小鼠胸腺树突状细胞的分布与形态学观察

目的研究小鼠胸腺树突状细胞的分布与形态。方法运用光镜、电镜和树突状细胞标志物(CD205、CDla与MIDC-8)免疫组化标记方法观察小鼠胸腺树突状细胞的分布、含量与形态。结果小鼠胸腺树突状细胞在皮髓交界区分布最多,然后依次为皮质区和髓质区。树突状细胞约占胸腺细胞总数的2％。胸腺树突状细胞表面形成胞浆突起向,周围包绕的淋巴细胞间延伸,核不规则,多有凹陷,胞浆低电子密度,细胞器稀少且不含溶酶体。结论多种树突状细胞标志物联合标记,结合光镜、电镜形态学观察,可以有效地计数并显示胸腺树突状细胞的形态特征。     

MODS小鼠脾脏树突细胞PD-1、PD-L1的表达变化及其意义

目的观察多器官功能障碍综合征(MODS)小鼠脾脏树突细胞(DC)中负性共刺激分子(PD-1、PD-L1)和CD86、MHC-Ⅱ的表达情况,探讨DC在脓毒症末期免疫抑制中的作用和机制。方法130只C57BL/6小鼠随机分为6h、12h、24h、48h、5-7d、10-12d组和对照组,前6组实验小鼠采用腹腔注射酵母多糖法复制脓毒症-MODS模型(每组20只),对照组(10只)不做处理。观察各组脾脏的病理形态学改变,使用BDIMagTM树突细胞富集磁珠分离出脾脏DC,运用流式细胞仪检测脾脏DC中PD-1、PD-L1、MHC-Ⅱ分子(I-Ab)及CD86的表达变化规律及其与病程的关系。结果24h、48h组和10-12d组实验小鼠脾脏组织结构明显破坏。脾脏DC中PD-L1的表达在病程早期(6h)即明显升高(78.4%±34.5%,P<0.05),而后迅速下降,至24h时恢复至正常水平,5d后再度升高,持续至病程终末的MODS期(10-12d)达到高峰(81.7%±31.8%,P<0.01)。PD-1在脾脏DC中表达量较低,但具有与PD-L1相同的变化趋势。MHC-Ⅱ分子(I-Ab)与CD86在致伤早期(6h)明显升高...     

肺表面活性蛋白A在皮质类固醇调节哮喘小鼠树突细胞共刺激分子表达中的作用

目的 研究皮质类固醇激素调节小鼠哮喘模型树突细胞表面共刺激分子表达的机制，以及肺表面活性蛋白A（SP-A）在其调节中的作用。方法 BALB/c小鼠30只，分为3组：哮喘组，采用卵蛋白（OVA）致敏和激发；对照组，以生理盐水代替OVA；治疗组，每次OVA激发后10min，腹腔注射地塞米松01mg。用免疫组化法检测SP-A在肺内的表达情况。采用Leica DM Snk软件进行图像采集，并用Qwin软件计算小气道内棕色区域面积，取平均值，进行统计分析。分离培养脾脏树突细胞，用流式细胞仪（FACS）检测树突细胞表面共刺激分子CD80的表达变化。结果 哮喘组肺组织表现为嗜酸性细胞及淋巴细胞浸润为主的炎症变化，治疗组和对照组无此变化。哮喘组的SP-A表达明显低于对照组和治疗组（P〈0．01），CD80的表达率明显高于治疗组（P〈0.01）；哮喘组小气道内SP-A表达与树突细胞CD80阳性率呈负相关（r=-0．907，P〈0．01）。结论 皮质类固醇对小鼠哮喘模型的肺表面活性蛋白有明显的保护作用，可通过激发肺表面活性蛋白抑制树突细胞表面共刺激分子CD80的表达。     

