CCL18通过与Nir1结合促进胶质瘤细胞侵袭的研究

背景与目的：Nir1是CCL18的跨膜受体,CCL18能与之特异性结合而促进乳腺癌细胞的侵袭与转移,但其在胶质瘤细胞中的作用尚不清楚。该文旨探讨Nir1在胶质瘤侵袭中的作用及分子机制。方法：应用蛋白［质］印迹法(Western blot)检测Nir1在不同胶质瘤细胞系中的表达;利用siRNA技术抑制U251细胞中Nir1的表达;采用Western blot检测转染后Nir1蛋白的表达和转染前后U251细胞中Akt磷酸化的情况;使用体外侵袭实验检测转染后细胞的运动和侵袭能力;采用F-actin聚合实验检测F-actin的聚合能力。结果：Nir1在各胶质瘤细胞中均呈高表达;小RNA干扰技术沉默Nir1基因后,U251细胞中Nir1的蛋白表达量明显下降,侵袭并穿透Matrigel胶的细胞数目明显比对照组少(P=0.00);在CCL18刺激后细胞内的F-actin聚合量比对照组减少;Akt磷酸化试验结果显示,对照组细胞在CCL18的刺激下Akt更易发生磷酸化,实验组细胞无论是否存在CCL18,Akt磷酸化都受到抑制。结论：在胶质瘤细胞中存在Nir1蛋白高表达,通过与细胞膜上CCL18特异性结合来调节胶质瘤细胞的F-actin聚合和Akt的磷酸化进而调控胶质瘤细胞的运动和侵袭能力。     

Gab2-Akt-ARK5通路在胶质瘤侵袭中的研究

  目的  探讨Gab2-Akt-ARK5通路在胶质瘤侵袭中的意义。  方法  采用免疫组织化学SP法检测90例胶质瘤组织中ARK5及Gab2表达。采用小RNA干扰转染LN-229细胞株,Western Blot检测瞬时转染后ARK5及Gab2表达。体外侵袭实验检测转染后侵袭能力变化及Western Blot检测Gab2下降后Akt和ARK5的磷酸化。  结果  胶质瘤组织中ARK5和Gab2免疫组织化学阳性结果呈正相关且在高级别胶质瘤（WHO分级为Ⅲ、Ⅳ级）中表达明显高于低级别胶质瘤（WHO分级为Ⅰ、Ⅱ级）。转染ARK5、Gab2、ARK5-Gab2及SCR质粒的LN-229细胞分别称siARK5/LN-229、siGab2/LN-229、siARK5-siGab2/LN-229和SCR/LN-229。其中siARK5干扰效率为70%,siGab2的干扰效率为75%。转染后,与SCR/LN-229相比,siARK5/LN-229中ARK5表达降低,siGab2/LN-229中Gab2表达降低,siARK5-siGab2/LN-229中ARK5和Gab2表达均降低。siARK5/LN-229和siGab2/LN-229侵袭并穿透Matrigel膜基质的细胞数均比对照组少（P < 0.01）,且siARK5-siGab2/LN-229细胞数减少更显著（P < 0.01）。在IGF-1刺激下,siGab2/LN-229中Akt和ARK5的磷酸化减弱。  结论  应用小RNA干扰技术降低ARK5或Gab2表达使LN-229细胞侵袭转移能力降低,同时Gab2表达降低抑制ARK5和Akt磷酸化,提示Gab2-Akt-ARK5通路参与胶质瘤细胞的侵袭。      

miR-126下调MMP-2抑制人脑胶质瘤细胞侵袭

目的初步探讨miR-126抑制人胶质瘤细胞侵袭的可能机制。方法化学合成miR-126,脂质体转染人脑胶质瘤U87细胞,应用RT-PCR、Western blot检测MMP-2基因和蛋白的表达情况,并应用Transwell小室检测转染前后细胞侵袭力的变化。结果miR-126上调后U87细胞的MMP-2基因和蛋白表达降低,并且细胞侵袭力明显降低。结论化学合成的miR-126在抑制人胶质瘤细胞侵袭过程中发挥重要作用,可能成为胶质瘤基因治疗的新靶点。     

