烧伤大鼠血清对大鼠骨髓间充质干细胞基因表达的影响

目的：观察烧伤大鼠血清对体外培养的大鼠骨髓问充质干细胞(MSCs)基因表达的影响。方法：分离Wistar大鼠骨髓,原代培养MSCs,传代后分别用含有体积分数为10％的正常大鼠血清(N组)和烧伤后3天大鼠血清(B组)的F-12培养基培养24h,然后以含有5705种基因的寡核苷酸微阵列检测两组细胞基因表达的差异。结果：两组MSCs对比,有4种基因表达存在明显差异。其中B组类固醇敏感基因-1(Ssg-1)表达减弱,而磷酸二羟基丙酮酰基转移酶(Gnpat)基因、成纤维细胞生长因子4(FGF-4)基因和与骨形成蛋白-2可诱导激酶的序列有部分相同的一条EST表达增强。结论烧伤后大鼠血清刺激MSCs可使其基因表达发生改变,这种改变可能与MSCs受到刺激后参与创面修复有关。     

法舒地尔对人骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化的影响

 目的探讨HA-1077(fasudil,法舒地尔)对人骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为表皮细胞的影响.方法采用直接贴壁法培养并扩增人胚胎股骨骨髓干细胞,免疫细胞化学及流式细胞仪进行表面标志的检测.设对照组、诱导组、HA-1077诱导组1、HA-1077诱导组2,采用免疫细胞化学及流式细胞仪对各组细胞角质蛋白表达变化进行检测,观察其对MSCs分化为表皮细胞的影响.结果采用直接贴壁法可以获得大量高纯度的人骨髓MSCs,分组培养后第2天开始出现少量细胞角质蛋白阳性表达细胞,随着时间延长,阳性率逐渐提高.7天后流式细胞仪显示单纯诱导组及HA-1077诱导组CK5/8、CK10/13、CK19阳性率均远高于诱导组(P＜0.01).结论HA-1077可能通过抑制Rho-ROCK途径的激活从而促进MSCs体外培养中角蛋白表达的显著提升,Rho-ROCK途径可能在促进MSCs分化为表皮细胞过程中起着重要调控作用.     

瘀胆血清体外诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的实验研究

目的探讨骨髓间充质干细胞（MSCs）体外诱导其分化为肝细胞的可行性。方法分离、纯化并鉴定大鼠骨髓MSCs,制备正常及瘀胆大鼠血清,取第3代MSCs分组培养：A组：DMEM＋10％FBS;B组：肝细胞生长培养基（HGM）＋5％FBS0、组：HGM＋5％正常大鼠血清;D组：HGM＋5％瘀胆大鼠血清;E纽：HGM＋5％瘀胆大鼠血清＋25ug／LHGF。观察各组细胞形态变化,MTT法测定细胞生长曲线,采用RT～PCR检测甲胎蛋白（AFP）和细胞角蛋白18（CK18）的表达,溴甲酚绿法检测上清液中白蛋白（ALB）的含量。结果培养过程中,D、E组出现多角形及双核细胞,A、B、C组细胞形态无明显变化。生长曲线显示细胞生长速度C组最快,D、E组均较B组快（P〈0．05）。D、E组于诱导第7,14天出现AFPmRNA阳性表达,第14,21天出现CK18mRNA阳性表达,D、E组上清波中白蛋白浓度随诱导时间延长逐渐升高,且E组高于D组（P〈0．05）。A、B、C组未见AFP、CK18表达及白蛋白浓度变化。结论正常大鼠血清能明显促进MSCs的增殖;瘀胆血清对MSCs有一定促增殖作用,且能有效诱导其向肝细胞分化,联合使用HGF能提高分化率。     

去舒地尔对人骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化的影响

目的 探讨HA-1077（fasuclil，法舒地尔）对人骨髓间充质干细胞（MSCs）分化为表皮细胞的影响。方法 采用直接贴壁法培养并扩增人胚胎股骨骨髓干细胞，免疫细胞化学及流式细胞仪进行表面标志的检测。设对照组、诱导组、HA-1077诱导组1、HA-1077诱导组2，采用免疫细胞化学及流式细胞仪对各组细胞角质蛋白表达变化进行检测，观察其对MSCs分化为表皮细胞的影响。结果 采用直接贴壁法可以获得大量高纯度的人骨髓MSCs，分组培养后第2天开始出现少量细胞角质蛋白阳性表达细胞，随着时间延长，阳性率逐渐提高。7天后流式细胞仪显示单纯诱导组及HA-1077诱导组CK5／8、CKl0／13、CK19阳性率均远高于诱导组（P〈0．01）。结论 HA-1077可能通过抑制Rho-ROCK途径的激活从而促进MSCs体外培养中角蛋白表达的显著提升，Rho-ROCK途径可能在促进MSCs分化为表皮细胞过程中起着重要调控作用。     

