巨噬细胞在小鼠氧诱导视网膜新生血管形成中的作用

目的　探讨巨噬细胞对小鼠氧诱导视网膜病变（ｏｘｙｇｅｎ-ｉｎｄｕｃｅｄｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ,ＯＩＲ）形成的影响。方法　将新生Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ小鼠随机分为３组,分别为常氧对照组、ＯＩＲ模型组以及清除巨噬细胞的ＯＩＲ组。将后两组小鼠于生后第７天（Ｐ７）至Ｐ１２置于体积分数（７５±２）％高氧氧箱中以诱导ＯＩＲ。清除巨噬细胞的ＯＩＲ组小鼠于Ｐ９、Ｐ１１、Ｐ１３和Ｐ１５接受腹腔注射氯膦酸二钠脂质体４次以清除全身单核-巨噬细胞,ＯＩＲ模型组小鼠则于上述４个时间点接受腹腔注射ＰＢＳ脂质体。三组小鼠均于Ｐ１７时取右眼行视网膜铺片和Ｌｅｃｔｉｎ染色,观察视网膜出血及血管生长情况;取左眼行视网膜切片和ＨＥ染色,观察视网膜组织病理学变化。结果　与常氧对照组相比,ＯＩＲ模型组小鼠视网膜存在出血现象,清除巨噬细胞的ＯＩＲ组出血有所减轻。ＯＩＲ模型组小鼠视网膜血管形态呈异常增殖的团簇状,走行迂曲,而清除巨噬细胞的ＯＩＲ组小鼠视网膜新生血管异常形态减轻。与ＯＩＲ模型组相比,清除巨噬细胞的ＯＩＲ小鼠视网膜无血管区及新生血管区面积均显著减小［（１７．１９±０．５８）％、（１０．３８±０．５３）％,ｔａ＝８．６８０,Ｐ＜０．０１;（４．６０±０．１５）％、（２．５１±０．１３）％,ｔｎ＝１０．８３,Ｐ＜０．０１］,突破内界膜新生血管内皮细胞核数目明显减少（１８．５０±０．８５、７．１７±０．４８;ｔ＝１１．６６,Ｐ＜０．０１）。结论　清除巨噬细胞可减轻小鼠ＯＩＲ严重程度,提示巨噬细胞对视网膜新生血管形成具有促进作用。     

脂多糖诱导炎症对大鼠氧诱导视网膜病变的影响

目的　观察不同剂量脂多糖（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ,ＬＰＳ）诱导炎症对大鼠氧诱导视网膜病变（ｏｘｙｇｅｎ-ｉｎｄｕｃｅｄｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ,ＯＩＲ）的影响,以探讨炎症在早产儿视网膜病变（ｒｅｔｉ-ｎｏｐａｔｈｙｏｆｐｒｅｍａｔｕｒｉｔｙ,ＲＯＰ）中的作用。方法　将新生ＳＤ大鼠随机分组,实验组依据ＬＰＳ注射剂量的不同分为ＬＰＳ-５０、ＬＰＳ-１００和ＬＰＳ-５００组,并分别设立正常对照组（Ｎ组）和氧诱导对照组（ＯＩＲ组）。Ｎ组幼鼠喂养于空气中,实验组和ＯＩＲ组幼鼠饲养于氧气体积分数为８０％／２１％（２４ｈ交替一次）的氧箱中至出生后１４ｄ（Ｐ１４）,随后移至空气中继续饲养。实验组幼鼠行ＯＩＲ处理过程中,于Ｐ７行ＬＰＳ腹腔注射,ＬＰＳ-５０、ＬＰＳ-１００和ＬＰＳ-５００组注射剂量分别为５０μｇ?ｋｇ－１、１００μｇ?ｋｇ－１和５００μｇ?ｋｇ－１。检测各组幼鼠在Ｐ７（注射前）、Ｐ８、Ｐ１１和Ｐ１４等不同时间点的体质量变化;并分别于Ｐ１４和Ｐ１８制作全视网膜铺片,通过ＧＳ-ｉｓｏｌｅｃｔｉｎＢ４染色观察各组视网膜血管化及病理性新生血管情况。结果　在各检测时间点,各实验组和ＯＩＲ组幼鼠的体质量均低于Ｎ组（Ｐ＜０．０５）。Ｐ７时,各实验组和ＯＩＲ组体质量无差别（Ｐ＞０．０５）;至Ｐ８、Ｐ１１和Ｐ１４时,ＬＰＳ-５００组幼鼠体质量明显低于ＯＩＲ组和其他实验组（Ｐ＜０．０５）。Ｐ１４时,Ｎ组幼鼠的浅层视网膜血管已覆盖整个视网膜;而ＯＩＲ组和实验组幼鼠的视网膜均存在无血管区,且ＬＰＳ-５００组无血管区面积最大（２７．３２％ ±３．５８％,Ｐ＜０．０１）。Ｐ１８时,Ｎ组视网膜血管网层次结构清晰;ＯＩＲ组和实验组幼鼠的视网膜均出现病理性新生血管,且ＬＰＳ-５００组新生血管累及视网膜的范围最广（累及钟点数为６．８３±１.７２,Ｐ＜０．０１）。结论　ＬＰＳ诱导炎症可加重大鼠ＯＩＲ,且在一定范围内呈剂量依赖性,提示炎症可能参与ＲＯＰ病理过程。     