胃癌细胞中Caveolin-1 对表皮生长因子受体2 活化的影响

目的:检测Caveolin-1 蛋白（Cav-1）对胃癌（gastric cancer,GC）细胞株NCI-N87 恶性生物学行为的影响及其可能的作用机制。方法：构建Cav-1 过表达稳转染细胞系N87/Cav-1,应用MTT、克隆形成、划痕修复实验检测Cav-1 对胃癌细胞株NCIN87恶性生物学行为的影响,应用Western blotting 检测在EGF配体诱导下Cav-1 蛋白对Her-2 活化及ERK、Akt 信号通路的影响。结果：Cav-1 过表达可明显抑制胃癌细胞NCI-N87 的增殖及迁移能力;在配体EGF刺激下,Cav-1 过表达明显抑制了Her-2 酪氨酸磷酸化水平以及P-ERK/ERK、P-AKT/AKT的比率（P<0.01）。结论：Cav-1 过表达可明显抑制EGF诱导的Her-2 酪氨酸磷酸化水平,并可能通过下游MAPK及PI3K/Akt 信号通路的作用抑制了胃癌细胞株NCI-N87 的增殖及迁移能力。     

STIP1在脑胶质瘤组织中的表达及对胶质瘤细胞株增殖、凋亡、侵袭的影响

目的:检测磷酸化应激诱导蛋白1（stress-induced phosphoprotein 1,STIP1）在胶质瘤组织和正常脑组织中的表达差异,探讨STIP1对胶质瘤细胞株U87、U251细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响。方法:运用实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)、免疫组化及蛋白印迹检测胶质瘤组织和正常脑组织中STIP1的表达;小干扰RNA（STIP1-siRNA）转染U87、U251细胞株后,使用噻唑蓝(MTT)法、流式细胞仪和Transwell小室观察细胞的增殖、凋亡和侵袭能力。结果:STIP1在胶质瘤Ⅳ级组织中的表达明显高于正常脑组织,但在胶质瘤Ⅱ、Ⅲ级中的表达与正常脑组织无明显差异。U87、U251细胞株转染STIP1-siRNA后,细胞增殖和侵袭能力明显受到抑制,而细胞凋亡率明显上升。结论:STIP1在胶质母细胞瘤组织中高表达,下调STIP1可以抑制胶质瘤细胞株U87和U251的增殖,阻滞细胞周期,促进其细胞凋亡,并可抑制其侵袭力。     

Galectin-3调控Wnt信号通路对脑胶质瘤细胞凋亡的影响

目的:半乳糖凝集素-3（Galectin-3）调控Wnt信号通路对人脑胶质瘤细胞凋亡的影响。方法:RT-PCR及Western blot检测人脑胶质瘤组织中Galectin-3的mRNA和蛋白表达;Western blot检测人脑胶质瘤U251、U87、SHG-44细胞中Galectin-3的蛋白表达;将Galectin-3的特异性siRNA(Galectin-siRNA)转染人脑胶质瘤U87细胞,Western blot、流式细胞术分别检测转染48 h后Galectin-3、Wnt5a、β-catenin和Cleaved caspase3蛋白表达及细胞凋亡率。结果:Galectin-3在人脑胶质瘤组织mRNA和蛋白表达均显著高于瘤旁组织（P＜0.01）;U251、U87、SHG-44细胞中Galectin-3蛋白表达从高到低为U87>U251>SHG-44,选择U87细胞作为后续研究;Galectin-3-siRNA1的Galectin-3蛋白表达最低,选择作为后续研究;NC-siRNA组细胞凋亡率、Cleaved caspase3、Wnt5a、β-catenin蛋白表达与对照组差异不显著（P＞0.05）,与对照组比较,Galectin-3-siRNA组细胞凋亡率明显升高,Cleaved caspase3蛋白表达明显升高,Wnt5a和β-catenin蛋白表达明显降低（P＜0.01）。结论:沉默Galectin-3表达可诱导人脑胶质瘤细胞凋亡,机制可能与Wnt信号通路的下调有关。     