与人汗腺细胞共培养的人骨髓间充质干细胞表型转化及相关机制

目的 研究人骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)与经热休克处理的人汗腺细胞(sweat gland cells,SGCs)体外间接共培养状态下的细胞表型转化及相关机制.方法 体外分别分离扩增人MSCs及SGCs,原代SGCs生长融合后于47℃热休克,收集即刻和24 h后的上清加入第3代MSCs,7 d后分别以二步免疫细胞化学法和流式细胞术检测MSCs表达细胞角蛋白7(CK7)、CK18和癌胚抗原(CEA)的情况并与对照组比较.结果 加入SGCs上清后MSCs生长减慢,7 d内无明显形态改变;二步免疫细胞化学法显示部分细胞CK7和CEA染色刚性;流式细胞术显示,诱导组细胞CK7和CEA阳性率分别为5.76%和2.01%,对照组为1.12%和0.51%,两者差异有统计学意义(P＜0.01).结论 SGCs热损伤释放后某些信号物质,可诱导MSCs横向分化.     

5-氮胞苷不同时点对骨髓间质干细胞的诱导分化作用

 目的 对比研究5-氮胞苷(5-aza)在不同时点对大鼠骨髓间质干细胞(MSCs)的诱导分化作用.方法 体外分离培养雌性Wistar大鼠MSCs,分为6组,每组n=12,每次诱导均加入10μmol/L 5-aza作用24h.分组及各组诱导开始时间点为:A组,原代培养第72 h;B组,传5代后72 h;C组,传10代后72h;D组,传15代后72 h;E组,原代培养第72小时诱导1次,传5代后72h再重复诱导1次,共诱导2次;F组,空白对照组.诱导后,观察细胞形态学变化,免疫细胞化学鉴定心肌特异性结构蛋白,统计分析比较各组阳性表达率.结果 MSCs经诱导后,表达肌球蛋白重链和心肌特异性肌钙蛋白-T.A、B、E组间阳性表达率无明显差异(P＞0.05),与C、D组比较阳性率较高(P＜0.05),C、D组间无差异.结论 MSCs在体外诱导后可表达心肌特异性结构蛋白,随着传代次数增加,定向分化能力明显降低.作为移植种子细胞,以3～5代MSCs较好.     

地黄低聚糖诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究

目的 观察地黄低聚糖(RGOs)体外诱导骨髓间充质干细胞(MScs)定向分化为心肌样细胞的作用.方法 采用贴壁培养法分离大鼠MSCs,反复传代及纯化后,取第8代MSCs进行分组诱导:RGOs组(RGOs终浓度100μg/ml)、5-氮胞苷(5-Aza)组(5-Aza终浓度10μmol/L)、RGOs+5-Aza组和空白对照组.诱导后继续培养4周.采用Access化学发光法和干化学法分别检测诱导后MSCs内心肌特异性肌钙蛋白 I(cTnI)和心肌酶CK、CK-MB的表达,免疫荧光法和Western blotting法榆测诱导后MSCs内cTnl、缝隙连接蛋白43(Cx43)的表达.结果 诱导后各组MSCs均表达cTnI、CK和CK-MB,RGOs+5-Aza组中CK、CK-MB的表达水平较RGOs组、5-Aza组增高,差异有统计学意义(P<0.05).免疫荧光结果显示:在未诱导MSCs的空白对照组中未发现cTnI、Cx43阳性细胞,各诱导组MSCs均可见cTnI阳性细胞和Cx43阳性细胞,且RGOs+5-Aza组cTnI、Cx43荧光强度较RGOs组、5-Aza组增高.Western blotting结果显示空白对照组无阳性条带出现,各诱导组均出现cTnI和Cx43阳性条带,且RGOs+5-Aza组cTnI和Cx43表达量较RGOs组、5-Aza组增高.结论 RGOs可以在体外诱导大鼠MSCs分化为心肌样细胞,与5-Aza联合应用后其诱导MSCs内心肌特异性物质表达的作用较单药更强.     