非诺贝特治疗糖尿病视网膜病变合并肾病的临床研究

目的　观察非诺贝特治疗糖尿病视网膜病变合并肾病的临床疗效。方法　２８例（５６眼）２型糖尿病患者并发糖尿病视网膜病及肾病在控制血糖基础上随机分为Ａ、Ｂ两组。Ａ组（对照组,１４例２８眼）口服安慰剂ＶｉｔＣ片０．１ｇ;Ｂ组（试验组,１４例２８眼）口服非诺贝特片０．２ｇ;均为每天３次,饭前０．５ｈ口服,连续用４２ｄ,观察两组治疗前后视力、眼底的变化、血压、肾功能、２４ｈ尿蛋白、尿转铁蛋白、血浆基质金属蛋白酶２（ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ２,ＭＭＰ２）和组织型基质金属蛋白酶抑制剂１（ｔｉｓ-ｓｕｅｉｎｌａｉｂｉｔｏｒｏｆｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ１,ＴＩＭＰ-１）水平。结果　治疗前两组患者一般情况比较差异均无统计学意义（均为Ｐ＞０. ０５）。治疗４２ｄ后,视力提高３２眼,其中Ａ组６眼（占１８．７％）,Ｂ组２６眼（占８１．３％）,两组视力较治疗前改善的眼数比较差异有统计学意义（χ２＝１２．６１９,Ｐ＜０．０５）;Ａ组患者较治疗前各项指标差异均无统计学意义（ｔ２４ｈ尿蛋白＝１．２５４、ｔＣｒ＝１．３０２、ｔＢＵＮ ＝０．５３９、ｔ尿β２微球蛋白＝０．９２６、ｔＦＡ ＝１．０２６、ｔＦｉｂ＝０．９５４、ｔＥＴ-１＝１．１２４、ｔＭＭＰ２／ＴＩＭＰ１＝０．９８２,均为Ｐ＞０．０５）;Ｂ组２４ｈ尿蛋白、肾功能（Ｃｒ、ＢＵＮ、尿β２微球蛋白）、ＦＡ、Ｆｉｂ、ＥＴ-１和ＭＭＰ２／ＴＩＭＰ１水平均比治疗前明显降低（ｔ２４ｈ尿蛋白＝６．７３９、ｔＣｒ＝８．３７８、ｔＢＵＮ ＝６．２６４、ｔ尿β２ＭＧ ＝５. ５４２、ｔＦＡ ＝７．０９２、ｔＦｉｂ＝５．４２８、ｔＥＴ-１＝６．５５４、ｔＭＭＰ２／ＴＩＭＰ１＝８．９２２,均为Ｐ＜０．０５）。治疗后两组患者各项指标比较差异均有统计学意义水平（ｔ２４ｈ尿蛋白＝４．４３２、ｔ尿β２微球蛋白＝５．４２８、ｔＦＡ ＝５．６１６、ｔＣｒ＝８．８２１、ｔＢＵＮ ＝６．４８２、ｔＦｉｂ＝５．９０４、ｔＥＴ-１＝９．１６２、ｔＭＭＰ２／ＴＩＭＰ１＝５．３４２,均为Ｐ＜０．０５）。结论　非诺贝特治疗临床期糖尿病视网膜病变及肾病,可提高患者视力,能更有效改善视网膜微循环和肾血流动力学,保护眼底和肾功能。     

