激与肝癌细胞冻融抗原修饰可有效促进DCs的活化与成熟。     

丙戊酸钠对人外周血T淋巴细胞细胞因子表达的影响

目的: 研究丙戊酸钠(VPA)对人外周血T淋巴细胞的活化、凋亡及细胞因子表达的影响。方法: 双色荧光抗体染色结合流式细胞术分析VPA对多克隆刺激剂二丁酸佛波酯(PDB)和离子霉素(Ion)刺激下的人外周血T细胞CD69表达的影响,DiOC₆(3)染色检测VPA对T细胞凋亡的影响。 利用胞内细胞因子染色检测T细胞IL-2、IL-4、IFN-γ和TNF-α的表达,以探讨VPA的保护机制。 结果: VPA (1和5 mmol/L)对PDB和Ion诱导的人外周血T细胞CD69的表达具有明显的促进作用 (P<0.01)。DiOC₆(3)染色结果表明VPA(1和5 mmol/L)可以增强线粒体膜电势,抑制T细胞活化诱导的凋亡,高浓度则作用相反。胞内细胞因子染色分析显示,VPA在低浓度时能明显促进IL-2表达而高浓度时则抑制。同时,VPA能显著促进IFN-γ和TNF-α的表达(P<0.05),并呈剂量依赖性,而对IL-4表达的影响较小。结论: VPA对多克隆刺激剂诱导的人外周血T细胞的活化和凋亡具有双向调节作用,诱导IL-2、IFN-γ和TNF-α的表达。