缺氧对肝癌细胞HepG2中HIF-1α和HK11表达的影响

目的探讨缺氧对肿瘤细胞周期调控的机制及乏氧诱导因子-1α（HIF-1α）、己糖激酶Ⅱ（HKⅡ）表达的影响。方法人肝癌细胞HepG2分成3组：缺氧12h组、缺氧24h组及对照组。缺氧组分别在缺氧条件下（37℃，5％CO2、2．0％O2饱和度）培养12h和24h，对照组置于正常氧浓度条件下（37℃。5％CO2、21．0％O2饱和度）培养24h。流式细胞仪检测细胞周期分布，免疫组织化学S2P法检测HIF-1α表达，荧光定量PCR法检测HKⅡ mRNA表达量。结果缺氧情况下细胞周期分析处于G0／G1期细胞百分比明显增多，处于G2／M期的细胞减少，并且可见到较明显的凋亡峰的形成，缺氧12h组、缺氧24h组的CO／G1期比例显著高于对照组（p〈0．05）；HIF-1α和HKⅡ在两组缺氧组与对照组比较，其表迭量明显增加（p〈0．05），缺氧24h组与缺氧12h组比较有显著性差异（p〈0．05）。结论HIF-1α可刺激人肝癌细胞HKⅡ表达的增加，细胞阻滞在Go／G1期，以HIF-1α为药物靶点可望成为治疗肝癌基因治疗的新途径。     

COX-2、HIF-1α在乳腺癌组织中的表达及其与微血管生成的关系

目的探讨环氧合酶-2（COX-2）和缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）蛋白在乳腺癌组织中的表达及其与微血管密度（MVD）的关系。方法应用免疫组织化学方法检测50例乳腺癌、20例癌旁组织中COX-2、HIF-1α蛋白的表达情况，用CD34抗体标记乳腺癌血管内皮细胞，计算MVD。结果乳腺癌组织中COX-2的阳性表达率为66％（33／50），HIF-1α的阳性表达率为60％（30／50），显著高于癌旁组织（P〈0．01），在乳腺癌组织中COX-2、HIF-1α蛋白表达之间存在显著正相关（r=0．630，P〈0．01）。COX-2、HIF-1α表达与淋巴结转移、临床分期显著相关（P〈0．05），与患者的年龄、肿瘤大小无明显相关性（P〉0．05），COX-2、HIF-1α阳性的乳腺癌组织MVD高于阴性者，差异有统计学意义（P〈0．01）。结论 乳腺癌组织中存在COX-2、HIF-1α的高表达。COX-2蛋白可通过诱导HIF-1α蛋白的表达上调，增强乳腺癌细胞的侵袭力，促进乳腺癌浸润、转移。     

缺氧诱导因子-1对缺氧诱导肺泡上皮细胞凋亡的调控作用

[目的]探讨细胞凋亡在缺氧肺损伤的作用及缺氧诱导因子-lα（hypoxia inducible factor-lα, HIF-lα）对细胞凋亡的调控作用。[方法]体外培养大鼠肺泡上皮细胞加入氯化钴（cobalt chloride, COC12 ）制作细胞缺氧模型，将小分子干扰缺氧诱导因子-l（ HIF-lαsmall interference RNA, HIF-lαsiRNA）有效的转染至细胞内，检测常氧、缺氧4、24h、小分子干扰后缺氧4、24h后HIF—lαmRNA的表达水平变化，同时应用荧光显微镜以及流式细胞术检测非转染以及转染组不同缺氧时间细胞凋亡率的变化。[结果]常氧下HIF-lαmRNA表达水平较低，随缺氧时间增加HIF-lαmRNA的表达水平明显升高（P〈0．05）；HIF-lαsiRNA可有效沉默HIF-lα，下调率为56％、57％（P〈0．01）。细胞凋亡率随着缺氧时间延长而增加（P〈0．05），48h细胞开始出现坏死现象；通过HIF—lα预处理细胞后，可降低缺氧诱导的细胞凋亡的发生率（P〈0．05）。[结论]缺氧引起肺泡上皮细胞的凋亡，随缺氧时间增加凋亡增加，HIF-lα在缺氧诱导细胞凋亡中起着重要的作用，HIF-lαsiRNA可以减少肺泡上皮细胞凋亡的发生。     