视网膜光损伤中TIMP-1、ERK-1的表达及促红细胞生成素对其影响

目的　研究实验性光损伤小鼠视网膜色素上皮细胞（ｒｅｔｉｎａｌｐｉｇｍｅｎｔｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ,ＲＰＥ）中金属蛋白酶组织抑制物-１（ｔｉｓ-ｓｕｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ-１,ＴＩＭＰ-１）及细胞外信号调节蛋白激酶１（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｒｅｇｕｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ-１,ＥＲＫ-１）表达的变化,以及促红细胞生成素（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ,ＥＰＯ）对其的影响,探讨ＥＰＯ对视网膜光损伤发挥保护作用的机制。方法　建立大鼠视网膜光损伤动物模型,于小鼠光照前腹腔注射重组人促红细胞生成素（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｈｕｍａｎｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ,ｒｈＥＰＯ）,采用ＨＥ染色观察ＲＰＥ细胞形态学变化,免疫组织化学法检测其ＴＩＭＰ-１、ＥＲＫ-１蛋白的表达。结果　光损伤可以造成小鼠视网膜ＲＰＥ细胞渐进性的破坏。外源性的ＥＰＯ可以促进光损伤后视网膜ＲＰＥ细胞ＴＩＭＰ-１及ＥＲＫ-１表达的增加。随光照时间延长,单纯光照组ＲＰＥ细胞密度逐渐减少,光照后７ｄＲＰＥ细胞密度与正常对照组比较差异有统计学意义（Ｐ＜０．０１）。光照后相同时间点,ＥＰＯ处理组的ＲＰＥ细胞密度较单纯光照组稍有增加,光照后７ｄ二者差异有统计学意义（Ｐ＜０．０１）。光照后各时间点,ＥＰＯ处理组均较单纯光照组中ＥＲＫ-１的表达明显增强（均为Ｐ＜０．０５）。光照后６ｈ、７ｄ,单纯光照组和ＥＰＯ处理组中ＴＩＭＰ-１的表达差异均无统计学意义（均为Ｐ＞０．０５）;自光照后１２ｈ起至光照后９６ｈ,各时间点ＥＰＯ处理组较单纯光照组中ＴＩＭＰ-１的表达增强（均为Ｐ＜０．０５）。ＥＰＯ处理组ＲＰＥ中ＴＩＭＰ-１的表达与ＥＲＫ-１的表达正相关（ｒ＝０．７９,Ｐ＝０．０３）。结论　外源性ＥＰＯ通过增加光损伤后视网膜ＲＰＥ细胞ＴＩＭＰ-１的表达,有利于ＭＭＰｓ／ＴＩＭＰ平衡的恢复,进一步证实ＥＰＯ对视网膜光损伤的保护作用。ＥＰＯ对ＲＰＥ细胞ＴＩＭＰ-１分泌和表达的调节可能经由ＭＡＰＫ途径。     

核转录因子-κB在氧诱导血管增殖性视网膜病变小鼠中的表达

目的　探讨氧诱导血管增殖性视网膜病变小鼠视网膜中核转录因子（ｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒ,ＮＦ）-κＢ蛋白的表达变化及意义。方法　７２只出生后７ｄ的Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ小鼠随机分为实验组（３６只）和对照组（３６只）,实验组与母鼠一起放入氧气含量为体积分数７５％的饲养箱中饲养,出生后１２ｄ回到正常大气环境中;对照组小鼠始终在正常大气环境中饲养。分别于出生后１２ｄ、１４ｄ、１７ｄ时处死小鼠,荧光素灌注后行视网膜铺片观察血管分布及形态,Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测视网膜中血管内皮生长因子（ｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ,ＶＥＧＦ）的蛋白表达变化,免疫组织化学染色检测眼球中ＮＦ-κＢ的表达变化。结果　视网膜铺片检查结果可见,实验组小鼠出生后１４ｄ开始出现视网膜新生血管,面积为每眼（０. ０６±０．１２）ｍｍ２;生后１７ｄ达到高峰,面积为每眼（１．７９±０．０２）ｍｍ２（χ２＝２０．１１２,Ｐ＜０．０１）。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测结果显示,实验组ＶＥＧＦ表达不断增强,在生后１７ｄ时表达达到高峰,为０．８３±０．０５。免疫组织化学染色结果显示,实验组生后１２ｄＮＦ-κＢ阳性细胞计数为（１２．３２±１. ０４）个?ｍｍ－２,１４ｄ时为（１９．１６±１．０２）个?ｍｍ－２,生后１７ｄ阳性表达较１２ｄ和１４ｄ时均高,为（２８. ６０±０．５２）个?ｍｍ－２（χ２ ＝１３. １０２,Ｐ＜０．０５;χ２＝２０．１３２,Ｐ＜０．０１）。结论　ＮＦ-κＢ在氧诱导血管增殖性视网膜病变小鼠视网膜中表达明显升高,其趋势与ＶＥＧＦ的变化相同,ＮＦ-κＢ参与了缺氧状态下视网膜新生血管形成的调控过程。     