吲哚胺2,3-双加氧酶基因转染未成熟树突细胞对卵蛋白致敏小鼠模型CD4+T细胞的影响

目的以pEGFP-N1-IDO真核表达载体转染未成熟树突细胞,观察吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)基因对CD4 T细胞的影响。方法体外扩增小鼠骨髓来源的未成熟树突细胞,采用光镜、扫描电镜、透射电镜、流式细胞技术鉴定后,采用DOTAP脂质体转染法进行转染,倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达。同时建立卵蛋白致敏小鼠模型,分离并纯化脾脏CD4 T细胞,用3H-TdR掺入法进行混合淋巴细胞反应实验,观察IDO转染未成熟树突细胞对卵蛋白致敏小鼠模型脾脏CD4 T细胞增殖的影响,并用TUNEL法检测CD4 T细胞凋亡情况。结果IDO基因转染未成熟树突细胞能抑制卵蛋白致敏小鼠模型CD4 T细胞增殖,pEG-FP-N1-IDO质粒转染组CD4 T细胞减少,与pEGFP-N1空质粒转染组和对照组比较差异显著(P<0.05);IDO基因转染未成熟树突细胞可诱导CD4 T细胞凋亡,pEGFP-N1-IDO质粒转染组CD4 T细胞凋亡率为15.3%±2.6%,明显高于对照组和pEGFP-N1空质粒转染组和对照组(P<0.01)。结论IDO基因表达的上调可能是诱导哮喘免疫耐受的机制之一。     

小鼠骨髓树突状细胞的体外诱导培养及生物学特性分析

目的探讨从小鼠骨髓中体外诱导培养树突状细胞（DC）的可行性并进行生物学特性分析与鉴定。方法用重组小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（rmGM-CSF）体外诱导小鼠骨髓细胞分化为树突状细胞,倒置显微镜动态观察形态学变化,扫描电镜观察其表面形态特征,流式细胞术分析细胞表面分子,同时进行抗原吞噬功能和刺激初始型T淋巴细胞增殖能力的检测。结果经体外诱导培养可获得大量未成熟和成熟DC,出现典型树突状形态。未成熟DC的细胞表型为CD11c^high、MHCⅡ^low、CD86^low,具有极强的抗原吞噬能力;未成熟DC经LPS刺激培养后可转变为成熟DC,细胞表型为CD11c^high、MHCⅡ^low、CD86^low,可显著刺激同种异体混合淋巴细胞增殖。结论体外诱导培养可获得小鼠骨髓来源的未成熟和成熟DC。     

严重创伤对小鼠体内单核细胞向树突状细胞分化及迁移过程的影响

目的 观察严重创伤对小鼠体内单核细胞向树突状细胞分化及迁移的影响.方法 皮下注射FITC荧光微球,细胞计数,流式细胞仪检测等观察引流淋巴结荧光阳性细胞数量及所占比例;荧光显微镜观察注射局部炎性细胞浸润情况及局部组织荧光强度;丙酮提取法检测局部残余荧光物质并计算局部荧光物质清除率.结果 严重创伤动物引流淋巴结FITC荧光阳性细胞百分比(0.021±0.009)%及绝对数量[(492±211)个]均显著低于正常对照组动物[(0.040±0.012)%,P＜0.05;(726±218)个,P＜0.05];伤后早期创伤动物微球注射局部炎性细胞浸润明显增强;严重创伤动物耳片荧光微球清除率在注射微球后1、2、4和6天均显著高于正常对照组动物,差异显著(P＜0.05)或非常显著(P＜0.01).结论 严重创伤后小鼠体内单核细胞向树突状细胞的分化并迁移的过程发生了障碍,该障碍并非是由于单核细胞浸润炎性病灶和吞噬细胞摄取抗原及迁移启动受阻所致.     

雷公藤甲素对调节性树突细胞的免疫效应及其机制研究

目的 探讨雷公藤甲素(TPT)对分泌IL-10的树突细胞(D C)亚群CDllclowCD45RBhighDC功能的影响.方法 采用磁珠分选技术获得C57BL/6小鼠脾脏CD11clowCD45RBhighDC和CD4+T淋巴细胞.CD11clowCD45RBhighDC分别加入1、10、20ng/ml TPT后进行培养,以不加TPT的细胞作为对照,流式细胞仪检测细胞表面分子CD40、CD80、CD86、I-a/e的表达,ELISA法检测培养液中IL-10的含量.将CD4+T淋巴细胞分为正常对照组(未作任何处理)、未刺激组(与未经TPT处理的CD11clowCD45RBhighDC混合培养)、高浓度TPT刺激组(与经20ng/ml TPT处理后的CD11clowCD45RBhighDC混合培养)、高浓度TPT刺激+抗体1(抗IL-10抗体)组、高浓度TPT刺激+抗体2(IL-10的同型对照抗体)组,采用MTT法测定CD4+T淋巴细胞的增殖活性,流式细胞仪检测CD4+T淋巴细胞培养液中IL-4和IFN-γ的含量.结果 与对照组相比,TPT能显著降低CD11clowCD45RBhighDC表面分子CD40和I-a/e的表达,增强CD86的表达及IL-10的分泌,其中IL-10的分泌水平随TPT浓度的增加而增加.高浓度TPT刺激组和高浓度TPT刺激+抗体2组细胞增殖活性及IFN-γ分泌水平明显低于未刺激组,IL-4分泌水平明显高于未刺激组,而高浓度TPT刺激+抗体1组细胞增殖活性及IFN-γ分泌水平明显高于未刺激组,IL-4分泌水平明显低于未刺激组.结论 TPT可促进CD11clowCD45RBhighDCIL-10的分泌,诱导CD4+T淋巴细胞向Th2型分化,并可通过激活CD11clowCD45RBhighDC介导机体的免疫抑制活性.     