FOXP3 shRNA对肝癌细胞增殖、凋亡和侵袭功能的作用

目的研究FOXP3shRNA对肝癌细胞株SMMC-7721和MHCC-97H的增殖、凋亡和侵袭功能的影响。方法设计3种编码FOXP3shRNA的FOXP3干扰慢病毒:sh-FOXP3-1-pGreenPuro、sh-FOXP3-2-pGreenPuro和shFOXP3-3-pgreenpuro,并分别转染SMMC-7721和MHCC-97H2个肝癌细胞培养体系,检测转染后细胞培养体系中FOXP3的mRNA和蛋白质表达水平,以评估3个慢病毒的干扰效果。采用干扰效果最好的慢病毒转染上述细胞,以CCK8检测细胞增殖、TUNEL检测细胞凋亡、Transwell检测细胞侵袭功能,并比较转染前后上述指标差异。结果经菌落PCR和测序验证,3个FOXP3干扰慢病毒载体构建正确;其中sh-FOXP3-1干扰效果最明显,后期实验均使用sh-FOXP3-1转染。与对照组相比:2种肝癌细胞转染后OD值均明显下降,细胞增殖能力显著降低;凋亡显著升高;细胞侵袭功能显著下降,以上差异均有统计学意义(P值均0.05)。结论实验条件下,干扰FOXP3的表达可抑制肝癌细胞增殖、促进肝癌细胞凋亡并降低肝癌细胞侵袭能力。未来应进一步研究其作用机理,以优化肝癌的临床治疗与预防策略。     

妊娠高血压疾病患者 HIF在胎盘滋养细胞中的表达与临床价值评价

目的 分析缺氧诱导因子（ HIF）在妊娠高血压疾病患者胎盘滋养细胞中的表达差异,评价其临床价值。方法 选取重庆市沙坪坝区人民医院2013年1月至2013年12月分娩孕妇170例,分为正常对照组50例,妊娠高血压疾病组85例,轻度子痫前期组22例,重度子痫前期组13例。应用免疫组织化学方法及Western blot法,比较各组胎盘组织HIF-1α的表达和HIF-1α／β-actin的相对吸光度比值;免疫组织化学方法比较各组胎盘组织中HIF-2蛋白的表达,采用RT-PCR方法检测HIF-2αmRNA水平。结果 妊娠高血压疾病组、轻度子痫前期组和重度子痫前期组的HIF-1α和HIF-1α／β-actin的相对吸光度比值均显著高于正常组（ t值分别为11．776、17．216、21．168、9．979、13．171、21．406,均P＜0．01）。重度子痫前期组的HIF-1α和HIF-1α／β-actin的相对吸光度比值显著高于轻度子痫前期组和妊娠高血压疾病组（t值分别为7．372、7．449、11．623、23．338,均P＜0．01）。妊娠高血压疾病组、轻度子痫前期组和重度子痫前期组的HIF-2αmRNA及蛋白均显著高于正常组（ t值分别为17．344、29．253、34．833、39．388、41．850、38．567,均P＜0．01）;重度子痫组的HIF-2αmRNA及蛋白显著高于轻度子痫前期组和妊娠高血压疾病组（ t值分别为6．557、6．348、30．263、19．314,均P＜0．01）。 HIF-1α在妊娠高血压疾病组、轻度子痫前期组和重度子痫前期组中的表达率均显著高于正常组（χ^2分别为8．434、9．680、4．225,均P＜0．05）,HIF-1α在轻度子痫前期组的表达率显著高于妊娠高血压疾病组（χ^2=4．919,P＜0．05）,HIF-1α在轻度子痫前期组的表达率和重度子痫前期组无显著差异（χ^2=0．000,P＞0．05）。结论 缺氧诱导因子HIF-1α和HIF-2α在妊娠期高血压疾病中具有重要意义。     

