DNA聚合酶β过表达对食管癌EC9706细胞的影响

目的:观察过表达的DNA聚合酶β对食管癌EC9706细胞系的影响.方法:运用PCR方法,从质粒pcDNA3.1-polβ中扩增出野生型和突变型的DNA聚合酶β基因,作为目的片段,定向克隆至pEGFP-C3真核绿色荧光蛋白表达载体,获得野生型和突变型的重组真核表达载体pEGFP-C3-polβ.分别将野生型和突变型的pEGFP-C3-polβ转染EC9706细胞,荧光显微镜观察其定位,绘制生长曲线,测定细胞周期.结果:DNA序列分析证实了重组载体中的DNA聚合酶β序列正确,荧光显微镜结果显示野生型的DNA聚合酶β表达以细胞核为主,突变型的DNA聚合酶β则表达在整个细胞中,明显与野生型的DNA聚合酶β的核定位不同.而且,野生型的细胞生长较对照组缓慢(P＜0.05),野生型的还能抑制EC9706细胞的生长和使S期细胞减少(22.11±0.12 vs 44.86±0.03,P＜0.05),而突变型的则不能促进EC9706细胞的生长,S期细胞增殖不明显(P＞0.05).结论:过表达的野生型食管癌DNA聚合酶β可以降低EC9706细胞的增殖.     

真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-MAGE-12的构建与表达

目的构建黑色素瘤抗原基因-12(MAGE-12)绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-MAGE-12,并在真核细胞中表达。方法于2005-10～2005-12对郑州大学第一附属医院应用RT-PCR方法,从人肺癌组织中扩增出MAGE-12cDNA基因片段,经过酶切鉴定后,克隆至质粒载体(pGEM-Teasy),测序证实碱基序列无误后,再克隆至真核绿色荧光蛋白表达载体(pEGFP-C3)上,并转染真核细胞,观察其在真核细胞中表达。结果经酶切及基因序列分析验证,PCR扩增出944bp的MAGE-12基因并成功构建了真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-MAGE-12,该重组载体能够在真核细胞中广泛表达。结论成功构建真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-MAGE-12,为建立肿瘤细胞疫苗打下基础。     

突变型人APP基因与增强型绿色荧光蛋白基因融合载体的构建

目的 构建携带突变型人淀粉样前体蛋白基因(APP695)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因融合载体.方法 在NCBI上查找APP695的序列,设计引物.以pCB6质粒携带的野生型APP695序列为模板,以突变体引物扩增突变型APP695. 将突变型APP695与pIRES2-EGFP连接并测序证实.结果 经过酶切鉴定、PCR和DNA测序等方法,证实构建的pIRES2-EGFP/APP695突变型质粒载体序列正确.结论 成功构建APP695-EGFP融合基因载体,为研究AD发病的分子机制和治疗时的药物筛选奠定基础.     

Tumstatin-EGFP真核表达载体构建及稳定转染CHO细胞系的建立

目的 构建重组tumstatin-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的分泌型真核表达载体质粒,建立稳定转染的中国仓鼠卵巢细胞系(CHO-K1).方法 利用重叠多聚酶链反应(PCR)技术从pGEM-T/STL质粒和pEGFP-C2质粒中扩增出STL-EGFP,用DNA重组技术将片段定向插入pIRESneo3质粒中,经酶切和序列验证正确后,用lipofectamine 2000转染CHO-K1细胞,通过G418筛选建立稳定转染的CHO细胞系,用逆转录-PCR、Western blot检测tumstatin-EGFP的表达,用倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达.结果 重组真核表达载体正确构建并在CHO细胞获得稳定表达,tumstatin-EGFP基因整合入细胞基因组DNA,培养液上清有融合蛋白tumstatin-EGFP的分泌,绿色荧光蛋白的表达高达95%以上.结论 成功构建了质粒PIRESneo3-STL-EGFP,获得稳定表达tumstatin-EGFP的细胞系.     