miR-200b通过靶向PROM1抑制胶质瘤细胞侵袭

目的 探讨miR-200b靶向调控PROM1的表达对胶质瘤细胞侵袭能力的影响以及miR-200b抑瘤的分子机制.方法 构建PROM1 3’端非翻译区(3'UTR)荧光素酶报告载体,荧光素酶报告检测miR-200b对PROM1 3'UTR-荧光素酶活性的影响.将miR-200b模拟物转染胶质瘤U87细胞,采用实时荧光定量PCR和Western blot检测PROM1 mRNA和蛋白的表达水平.将PROM1 siRNA转染U87细胞,Transwell侵袭实验检测PROM1下调对U87细胞侵袭能力的影响.结果 双荧光素酶报告检测显示,miR-200b能特异性地与PROM1 3'UTR结合,抑制其荧光素酶活性,其荧光素酶活性强度下降了57.0％,差异有统计学意义(P＜0.01).过表达miR-200b的U87细胞中PROM1蛋白和mRNA表达水平均降低,转染miR-200b组和对照组中PROM1 mRNA的表达水平分别为0.64 ±0.05和0.95 ±0.09,差异有统计学意义(P＜0.05).siRNA于扰PROM1表达能抑制U87细胞的生长和侵袭能力.转染PROM1siRNA组和对照组中穿膜细胞数分别为(85±9)个和(155±16)个,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 miR-200b可通过靶向调控PROM1的表达而抑制胶质瘤细胞的侵袭力.     

OPN基因RNAi对U87胶质瘤细胞生长和侵袭的抑制作用

目的:探讨靶向骨桥蛋白基因(osteopontin,OPN)的siRNA片段对U87胶质瘤细胞生长和侵袭力的影响及其可能的作用机制.方法:根据OPN基因序列设计并合成的siRNA片段(OPN-RNAi)转染U87细胞.MTT法检测U87细胞增殖;Western blotting检测OPN及基质金属蛋白酶(matrix metalloprotease,MMP)2、MMP9蛋白的表达;Transwell小室侵袭实验检测U87细胞的侵袭力;明胶酶谱法检测MMP2、MMP9的酶活性.结果:体外合成的OPN-RNAi能有效抑制U87细胞中OPN蛋白的表达(P＜0.05),OPN-RNAi同时还能下调MMP2、MMP9蛋白的表达(P＜0.05)及其酶活性(P＜0.01),并抑制U87细胞的增殖(P＜0.05)和侵袭力(P＜0.05).结论:OPN-RNAi能够有效抑制U87胶质瘤细胞的生长及其侵袭力,其机制与其抑制OPN下游基因MMP2、MMP9的表达和酶活性有关.     

长链非编码RNA Pvt1致癌基因在胶质瘤细胞增殖和上皮-间充质转化过程中的作用研究

目的 研究长链非编码RNA Pvt1致癌基因(PVT1)在胶质瘤细胞增殖和上皮-间充质转化(EMT)过程中的作用.方法 收集不同级别胶质瘤临床样本,定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测PVT1表达水平;U87MG和U251细胞系分别转染siRNA-PVT1及siNC后,CCK-8检测细胞增殖活性,Transwell法检测细胞侵袭能力,蛋白质印迹(Western blot)法检测EMT相关蛋白E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表达情况.结果 与正常脑组织相比,随着胶质瘤分级的增加,PVT1表达水平逐渐升高(P﹤0.05).胶质母细胞系U87MG和U251的PVT1表达水平均明显高于正常HEB细胞系(P﹤0.01).培养2、3天后,siRNA-PVT1组U87MG和U251细胞光密度值均低于siNC组.与siNC组相比,siRNA-PVT1组U87MG和U251细胞侵袭细胞数量均减少.siRNA-PVT1组U87MG和U251细胞系中E-cadherin蛋白相对表达量均高于siNC组,N-cadherin和Vimentin蛋白相对表达量均低于siNC组,差异均有统计学意义(P﹤0.05).结论 长链非编码RNA PVT1在胶质瘤中高表达,其表达水平与胶质瘤恶性程度有关;沉默PVT1可抑制胶质瘤细胞的增殖、侵袭和EMT过程,为胶质瘤的基因疗法提供了一个新的潜在靶点.     