蝎毒抗癌多肽对两种肝癌细胞抑制作用研究

本文主要观察蝎毒抗癌多肽（APBMV）对人和鼠的2种肝癌细胞株（SMMC-7721和H22）的抑制作用。采用噻唑蓝（MTT法）、集落形成抑制实验，用丝裂霉索C（MMC）为阳性对照药品。以蝎毒提取物APBMV各组分以不同浓度，分别处理小鼠肝癌细胞H。和人肝癌细胞株SMMC-7721生长情况。结果显示BMKⅢ对H22细胞的细胞毒性和集落形成的抑制作用略强于MMC组，与对照组差异显著。APBMV导致SMMC-7721细胞代谢MTT的能力显著低于对照组；APBMV能显著抑制该细胞的生长，剂量-效应关系明显；当APBMV的浓度〉8μg／ml时，SMMC-7721细胞的集落形成率显著低于对照组。APBMV和对H22细胞和SMMC-7721细胞具有明显的细胞毒性和生长抑制作用，是存在于蝎毒中的一种有效低毒的抗肿瘤成分。     

谷氨酰胺对肝癌细胞热休克蛋白70表达的影响

目的研究谷氨酰胺(Gln)对体外培养肝癌细胞株SMMC-7721内热休克蛋白70(HSP70)表达的影响,及其与细胞增殖的关系。方法SMMC-7721细胞株分别与0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0和16.0mmol/L的Gln培养24小时后,采用MTT法检测SMMC-7721细胞的增殖,RT-PCR和Western blot方法检测细胞内HSP70 mRNA和蛋白质的表达。结果Gln能显著促进SMMC-7721细胞增殖,当Gln浓度为2.0mmol/L时,SMMC-7721细胞的增殖达峰值。SMMC-7721细胞内有HSP70表达,Gln显著增加HSP70 mRNA和蛋白质的表达(P<0.05),当Gln浓度为2mmol/L时,HSP70表达量最高。结论诱导SMMC-7721细胞HSP70表达增高可能是Gln促肿瘤生长的作用机制之一。     

缺氧条件下电离辐射对鼻咽癌细胞HIF-1α及P53表达的影响

目的探讨缺氧条件下电离辐射对鼻咽癌细胞株CNE-1中缺氧诱导因子HIF—1α及P53表达的影响。方法将CNE-1鼻咽癌细胞分为空白对照组、单纯照射组和缺氧照射组。单纯照射组：按照照射率4Gy／min,共8Gy的剂量利用x射线照射细胞;缺氧照射组：氯化钴处理细胞模拟缺氧条件,缺氧一定时间后,按照与单纯照射组相同的剂量照射细胞。MTT法分析细胞存活分数,免疫荧光技术分析两组鼻咽癌细胞中的HIF-1α蛋白表达及分布情况,流式细胞仪定量检测HIF-1α和P53的蛋白表达。结果（1）MTT检测结果：细胞存活分数排列顺序为：对照组〉缺氧加照射组〉单纯照射组（P〈0．01）;（2）HIF-1α蛋白表达情况：免疫荧光显示鼻咽癌细胞HIF-1α蛋白的表达,在缺氧加照射组主要定位于细胞浆中,而另二组未见显示,流式细胞仪示缺氧加照射组HIF—1α明显高于单纯照射组（P〈0．01）,单纯照射组与对照组差异无统计学意义（P〉0．05）;（3）P53蛋白表达变化情况：缺氧加照射组〉单纯照射组〉对照组（P〈0．05）。结论鼻咽癌细胞缺氧条件下HIF-1α可能通过P53发挥重要的保护作用,从而降低实体瘤中内部癌细胞对辐射的敏感性。     

腺病毒介导PTEN基因抑制肝癌体外生长和侵袭力的研究

目的探讨腺病毒介导PTEN基因对肝癌细胞株H22体外生长和侵袭力的影响。方法以Ad-PTEN、Ad-PTEN^G-129R质粒及空载质粒分别转染体外培养肝癌细胞株H22，并以来转染组为对照，用RT-PCR检测目的基因，用四甲基偶氮唑蓝比色法（MTT）检测细胞活力，通过Boyden小室法检测肝癌细胞株H22体外侵袭力的变化。结果RT-PCR显示Ad-PTEN-H22组、Ad-PTEN^G-129R-H22组的H22细胞相应基因mRNA表达呈阳性条带，表明有PTEN和PTEN^G-129R的表达；在细胞活力检测上，Ad-PTEN-H22组550nm波长光吸收值为0.5627±0.0633，表明该组活细胞数明显低于其他各组（P〈0．05）；Ad-PTEN-H22组的侵袭细胞数为（15.64±3．27）％，低于其他组（P〈0.05）。结论重组腺病毒载体介导的PTEN基因转染可抑制肝癌细胞株H22体外生长并且其体外侵袭力受到明显抑制。     