真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C1/PAK-1的构建及其在结直肠癌SW480细胞内的表达

目的:构建重组p21-activated kinase-1(PAK1)基因绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C1/PAK1,并转染入结直肠癌细胞SW480中表达.方法:在南方医科大学附属南方医院消化研究所实验室,从人类结直肠癌细胞株SW620细胞提取总RNA,经逆转录聚合酶链式反应获得人PAK1 cDNA片段,经过限制性内切酶进行酶切,T4连接酶进行连接,将目的基因克隆至真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C1上,然后转染结直肠癌细胞株SW480,观察其在细胞中表达.结果:重组载体经限制性内切酶酶切鉴定和DNA序列分析验证,显示插入载体的序列与目的基因一致,而且该重组载体能够在SW480细胞中表达.结论:成功构建了真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C1/PAK1,为研究PAK1在结直肠癌中的生物学功能奠定了基础.     

pEGFP-C3/SUMF2重组真核表达载体的构建及在人支气管上皮细胞中的表达

目的构建与增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）融合的人硫酸酯酶修饰因子2（SUMF2）真核表达载体。方法用RT-PCR技术从人支气管上皮细胞（human bronchial epithelial cells,HBEC）获得SUMF2的cDNA模板,PCR方法扩增人SUMF2基因。用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切扩增人SUMF2基因及质粒pEGFP-C3;将2种酶切产物按常规方法连接、转化大肠杆菌Top10;挑取菌落培养,提取质粒,酶切鉴定,测序;将测序正确的重组载体用脂质体法转染HBEC,荧光倒置显微镜观察。提取转染细胞的总蛋白进行Western blot检测。结果扩增出1条约857bp的片段,与预期的SUMF2大小相符。酶切结果显示重组质粒pEGFP-C3/SUMF2被切成2条片段,其中1条为pEGFP-C3载体,另1条为目的片段。经测序鉴定,序列与GenBank（NM₀15411.2）中的序列高度同源。荧光倒置显微镜观察显示,人SUMF2基因主要在内质网表达。Western blot结果显示在相对分子质量为37×103处有一蛋白条带,与预期大小相符。结论成功构建重组表达载体pEGFP-C3/SUMF2,为进一步研究SUMF2对IL-13的作用奠定了实验基础。     

前列腺癌特异突变DNA聚合酶β真核表达载体构建及鉴定

目的 构建前列腺癌(PCa)特异突变DNA聚合酶β(polβ)真核表达载体.方法 提取有特异DNA polβ突变的PCa组织的总RNA,通用引物逆转录成cDNA;用设计带有接头的DNA polβ全基因引物,PCR扩增PCa组织中呈现的突变型DNA polβ全基因;构建T-A克隆并进行重组体的筛选鉴定;亚克隆入表达载体pcDNA3.1并进行重组体的筛选和鉴定.结果 PCa特异突变DNA polβ基因扩增选择出P4(MI-polβ)和P5(M2-polβ)两个标本,构建重组有特定突变位点的polβ目的 基因的pcDNA3.1真核表达载体,经PCR扩增获得2个阳性集落.结论 经鉴定成功构建2例PCa特异突变DNA polβ真核表达载体(pcDNA3.1-M1 and peDNA3.1-M2).     

pEGFP-C1-HSP27真核表达载体的构建及其稳定转染人胰腺癌SW1990细胞株的筛选

目的 构建表达热休克蛋白27( HSP27)的携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的真核载体,建立稳定表达HSP72的人胰腺癌SW1990细胞株.方法 采用RT-PCR法从SW1990细胞中扩增出带有BamH Ⅰ、HindⅢ酶切位点的HSP27基因片段,插入真核表达载体pEGFP-C1,鉴定正确后用重组质粒转染SW1990细胞,并筛选稳转细胞株.荧光显微镜观察HSP72的定位,RT-PCR、蛋白质印迹法检测转染细胞HSP27的表达.结果 双酶切法鉴定和测序证实重组载体pEGFP-C1 -HSP27的DNA序列完全正确,并成功转染SW1990细胞,筛选获得稳转细胞株.荧光显微镜见EGFP主要分布在胞质中,转染细胞的HSP27mRNA表达明显增加(1.458±0.160比0.897 ±0.051,P＜0.05),且表达HSP27与EGFP的融合蛋白.结论 成功构建真核表达载体pEGFP-C1-HSP27,并筛选获得稳转的细胞株.     