全反式维甲酸抑制U87细胞血管生成拟态的机制研究北大核心CSCD

目的探讨全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)抑制U87胶质瘤细胞血管生成拟态(VM)的机制。方法通过在细胞培养液中加入不同浓度的ATRA作用于U87细胞,利用三维培养及管道计数实验、侵袭小室实验、Western blot、明胶酶谱等方法,比较组间U87细胞的VM形成能力、细胞侵袭能力、NF-κB蛋白磷酸化程度、MMP-2活性的差别。结果随着培养液中ATRA浓度逐渐增高,U87细胞形成VM的能力、细胞侵袭力、NF-κB蛋白磷酸化程度及MMP-2活性均逐渐减弱。结论ATRA的下游信号通路NF-κB受到抑制导致MMP-2活性下降,从而使细胞侵袭力下降,这可能是ATRA抑制U87细胞VM形成的内在机制之一。     

siRNA干扰ARK5蛋白表达对U251细胞侵袭潜能影响机制探讨

目的：探讨siRNA干扰降低腺苷酸活化蛋白激酶5（AMPK—related protein kinase5,ARK5）表达对U251细胞侵袭潜能的影响及其机制。方法：采用蛋白质印迹法检测U251细胞中ARK5表达。应用siRNA干扰技术转染U251细胞株,并采用蛋白质印迹法检测瞬时转染后ARK5蛋白表达情况。通过体外侵袭实验检测细胞转染后侵袭能力的变化。ARK5下降后,蛋白质印迹法检测间质细胞来源的YKL-40、N—cadherin、Vimentin蛋白和调节因子Snail、Slug、Twistl和Zebl的表达。结果：转染ARK5质粒的U251细胞ARK5表达下降。ARK5表达降低的U251细胞侵袭并穿透Matrigel膜基质的细胞数量为22,U251对照组为41,SCR／u251对照组为42,两两比较,ARK5表达降低的实验组透膜数比两对照组少（P〈O．001）,同时蛋白质印迹法结果显示,YKL-40、N-cadherin和Vimentin蛋白表达量降低,与间质转化相关的转录因子仅Snail的表达降低,而转录因子Slug、Twistl和Zebl表达无明显改变。结论：应用siRNA干扰技术降低ARK5蛋白的表达使u251细胞侵袭转移能力降低,同时YKL-40、N-cadherin和Vimentin蛋白和转录因子Snail的表达量降低,提示ARK5蛋白表达降低可通过调节间质转化影响u251细胞的侵袭。     

HMGB1在脑胶质瘤中的表达及其对胶质瘤细胞生物学功能的影响

目的:检测高迁移率族蛋白1(high mobility group box-1,HMGB1)在胶质瘤组织和细胞中的表达情况,了解HMGB1对胶质瘤细胞增殖、侵袭迁移以及细胞周期的影响。方法:将HMGB1 siRNA真核表达质粒在脂质体介导下转染胶质瘤细胞U373、U87（HMGB1 siRNA组）,以转染无关序列siRNA质粒的细胞（negative control,NC）和未转染的胶质瘤细胞（Control,Con）作为对照。采用RT-PCR和Western blot检测HMGB1 mRNA和蛋白表达,通过CCK-8实验、Transwell实验和细胞划痕实验分别检测胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移能力,用流式细胞仪检测胶质瘤细胞周期的变化。结果:HMGB1 mRNA在胶质瘤组织和细胞水平上都较非肿瘤性脑组织和正常胶质细胞明显高表达,差异有统计学意义（P＜0.05）,CCK-8和划痕实验提示HMGB1 siRNA组细胞增殖和迁移能力受到明显抑制（P＜0.05）,Transwell实验显示HMGB1 siRNA组穿膜侵袭到基质胶的细胞数明显低于Con组和NC组,细胞侵袭能力减弱（P＜0.05）,流式细胞分析提示HMGB1 siRNA组位于S期细胞比例较Con和NC组明显减少（P＜0.05）,提示细胞周期发生S期阻滞。结论:应用RNAi能有效抑制HMGB1基因表达,HMGB1低表达后能抑制胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移,并使得细胞周期中进入S期的细胞比例明显减少,细胞周期发生阻滞,这可能为胶质瘤的基因治疗提供了新思路。     