TPT1真核表达载体的构建及在肝癌细胞系SMMC-7721中的表达

目的：构建TPT1真核表达载体，并转染肝癌细胞系SMMC-7721，为进一步研究奠定基础。方法：通过PCR的方法在TPT1 ORF（open reading frame，开放读码框）两侧添加EcoRI和BamHI的识别序列，将其定向插入真核报告表达载体pEGFP-N3中，构成pEGFP-N3TPT1重构体，卡那霉素筛选阳性克隆，碱裂解法抽提质粒，Sanger法测序，VeeScreen和BLAST分析测序结果，lipofeetAMINE转染肝癌细胞系SMMC-7721，荧光显微镜及RT-PCR方法检测表达效率。结果：成功扩增了带有特异性核酸内切酶识别位点的TPT1 ORF片段，双酶切后连入pEGFP-N3，测序结果证明，rPT1正确插入pEGFP-N3中，转导SMMC-7721后，在荧光显微镜下，可见细胞发出明亮的绿色荧光，转染效率在30％左右。RT-PCR分析显示，pEGFP-N3TPT1转导的细胞，TPT1 mRNA水平较对照高0．78倍（P〈0．05）。结论：成功构建了TPT1的真核报告表达载体pEGFP-N3TPT1，pEGFP-N3TPT1可在SMMC-7721细胞内高效表达。     

沙利度胺对人肝癌细胞株SMMC-7721体内外肿瘤血管的影响

目的观察沙利度胺对人肝癌细胞株SMMC-7721体内外肿瘤血管的影响。方法体外实验：将不同浓度的沙利度胺作用于人肝癌细胞株SMMC-7721,采用ELISA方法测定细胞株VEGF分泌量变化。体内实验：首先建立肝癌细胞株SMMC-7721的荷瘤小鼠模型,应用免疫组化测定瘤体组织中微血管密度,ELISA法测定小鼠外周血VEGF表达。结果体外实验中随着沙利度胺药物浓度增加,VEGF含量逐渐下降：沙利度胺浓度从0μg／ml升至400μg／ml,VEGF值由（83．21±8．32）pg／ml降至（33．59±10．98）pg／ml;体内实验：成功建立了肝癌细胞株SMMC-7721的荷瘤小鼠模型,沙利度胺组小鼠外周血VEGF含量为（32．17±12．11）pg／ml,对照组为（69．35±17．56）pg／ml,在沙利度胺瘤体中微血管密度值为13．17±3．15,对照组为18．34±2．25,均有显著性差异（P〈0．01）。结论沙利度胺能抑制SMMC-7721细胞株及荷瘤鼠肿瘤血管的形成。     

镉对人肝癌细胞增殖及凋亡影响

目的 研究镉对人肝癌细胞SMMC-7721增殖及凋亡的影响及其作用机制.方法 体外培养的人肝癌细胞SMMC-7721分别以0、40、80、160 μmol/L的CdCl2处理0～48 h,应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞相对存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡百分率,分光光度法检测半胱天冬酶Caspase-3酶活性的变化,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白印迹(western blot)法测Caspase-3 mRNA和蛋白表达的变化.结果 随着镉处理浓度的增加,氯化镉对细胞活力的抑制作用明显增强,40、80、160 μmol/L氯化镉处理SMMC-7721细胞,其抑制率分别为33.94％、48.04％和68.54％,均明显高于0 μmol/L氯化镉处理组,差异均有统计学意义(P＜0.01);40、80、160 μmol/L镉处理组细胞的凋亡百分率分别为(25.77±4.66)％、(34.97±9.25)％和(55.14±5.67)％,与0 μmol/L镉处理组比较明显升高,差异均有统计学意义(P＜0.01);镉处理SMMC-7721细胞24和48 h,Caspase-3相对酶活性均随着镉浓度的增加而明显增强;40 μmol/L镉处理SMMC-7721细胞,12、24和48 h可明显上调细胞中Caspase-3基因及蛋白的表达,Caspase-3基因mRNA表达水平分别为对照组的4.1、3.7和3.9倍,Caspase-3蛋白表达分别为对照组的5.8、6.0和7.2倍.结论 镉能明显抑制人肝癌细胞增殖,诱导细胞凋亡,Caspase-3基因在镉诱导SMMC-7721细胞凋亡过程中起着重要的作用.     