LEN-5型β-内酰胺酶基因的克隆及原核表达

目的对来自肺炎克雷伯菌临床菌株的LEN-5型β-内酰胺酶进行基因克隆和重组表达。方法从相应临床菌株提取质粒DNA;以质粒为模板,PCR扩增LEN-5基因,扩增产物经NdeI、XhoI酶切后连接至pET-26b(+)表达载体,重组质粒经DNA测序确证后,转入大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达。超声破碎法提取蛋白表达产物,头孢硝噻吩检测其活性,并检测蛋白的等电点(pI)。结果PCR扩增获得879bp的产物,DNA序列显示该片断序列与目的序列完全一致。重组表达载体经NdeI、XhoI酶切及DNA测序后表明,目的基因已成功接入表达载体,表达产物经头孢硝噻吩检测显示具有β-内酰胺酶活性,显示载体〔pET-26b(+)/LEN-5〕构建成功。表达蛋白的等电点为7.6。结论β-内酰胺酶LEN-5基因在原核细胞中完成了重组和表达,为进一步做酶动力学及酶的其他分子生物学特性研究奠定基础。     

弓形虫ROP2基因的克隆与鉴定

目的 体外扩增弓形虫棒状体分泌抗原2（ROP2）靶基因，构建真核表达载体pc-DNA3-ROP2。 方法 收集、纯化RH株弓形虫速殖子，提取基因组DNA；根据基因库ROP2基因序列设计合成1对引物，应用PCR扩增ROP2基因片段，回收纯化后克隆入TA载体质粒pUCm-T；用限制性内切酶EcoRⅠ、HindⅢ双酶切该重组子，将切下的ROP2基因在T4DNA连接酶作用下插入真核细胞表达载体质粒pc-DNA3，并进一步作双酶切、PCR及测序鉴定。 结果 以弓形虫基因组DNA为模板，PCR扩增出1.7 kb ROP2基因片段，克隆于pUCm-T载体中，再将ROP2基因亚克隆于真核表达载体质粒pc-DNA3，经筛选鉴定，构建pc-DNA3-ROP2重组质粒；测序结果显示，重组质粒包含了ROP2蛋白基因读码框内的完整序列，能完整表达ROP2的抗原蛋白。 结论 弓形虫ROP2基因片段，经TA克隆及亚克隆，构建弓形虫pc-DNA3-ROP2重组质粒。     

ERβ重组质粒的构建及其在结肠癌细胞株Caco-2中的表达

目的:基因重组技术构建重组质粒pEGFP-C1ERβ并检测其在结肠癌细胞株Caco-2中的表达.方法:应用RT-PCR从人结肠癌手术患者正常切缘组织中分离、扩增目的基因片段,将所得cDNA定向克隆到真核表达载体pEGFP-C1中,采用双酶切和测序分析鉴定插入基因的序列;脂质体介导重组质粒pEGFP-C1-ERβ瞬时转染Caco-2并上流式细胞仪分选,获得比较单一的转染细胞:分别采用RT-PCR、Western blot检测转染前后ERβ基因不同分子水平表达.结果:酶切鉴定和测序分析表明重组表达质粒pEGFP-C1-ERβ构建无误:RT-PCR和Western blot分析均表明,与转染空质粒pEGFP-C1组和空白对照组细胞相比,转染重组表达质粒pEGFP-C1-ERβ组细胞ERβ基因表达水平明显提高.结论:成功构建重组质粒pEGFP-C1-ERβ并在Caco-2细胞株中表达,为进一步研究ERβ如何通过雌激素受体通路调控下游靶基因表达和参与结肠癌表遗传学发生机制奠定了基础.     

沙眼衣原体L2型MOMP基因真核表达载体的构建及序列分析

目的 构建携带沙眼衣原体L2型主要外膜蛋白（MOMP）基因的真核表达载体,为沙眼衣原体的DNA疫苗的研究提供材料。方法 用PCR技术扩增L2型沙眼衣原体MOMP基因片段,再将其定向插入到真核表达载体pcDNA3多克隆位点中,构建成重组表达质粒。并用酶切分析、PCR扩增及部分序列测定等方面对重组质粒进行了鉴定。结果 MOMP基因被正确地克隆到直核表达载体pcDNA3中。测序结果同文献报道的序列一致。结论 真核细胞表达载体pcDNA3－MOMP的成功构建,为进一步开展沙眼衣原体的DNA疫苗的研究奠定了基础。     