烧伤血清诱导RAW264.7细胞分泌TNF-α的规律

目的：探讨烧伤血清诱导小鼠单核巨噬细胞系RAW264．7细胞分泌TNF-α的规律及其在脓毒症中的作用。方法：烧伤血清的剂量效应组分别用含有0．5,1．0,1．5,2．0,2．5ml烧伤血清的培养基与小鼠单核巨噬细胞系RAW264．7共培养6h,用双抗体夹心ELISA法测其上清中的TNF-α含量。采用流式细胞技术观察细胞的凋亡。烧伤血清的时间效应组以含有2．5ml烧伤血清的培养基,对照组以不含烧伤血清的培养基,另外以含有2．5ml烧伤血清和100mg／L LPS的混合组的培养基分别培养RAW264．7细胞0,2,4,6,8,10,12,24h,同上留取离心后的培养液上清,用双抗体夹心ELISA法测其上清中的TNF-α含量。结果：将烧伤血清加入到小鼠单核巨噬细胞RAW264．7培养液中能明显刺激TNF-α的分泌。在0．5ml～2．5ml范围内,烧伤血清诱导RAW264．7细胞的TNF-α分泌增加,呈显著的剂量依赖性关系,2．5ml烧伤血清能明显诱导RAW264．7细胞的凋亡;烧伤血清组和烧伤血清与LPS的混合组RAW264．7细胞的TNF-α分泌在0～24h间呈双相性规律。结论：烧伤血清能诱导小鼠单核巨噬细胞系RAW264．7的TNF-α分泌与凋亡,初步证实烧伤血清在脓毒症的发生、发展中发挥重要作用。     

骨髓间充质干细胞对大鼠肺泡巨噬细胞Toll样受体mRNA和蛋白表达的影响

目的 观察骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)对肺泡巨噬细胞Toll 样受体(toll-like receptor,TLR2/4)基因和蛋白的影响,为探讨骨髓MSCs移植对早期炎症介质的影响及炎症级联反应的调控机制做铺垫。 方法 巨噬细胞分为PBS对照组、骨髓MSCs对照组、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)对照组和LPS+骨髓MSCs处理组,各组均取1,3,6,12 h时相点。流式细胞仪检测骨髓MSCs表面标记阳性细胞率和巨噬细胞TLR2/4蛋白的表达;RT-PCR方法检测各组不同时相点巨噬细胞TLR2/4 mRNA表达变化;ELISA法检测各组不同时相点上清液中TNF-α浓度变化。 结果 与PBS对照组、骨髓MSCs对照组比较,LPS对照组巨噬细胞TLR2/4mRNA和蛋白表达明显升高(P＜0.01),1h时开始增高,12h时达到峰值;同时TNF-α浓度也明显增高(P＜0.01),6h时TNF-α浓度达到峰值。与LPS对照组比较,LPS+ MSCs组巨噬细胞TLR2/4 mRNA和蛋白表达降低(P＜0.01),TNF-α浓度也降低(P＜0.01)。 结论 LPS刺激后巨噬细胞TLR2/4 mRNA和蛋白表达升高,TNF-α浓度也升高,后者峰值时间出现略早,说明TLR2/4表达与TNF-α之间存在一个正反馈环;骨髓MSCs可以明显降低LPS刺激后巨噬细胞TLR2/4 mRNA和蛋白表达及TNF-α浓度,说明骨髓MSCs打破了上述正反馈环。     

骨髓间质干细胞移植对肝纤维化模型大鼠治疗效果

目的探讨骨髓间质干细胞(MSCs)对肝纤维化模型大鼠肝功能及肝纤维化的改善情况。方法将39只健康雌性SD大鼠分为对照组(n=14)和肝纤维化模型组(n=25)。对照组给予普通食水喂养;肝纤维化模型组给予四氯化碳液体橄榄油混合液皮下注射及乙醇喂养,建立大鼠肝纤维化模型。建模成功后将存活的大鼠随机分为对照组、模型组和移植组(每组各9只)。取健康SD大鼠骨髓,利用全骨髓贴壁的方法原代培养骨髓MSCs,然后将MSCs通过大鼠尾静脉对肝纤维化模型大鼠进行移植。移植后4周,检测血清白蛋白、转氨酶、胆红素、Ⅳ型胶原;HE和Masson染色观察肝纤维化程度。结果 MSCs移植后4周,移植组和模型组大鼠肝的纤维组织增生较对照组大鼠重,差异有统计学意义(P<0.01);但移植组大鼠肝的纤维组织增生较模型组大鼠显著减轻,差异有统计学意义(P<0.05)。模型组和移植组的肝功能较对照组差,差异有统计学意义(P<0.01);但与模型组比较,移植组大鼠血清白蛋白显著增高,胆红素、转氨酶、Ⅳ型胶原显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论肝纤维化模型大鼠骨髓MSCs移植4周后肝功能改善,肝纤维化程度显著减轻。     