靶向抑制存活素表达对卵巢癌细胞株生物学行为的影响和意义

目的：通过存活素（ Survivin）反义寡核苷酸（ ASODN）转染人卵巢癌SKOV3细胞株抑制存活素Survivin蛋白表达,分析靶向抑制 Survivin 表达对卵巢癌细胞生长、细胞周期改变、凋亡、侵袭迁移能力的影响和意义。方法用脂质体（LipofectamineTM2000）介导Survivin ASODN转染人卵巢癌细胞株SKOV3,通过四唑盐比色法（MTT法）分析细胞生长活性改变,通过流式细胞仪检测Survivin蛋白表达改变、细胞周期分布和细胞凋亡率,通过Transwell小室检测细胞侵袭迁移能力的改变。结果转染Survivin ASODN后卵巢癌细胞株中Survivin蛋白表达明显下降（t＝7．82,P＜0．01）。细胞生长明显减慢（F＝3．75,P＜0．01）,600nm/L ASODN转染48小时细胞存活率为49．50±20．76％,接近IC50值。细胞凋亡明显增加（t＝6．37,P＜0．05）,细胞增殖明显下降（t＝-10．35,P＜0．01）,更多的细胞停留在G0/G1期（t＝10．38,P＜0．01）。细胞迁移和侵袭能力下降（t值分别为19．26、27．42,均P＜0．01）。结论 Survivin ASODN通过靶向抑制卵巢癌细胞存活素表达,可抑制细胞生长,促进细胞凋亡,减少进入有丝分裂的细胞数,降低细胞的侵袭迁移能力,从而达到治疗卵巢癌的作用。靶向抑制存活素的治疗将成为卵巢癌治疗的重要手段。     

缺氧诱导因子2α在宫颈鳞癌组织中的表达及其意义

目的：探讨缺氧诱导因子2α（HIF-2α）在宫颈鳞癌组织中的表达及其意义。方法：通过原位杂交（ISH）技术检测102例宫颈鳞癌组织、66例CIN组织和40例正常宫颈组织中HIF-2αmRNA的表达情况及其与宫颈鳞癌临床病理参数的关系。结果：HIF-2α mRNA在宫颈鳞癌组织中的阳性表达率均显著高于正常宫颈组织和CIN组织（P〈0．05）,并且HIF-2αmRNA在宫颈鳞癌组织中的阳性表达与淋巴结转移（x2=6．766,P=0．009）和临床分期（x2=11．639,P=0．001）相关,而与年龄、病理组织学分化程度、浸润深度无关（P〉0．05）。结论：HIF-2α mRNA在宫颈鳞癌组织中表达上调,可能与宫颈鳞癌的发生和演进有关。     

缺氧诱导因子HIF-1仅在妊娠高血压综合征中的作用

目的：探讨缺氧诱导因子HIF-1α在妊娠高血压综合征（PIH）中的作用。方法：采用免疫组化法检测40例PIH患者和40例正常妊娠孕妇胎盘组织中HIF-1α的表达。结果：PIH患者胎盘组织中HIF-1α高于正常妊娠对照组．中度、重度PIH组HIF-1α与正常对照组相比差异均有显著性（P〈0．01），中度组高于轻度组（P〈0．01），重度组高于中度组（P〈0．01）。结论：HIF-1α参与了PIH缺氧的病理生理改变，而且HIF-1α在PIH患者胎盘组织中的表达与PIH的严重程度有关。     