树突状细胞和细胞因子诱导杀伤细胞联合白介素2治疗肾癌临床观察

目的 观察树突状细胞(dendritic cells,DC)和细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cells,CIK)联合白介素-2(interleukin-2,IL-2)治疗肾癌的疗效.方法 回顾性分析2005年7月至2011年6月间60例肾癌术后患者,分离外周血单核细胞,体外诱导生成DC细胞;T淋巴细胞体外诱导生成CIK细胞.患者在切除原发病灶后,接受DC+CIK细胞免疫治疗,并给予IL-2静滴21 d.免疫学反应和临床疗效分别通过淋巴细胞亚群分析、影像学检查进行评估.结果 治疗后患者外周血细胞毒T细胞、NK细胞、NKT细胞百分比较治疗前增高,差异有统计学意义.42例Ⅰ～Ⅲ期行根治性肾切除术患者,2例失访,1例复发,余未见复发、转移,随访时间7～67个月,中位随访时间16个月;18例Ⅳ期行姑息性肾切除患者中1例失访,随访的17例中1例CR,3例PR,8例SD,5例PD,随访时间6～66个月,中位随访时间15个月,无显著不良反应出现.结论 DC+CIK联合IL-2治疗能够增强肾癌术后患者的免疫功能,降低根治性切除术后肿瘤的复发率,并且对于转移性肾癌的治疗也显现一定的疗效,耐受性良好.     

应用基因表达谱芯片研究内毒素诱导的人树突细胞成熟前后免疫相关基因的差异表达

目的研究人外周血来源的树突细胞(DCs)经内毒素诱导成熟过程中基因表达谱的改变。方法采用GM-CSF及IL-4诱导人外周血单核细胞获得非成熟DCs,以100ng/ml内毒素(LPS)作用48h获得成熟DCs,收集细胞提取总RNA,应用SuperArray低通量全长基因cDNA芯片筛选DCs成熟前后差异表达的基因。结果经LPS诱导后DCs高表达成熟DCs表面标志物。经LPS处理48h后诱导成熟的DCs与未经处理的非成熟DCs相比,共有50条基因出现差异表达,占芯片基因总数的30.3%。其中35条基因表达增加,15条基因表达下降。细胞因子/受体和趋化因子/受体基因中有12条表达上调,2条表达下调,抗原获取及提呈相关分子中有10条表达上调,5条表达下调,膜受体及信号转导分子中13条表达上调,8条表达下调。RT-PCR进一步证实了基因表达谱芯片的结果。结论LPS对DCs成熟过程中的基因表达具有显著影响,其范围涉及细胞因子、趋化因子及受体,抗原提呈相关分子及细胞内信号转导分子等。分析这些差异基因的表达,对进一步全面了解DCs成熟过程有重要意义。     

高迁移率族蛋白B1对大鼠脾脏树突状细胞表面共刺激分子表达的影响

目的观察高迁移率族蛋白B1(HMGB1)对树突状细胞(dendritic cells,DC)表面共刺激分子表达的影响,并对其机制进行初步探讨。方法分离正常Wistar大鼠脾脏DC后置于96孔培养板(1×10~5/孔),采用HMGB1刺激,观察HMGB1刺激与DC表面共刺激分子CD80、CD86和主要组织相容性复合物(MHC)Ⅱ表达的时间-效应关系及剂量-效应关系。结果HMGB1刺激后,DC表面共刺激分子CD80、CD86和MHCⅡ表达分别于24～72 h明显上调(P＜0．05,0．01),其中以作用48 h后DC表面共刺激分子表达上调尤为显著(P＜0．01)；0．1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml的HMGB1刺激均可诱导DC表面共刺激分子CD80、CD86和MHCⅡ表达增强(P＜0．05,0．01),其中HMGB1的浓度在1μg/ml时,大鼠DC表面共刺激分子CD80、CD86和MHCⅡ的表达增强最明显(P＜0．01)。结论HMGB1能诱导DC表面共刺激分子表达增强,HMGB1可能是诱导DC成熟的免疫刺激信号。