血管内皮祖细胞对骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞脂肪化的影响

 目的 探讨血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cell,EPC)对骨质疏松(OP)大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)自主脂肪化的影响。方法 选6周龄雌性 SD 大鼠,建立OP模型。体外分离、培养大鼠EPC、BMSC。分别取第3、6代BMSC及原代EPC,建立EPC/BMSC 间接共培养体系。实验分组:假手术组BMSC(BMSC sham)、OP组BMSC(BMSC ovx)、OP BMSC /EPC共培养组(BMSC ovx/EPC);MTT法检测细胞增殖情况;油红 O染色检测成脂分化情况,real- time PCR检测成脂分化标志物PPARγ2的mRNA表达水平。结果 BMSC ovx/EPC 组BMSC的增殖能力显著高于BMSC ovx组;BMSC ovx/EPC组自主脂肪细胞分化水平明显低于BMSC ovx组。结论 EPC可通过间接接触提高骨质疏松大鼠BMSC的增殖能力,并能有效抑制OP大鼠BMSC的自主脂肪化。     

硒促进小鼠胚胎干细胞分化为胰岛细胞的实验研究

目的：探讨硒在体外诱导小鼠胚胎干细胞向胰岛细胞分化中的促进作用。方法：将ES-D3小鼠胚胎干细胞悬浮培养7d形成拟胚体，然后进行贴壁培养，加入分化培养液1诱导6d，然后用分化培养液2诱导6d。最后用含不同浓度的亚硒酸钠的培养基诱导20d。对诱导后获得的胰岛素产生细胞团(IPCC)细胞进行双硫腙染色，对染色结果进行体视学分析。进行胰岛素刺激释放试验，用ELISA法测定胰岛素释放量。RT-PCR法检测胰腺细胞相关基因的表达。结果：亚硒酸钠浓度在0．03～810μmol／L之间时，经过系列诱导后获得的IPCC其DTZ阳性率随着亚硒酸钠浓度的提高而显著升高。当亚硒酸钠浓度为270μmol/L时DTZ阳性率上升至最高点，随后开始缓慢下降；胰岛素分泌释放试验也证实270μmol/L亚硒酸钠诱导的细胞释放的胰岛素最多。RT-PCR结果进一步表明诱导获得的IPCC具有类胰岛组织的功能。结论：硒对胚胎干细胞向胰岛细胞分化具有促进作用。     

逼尿肌细胞的原代培养和鉴定

目的建立逼尿肌细胞的原代培养及鉴定方法。方法应用Ⅱ型胶原酶消化分离逼尿肌细胞,在含20%胎牛血清DMEM培养液中培养,观察细胞形态和扩增情况,用a-SM-Actin进行免疫组化鉴定细胞类型。结果 逼尿肌细胞在培养18 h后开始贴壁在瓶底,4~5 d后可见细胞融合,8~10 d后可见细胞覆盖瓶底80%以上。a-SM-Actin免疫组化染色鉴定,光镜下观察梭形细胞胞浆内见纵行排列的棕黄色丝状物。结论该方法简单、易于掌握,短期内可获得大量高纯度的逼尿肌细胞。     

人体胃癌细胞的分离

目的：探讨人体胃癌细胞的分离方法。方法：应用免疫磁珠分选法（MACS）分离人体胃癌细胞，并用免疫组化方法鉴定。结果：免疫磁珠分选的胃癌细胞活力达到90％，且经鉴定证实为上皮源性细胞胃癌细胞。结论：免疫磁珠分选法能分离出高活性的人体胃癌细胞。     

自体骨髓间充质干细胞联合自体外周血造血干细胞移植治疗恶性血液病

目的:观察自体骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)联合自体外周血造血干细胞(autologous peripheral blood stem cells,APBSCs)移植治疗恶性血液病的可行性、有效性和相关并发症发生情况。方法:采用无血清培养体系体外培养MSCs,将自体骨髓MSCs与APBSCs共移植治疗12例恶性血液病患者,并与同期进行的12例未联合MSCs的自体外周血造血干细胞移植(peripheral blood stem cells transplantation,APBSCT)的恶性血液病患者进行造血恢复及并发症比较。结果:MSCs输注无明显不良反应;联合移植的患者,造血恢复中性粒细胞(ANC)≥0.5×109/L平均9.52 d,血小板(PBC)≥20×109/L平均9.05 d,较对照组恢复快(P<0.05);血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)和血清天门冬氨酸氨基转移酶(AST)较对照组低(P<0.05);口腔溃疡和感染发生率与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:MSCs与APBSCs联合移植治疗恶性血液病安全可行,移植后造血重建快,并发症少。     