HIF-2α在肝癌组织中的表达及其临床意义

目的研究缺氧诱导因子-2d（HIF-2α）mRNA及蛋白在肝癌组织中的表达。方法免疫组织化学SP法和半定量RT—PCR法检测67例肝细胞肝癌标本及21例正常肝组织中HIF-2αmRNA和蛋白的表达。结果HIF-2αmRNA和蛋白在肝癌组织中的阳性表达率显著性高于癌旁组织和正常肝组织。肝癌组织中HIF-2αmRMA和HIF-2α蛋白表达在大小肝癌之间、是否伴有坏死之间和是否为浸润性生长之间差异有统计学意义;而在肝癌不同组织类型之间其表达差异无统计学意义。结论HIF-2α在肝癌组织中的表达较为普遍,其表达增高与肝癌的恶性生长有关。     

缺氧诱导因子-1α在大肠腺癌组织中的表达及与血管生成的关系

目的 探讨缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）的表达与大肠腺癌发生、发展的关系。方法用免疫组织化学方法检测61例大肠腺癌组织中HIF-1α的表达，并分析其与大肠腺癌生物学行为和微血管密度（MVD）的关系。结果HIF-1α在正常黏膜组织中无表达；腺瘤组织中阳性表达率为15．4％，且均为弱阳性表达，HIF—lq表达在正常黏膜与腺瘤组织中差异无统计学意义（P〉0．05）。癌组织中HIF-1α阳性表达率为65．6％，显著高于腺瘤组织（P〈0．01）。HIF-1α表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移和Dukes分期密切相关（P〈0．01），而与肿瘤大小无关（P〉0．05）；HIF-1α 阳性表达程度与MVD呈正相关。给论 HIF-1α过表达可能与大肠腺癌的浸润、转移及新生血管形成密切相关。     

缺氧诱导因子-1对缺氧诱导肺泡上皮细胞凋亡的调控作用

【目的】探讨细胞凋亡在缺氧肺损伤的作用及缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)对细胞凋亡的调控作用。【方法】体外培养大鼠肺泡上皮细胞加入氯化钴(cobalt chloride,COCl2)制作细胞缺氧模型,将小分子干扰缺氧诱导因子-1(HIF-1αsmall interference RNA,HIF-1αsi RNA)有效的转染至细胞内,检测常氧、缺氧4、24 h、小分子干扰后缺氧4、24 h后HIF-1αmRNA的表达水平变化,同时应用荧光显微镜以及流式细胞术检测非转染以及转染组不同缺氧时间细胞凋亡率的变化。【结果】常氧下HIF-1αmRNA表达水平较低,随缺氧时间增加HIF-1αmRNA的表达水平明显升高(P<0.05);HIF-1αsiRNA可有效沉默HIF-1α,下调率为56%、57%(P<0.01)。细胞凋亡率随着缺氧时间延长而增加(P<0.05),48 h细胞开始出现坏死现象;通过HIF-1αsi RNA预处理细胞后,可降低缺氧诱导的细胞凋亡的发生率(P<0.05)。【结论】缺氧引起肺泡上皮细胞的凋亡,随缺氧时间增加凋亡增加,HIF-1α在缺氧诱导细胞凋亡中起着重要的作用,HIF-1αsiRNA可以减少肺泡上皮细胞凋亡的发生。     

卵巢肿瘤组织中缺氧诱导因子1α与血管内皮生长因子C的相关性研究

目的探讨缺氧诱导因子1α（hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）和血管内皮生长因子C（VEGF—C）在卵巢癌组织中的表达及其相关性。方法2002年2月至2007年10月笔者所在医院312例卵巢上皮性肿瘤及正常卵巢的组织蜡块,应用免疫组化技术检测HIF-1α和VEGF—C的表达情况。结果卵巢癌、交界性卵巢肿瘤、良性卵巢肿瘤和正常卵巢组织中HIF-1α的阳性表达率分别为78．4％、44．1％、16．2％和0。交界性卵巢肿瘤和卵巢癌组织中HIF—1α的表达高于正常卵巢和良性卵巢肿瘤,卵巢癌高于交界性肿瘤,差异均有统计学意义（P〈0．01）。卵巢癌组织中HIF-1α的表达与手术病理分期和病理类型无关（P〉0．05）,而与病理分级呈正相关（r=0．356,P〈0．01）。卵巢癌组织中HIF-1α表达与YEGF—C表达呈显著正相关（r=0．140,P=0．055）。结论卵巢癌组织过度表达HIF-1α,并通过诱导VEGF—C促进肿瘤新生血管的形成。