真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP—C3-MAGE-12的构建与表达

目的构建黑色素瘤抗原基因-12（MAGE-12）绿色荧光蛋白表达载体pEGFP—C3-MAGE—12，并在真核细胞中表达。方法于2005—10～2005—12对郑州大学第一附属医院应用RT—PCR方法．从人肺癌组织中扩增出MAGE-12cDNA基因片段，经过酶切鉴定后，克隆至质粒载体（pGEM—Teasy），测序证实碱基序列无误后，再克隆至真核绿色荧光蛋白表达载体（pEGFP—C3）上，并转染真核细胞，观察其在真核细胞中表达。结果经酶切及基因序列分析验证，PCR扩增出944bp的MAGE-12基因并成功构建了真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP—C3-MAGE-12，该重组载体能够在真核细胞中广泛表达。结论成功构建真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP—C3-MAGE-12，为建立肿瘤细胞疫苗打下基础。     

pEGFP-restin重组质粒的构建及其在BGC-803胃癌细胞中的表达

目的:构建一种含人肿瘤休眠蛋白基因(restin)的质粒,以绿色荧光蛋白作为报告基因,观察其在胃癌细胞中的表达,为探讨其抗肿瘤作用的分子机制打下基础.方法:从人胚肾组织中,以RT-PCR方法扩增restin基因片段,将restin片段和增强型绿色荧光表达质粒pEGFP-C1酶切、纯化、连接、转化、筛选,构建pEGFP-restin重组质粒,转染胃癌细胞,荧光显微镜下观测绿色荧光蛋白的表达,并对表达产物进行Western blot鉴定.结果:RT-PCR产物经琼脂糖电泳,在预期位置(600 bp)处阳性条带表达;重组载体经酶切分析,插入片段表达restin基因;pEGFP-restin重组质粒成功转染胃癌细胞,在荧光显微镜下强绿色荧光蛋白表达,Western blot鉴定结果显示pEGFP-restin上的restin基因在BGC-803细胞中正确表达.结论:成功构建了pEGFP-restin重组质粒,为进一步研究restin的功能提供了重要的实验材料.     

阴道毛滴虫铁氧还蛋白基因的克隆和序列分析

目的　构建阴道毛滴虫铁氧还蛋白 (ferredoxin ,Fd)基因重组质粒 ,并进行克隆及序列分析。　方法　根据Fd基因已知序列 ,设计合成 1对引物 ,应用螯合树脂 (Chelex-100 )提取基因组DNA ,用聚合酶链反应 (PCR)扩增出Fd基因 ,克隆入pMD-18T载体 ,转化大肠埃希菌JM109感受态细胞 ,经PCR及酶切鉴定、测序。　结果　Fd基因体外扩增产物长度为 306 bp ,重组质粒经PCR及酶切鉴定结果表明获得正确重组子 ,测序结果表明其片段与已知序列吻合。　结论　克隆出阴道毛滴虫Fd基因。     

重组人GDNF基因逆转录病毒真核表达载体的构建及表达

目的 构建含有胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)和加强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)的逆转录病毒载体,将其导入包装细胞PT67,检测基因在细胞中的表达.方法 PCR法扩增GDNF基因及IRES2-EGFP基因,测序验证正确后与逆转录病毒载体pLXSN连接,构建重组逆转录病毒质粒pLXSN-IRES2-EGFP-GDNF.EcoR I酶切鉴定重组质粒.脂质体Lipofectamine 2000介导下转染包装细胞PT67,G418筛选并检测病毒滴度.流式细胞仪和荧光显微镜分别检测转染效率和基因表达.结果 PCR扩增得到大小约558 bp和1 308 bp的特异性条带,测序证实,获得正确的人GDNF序列和EGFP序列.经EcoR I酶切鉴定,成功构建重组质粒pLXSN-IRES2-EGFP-GDNF.荧光显微镜检测显示GDNF基因获得良好表达,流式细胞仪检测转染效率为24.4%.结论 正确克隆了人GDNF基因全序列并构建重组逆转录病毒pLXSN-IRES2-EGFP-GDNF质粒.基因转染包装细胞PT67获良好表达.     