体外诱导培养人破骨细胞样细胞的研究

目的：通过多因子诱导人外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell，PBMC），培养人破骨细胞样细胞（Osteoclast-like cell，OLC）。方法：分离人PBMCs，加入不同浓度核因子-κB受体活化剂配体（Receptor activator of NF-κB ligand，RANKL）、巨噬细胞集落刺激因子（Macrophage colony stimulating factor，M-CSF）和1α，25（OH）2D3诱导培养。结果：诱导培养14d后，部分PBMCs分化为多核、抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP）染色阳性并具有骨吸收功能的破骨细胞样细胞。结论：多因子诱导人PBMCs是培养人OLC的好方法。     

增龄对成体肌肉干细胞生长能力的影响

目的:探讨不同年龄成体肌肉干细胞—卫星细胞体外培养增殖、分化规律,了解卫星细胞生长能力与年龄的关系。方法:用MTT法、免疫细胞化学技术及粘附细胞仪等手段,检测不同年龄段大鼠多代肌卫星细胞的增殖、分化能力和细胞数量。结果:(1)单位重量细胞数与动物年龄呈负相关;(2)不同年龄组间细胞增殖能力从7月龄始明显递减,分化能力从11月龄始减弱。结论:卫星细胞数量与年龄呈负相关,老年大鼠卫星细胞生长能力显著减弱。     

微重力对骨组织细胞功能的影响

目的 综述关于微重力引起航天员骨质疏松的研究进展. 资料来源与选择 国内外该领域相关文献. 资料引用 公开发表的相关文献48篇. 资料综合 详细介绍了微重力对骨髓间充质干细胞成骨向分化的影响和微重力对成骨细胞的影响;总结了微重力对骨细胞及破骨细胞影响的最新进展. 结论 微重力不但影响骨组织细胞的形态、增殖、凋亡,也影响其分化和功能等方面,导致骨形成减少,骨吸收增加,引起骨丢失.     

体外血管平滑肌细胞培养方法的应用及改进

动脉粥样硬化(AS)的发生发展与动脉中膜SMC的大量聚集和异常增生密切相关。参照传统的主动脉SMC培养方法并加以改进,采取从内剥离中膜法和组织块反复接种法,培养的细胞呈现典型的“峰与谷”结构,免疫组织化学染色显示细胞内SM-Actin表达阳性。此培养方法可作为研究血管SMC生物学行为和AS内在机制的有效模型。     

小鼠肝癌H22细胞中不同干性亚群的分选与鉴定

 目的 利用干细胞中乙醛脱氢酶（ALDH）高表达的特性分选并鉴定肿瘤细胞中存在的ALDH high 、ALDH low 及ALDH neg 细胞亚群。 方法 以流式细胞术检测小鼠肝癌H22、人胃癌BGC-823、结肠癌LS-174T、肝癌SMMC-7721细胞及胰腺癌SW-1990和Panc-1细胞系中ALDH+细胞的表达;在确定ALDH阳性表达的细胞中,以ALDH表达的高低差异,将细胞分选并定义为ALDH high 、ALDH low 、ALDH neg 细胞亚群;对分选出的3种细胞亚群进行CD133/CD44表型及细胞周期分析。 结果 （1）在小鼠肝癌H22细胞、人结肠癌LS-174T细胞、胰腺癌SW-1990细胞和Panc-1细胞中存在着ALDH阳性表达,而在人胃癌BGC-823细胞和肝癌SMMC-7721细胞中未见ALDH表达;（2）在小鼠肝癌H22细胞中能明确分选出存在荧光差异的3群细胞即ALDH high 、ALDH low 和ALDH neg 细胞亚群;（3）H22的ALDH high 、ALDH low 、ALDH neg  3个亚群中CD133/CD44表达存在差异,其表达比例依次减少;（4）H22细胞中ALDH high 亚群主要处于G 0/G 1期,ALDH low 亚群处于S期,而ALDH neg 亚群处于G 2/M期。 结论 在肿瘤细胞中存在着介乎于肿瘤干细胞与终末肿瘤细胞之间的特异性亚群,该亚群为肿瘤治疗提供了新的方向。