EGFRvⅢ的siRNA对胶质瘤细胞凋亡和增殖的影响

目的研究EGFRvⅢ的siRNA对U87-EGFRvⅢ胶质瘤细胞中EGFRvⅢ的表达及其对细胞增殖和凋亡的影响。 方法化学方法合成特异针对EGFRvⅢ的siRNA,转染U87-EGFRvⅢ细胞后,利用半定量RT-PCR法检测细胞中EGFRvⅢ的mRNA表达,采用蛋白印迹法和免疫荧光法检测细胞中EGFRvⅢ的蛋白表达水平,MTT法检测siRNA对胶质瘤细胞增殖的作用,Annexin V-FITC/PI法检测siRNA对细胞凋亡的作用。结果RT-PCR、蛋白印迹法和免疫荧光法均可显示EGFRvⅢ siRNA可使EGFRvⅢ的基因和蛋白表达显著下降,48 h内可使蛋白含量下降(757±31)%;MTT法和Annexin V-FITC/PI检测结果显示siRNA可抑制U87-EGFRvⅢ细胞的增殖并促进其凋亡。 结论EGFRvⅢ siRNA可特异地抑制EGFRvⅢ在胶质瘤细胞中的表达,抑制细胞增殖、促进细胞凋亡。     

靶向notch1的siRNA对U87-EGFRvⅢ胶质瘤细胞株凋亡和放射敏感度的影响

目的 探讨靶向notch1的siRNA对过表达EGFRvⅢ的U87胶质瘤细胞株U87-EGFRvⅢ凋亡和放射敏感度的影响。方法 利用脂质体转染合成的siRNA转染U87-EGFRvⅢ细胞。用RT-PCR和免疫印迹法来分别检测 notch1的蛋白和mRNA的表达水平;用AnnexinⅤ-FITC/PI流式细胞术检测细胞凋亡情况;用平板集落形成实验检测转染后细胞的放射敏感度。结果 合成的notch1 siRNA可有效抑制notch1在mRNA和蛋白水平的表达（P<0.05）。转染notch1 siRNA作用后细胞凋亡率比对照组明显增加（P<0.05）。平板集落形成实验初步证明notch1 siRNA可提高U87-EGFRvⅢ细胞的放射敏感度。结论 下调notch1基因可促进U87-EGFRvⅢ细胞的凋亡和提高其放射敏感度,为研究notch1基因在肿瘤放疗中的作用及其靶向联合治疗胶质瘤提供基础。     

沉默 c-maf 基因对多发性骨髓瘤细胞系 RPMI8226增殖和侵袭力的影响

  目的   探讨c-maf基因对多发性骨髓瘤细胞增殖、侵袭力的影响。   方法   脂质体法用c-maf siRNA转染多发性骨髓瘤 细胞系RPMI8226,RT-PCR技术检测c-maf基因的表达,MTT实验和Transwell小室分别检测多发性骨髓瘤细胞增殖活性和侵袭 力的改变,流式细胞术检测细胞周期,Western blots检测相关蛋白的表达情况,并检测Caspase的活性。   结果   c-maf siRNA有效地 转染入细胞并抑制了c-maf基因的表达。转染c-maf siRNA细胞的增殖活性及体外侵袭力均显著下降（P＜0.05）,细胞周期阻滞在 G₂/M 期,survivin、MMP-2、MMP-9、ARK5、cyclin B1 蛋白水平明显低于对照组（P＜0.05）,Caspase-3/7 蛋白活性高于对照组（P＜ 0.05）。   结论   c-maf siRNA可明显抑制多发性骨髓瘤RPMI8226细胞的增殖活性及侵袭力。c-maf基因可做为多发性骨髓瘤基因治疗的靶基因。       

下调基因PTTG1 对人胶质瘤细胞SHG44增殖、凋亡、迁移和侵袭能力的影响

背景与目的：研究表明垂体瘤转化基因1（pituitary tumor-transforming gene 1，PTTG1）在多种癌症中高表达。该研究旨在探讨其对胶质瘤细胞SHG44增殖、凋亡、迁移和侵袭能力的影响。方法：用PTTG1 siRNA干扰胶质瘤细胞SHG44的基因表达，通过实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）和蛋白质印迹法（Western blot）分别在mRNA和蛋白质水平上评估PTTG1沉默效率，进一步检测其对SHG44细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭能力的影响。结果：沉默PTTG1基因表达可以显著抑制SHG44细胞增殖（P<0.05）、迁移（P<0.01）和侵袭（P<0.001）能力，增加细胞凋亡（P<0.05）。结论：下调PTTG1的表达可以降低神经胶质瘤的恶化程度，有望成为临床胶质瘤治疗的新靶点。