先天性长QT综合征HERG基因真核表达质粒的构建及体外表达

目的构建携带HERG目的基因的真核表达重组质粒pcDNA3-HERG,并观察HERG基因在心肌细胞中的表达情况。方法应用基因重组技术,将原核克隆载体pGEM-HERG中HERG基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3,以酶切和聚合酶链反应(PCR)方法鉴定重组质粒pcDNA3-HERG的正确性;以Lipofectamine为介导将重组质粒与荧光真核表达载体pRK5-GFP共转染培养的乳兔心肌细胞,转染48h后荧光显微镜下观察计算转染效率并采用Western Blot和全细胞膜片钳技术检测HERG基因的表达情况。结果酶切和PCR结果均证实pcDNA3-HERG的正确性,以脂质体为介导,其转染心肌细胞的效率为(15.2±2.6)%;Western Blot和膜片钳技术检测到HERG蛋白和HERG通道电流的表达。结论成功构建HERG基因真核表达重组质粒pcDNA3-HERG,转染心肌细胞后可表达有功能的离子通道,为今后研究突变型HERG的功能提供了可行的技术平台。     

溶藻弧菌热休克蛋白70基因真核表达载体的构建及鉴定

目的构建溶藻弧菌热休克蛋白70(HSP70)真核表达载体pcDNA3.1。方法提取溶藻弧菌基因组DNA,PCR扩增HSP70基因片段,克隆至TA载体,通过PCR、酶切及测序鉴定后,将HSP70基因片段用限制性内切酶切下,克隆至真核表达载体pcDNA3.1,构建pcDNA3.1重组质粒,通过PCR、酶切及序列分析对HSP70基因pcDNA3.1重组质粒进行鉴定。结果扩增出1 914bp的溶藻弧菌HSP70基因片段,并成功构建溶藻弧菌HSP70真核表达载体pcDNA3.1。结论成功构建了溶藻弧菌HSP70真核表达载体pcDNA3.1,为HSP70基因疫苗研制奠定了基础。     

弓形虫SAG1-MIC3融合基因真核表达载体的构建与鉴定

目的构建编码弓形虫RH株膜表面蛋白1（SAG1）和微线体蛋白3（MIC3）的重组真核表达载体pcDNA3．1-SAG1-MIC3并鉴定，为弓形虫疫苗研制作准备。方法采用PCR技术从弓形虫基因组DNA中分别扩增SAGl和MIC3基因片段。分别克隆人pMD18T载体，并对重组人外源基因的质粒通过PCR、酶切和测序鉴定；采用亚克隆技术将SAG1和MIC3基因克隆至真核表达载体pcDNA3．1（-），经含氨苄青霉素的LB平板筛选阳性重组质粒pcDNA3．1-SAG1-MIC3，PCR、酶切和测序鉴定；采用脂质体法将重组载体转染Hela细胞，经RT—PCR法检测转染细胞转录情况。结果MIC3和SAG1基因的TA-cloning经PCR和酶切鉴定，大小分别为933bp和789bp，与预期值一致；pcNDA3．1-SAG1-MIC3经酶切鉴定，目的片段约为1722bp．与SAG1MIC3长度相当；测定重组载体的核苷酸序列。与GenBank中的相应序列100％同源；PCR验证载体携带的SAG1-MIC3融合基因在Hela细胞中转录生成mRNA。结论成功构建重组真核表达载体pcDNA3．1SAG1-MIC3．为弓形虫核酸疫苗的研制奠定了基础。     

嗜肺军团菌主要外膜蛋白与鞭毛亚单位蛋白双基因融合表达载体的构建及其诱导表达

目的构建嗜肺军团菌主要外膜蛋白S基因(mompS)与鞭毛亚单位蛋白基因(flaA)的融合表达载体,并在原核系统表达。方法以嗜肺军团菌1型DNA为模板,PCR分别扩增获得嗜肺军团菌mompS基因和flaA基因,与带有硫氧还蛋白(Trx)基因的高效原核表达质粒pET32a(+)定向重组,构建mompS与flaA基因完全融合的重组质粒,经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,以IPTG诱导表达Trx-MOMPS-FlaA融合蛋白,用SDS-PAGE及Western blot进行鉴定。结果限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明,扩增出了嗜肺军团菌904bp的mompS及1432bp的flaA基因,成功构建了重组质粒pET-LpSF,SDS-PAGE及Western blot分析显示重组质粒pET-LpSF在原核系统中得到了表达。结论成功构建了嗜肺军团菌mompS-flaA双基因的原核融合表达载体,并在大肠杆菌中得到了表达,为进一步研究嗜肺军团菌核酸双价疫苗提供研究基础。