视网膜静脉阻塞合并黄斑水肿患者黄斑区微结构改变与视力的相关性分析

目的　观察视网膜静脉阻塞合并黄斑水肿患者黄斑区微结构的光学相干断层扫描（ｏｐｔｉｃａｌｃｏｈｅｒｅｎｃｅｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ,ＯＣＴ）特征,探讨黄斑区微结构的改变与视力的关系。方法　采用ＯＣＴ对４６例（４６眼）视网膜静脉阻塞合并黄斑水肿患者进行黄斑区微结构检查,分析黄斑水肿形态,对不同形态黄斑水肿的患者进行比较,以患眼作为黄斑水肿组,对侧眼作为对照组,分析黄斑区微结构各参数与视力的相关性。结果　ＯＣＴ扫描结果显示４６眼视网膜静脉阻塞合并黄斑水肿的患者黄斑区微结构表现为３种形态,１２眼为黄斑囊样水肿,１０眼为浆液性神经上皮层脱离,２４眼为混合型水肿即黄斑囊样水肿伴浆液性神经上皮层脱离。对照组黄斑中心凹视网膜厚度、黄斑中心凹１ｍｍ环平均视网膜厚度及平均视网膜容积分别为（１８０．８１±１３．３５）μｍ、（２３８．７２±１６．７５）μｍ及（０．１７±０．０３）ｍｍ３,而黄斑水肿组分别为（５４１．２６±１２５．６８）μｍ、（４７３．６１±１３３．４２）μｍ及（０．３８±０．１４）ｍｍ３,两组比较差异均有统计学意义（均为Ｐ＝０．０００）。根据患者黄斑区微结构形态表现分组研究发现,浆液性神经上皮层脱离患者ＢＣＶＡ最好,为（０．５３±０．０９）ＬｏｇＭＡＲ,其次为黄斑囊样水肿患者（０．６４±０．１６）ＬｏｇＭＡＲ,而混合型患者最差（１．０２±０．２４）ＬｏｇＭＡＲ,３组之间差异有统计学意义（Ｐ＝０．００８）。浆液性神经上皮层脱离患者中心凹视网膜厚度、黄斑中心凹１ｍｍ环平均视网膜厚度及平均视网膜容积最小,其次为黄斑囊样水肿患者,而混合型患者３个指标均最大,３组之间差异均有统计学意义（均为Ｐ＝０．０００）。对黄斑部微结构的改变与ＢＣＶＡ进行相关性分析发现:黄斑中心凹视网膜厚度、黄斑中心凹１ｍｍ环平均视网膜厚度、黄斑中心凹１ｍｍ环平均视网膜容积、ＩＳ／ＯＳ断裂长度及外界膜断裂长度与ＢＣＶＡ（ＬｏｇＭＡＲ）均呈正相关（ｒ＝０．５４６,Ｐ＝０．０００;ｒ＝０．５８２,Ｐ＝０．０００;ｒ＝０．５２３,Ｐ＝０．０００;ｒ＝０．８３４,Ｐ＝０．０００;ｒ＝０．７５８,Ｐ＝０．０００）。黄斑水肿形态与ＢＣＶＡ呈正相关（ｒ＝０．６４１,Ｐ＝０．０００）,单纯的浆液性神经上皮层脱离患者ＢＣＶＡ最好,混合型的患者病变最重,ＢＣＶＡ也最差。结论　视网膜静脉阻塞所致的黄斑水肿表现形态不同,ＯＣＴ可以对黄斑部微结构改变进行定量分析,黄斑区形态改变与视力密切相关。     

HRD1在糖尿病小鼠视网膜的表达变化

目的　观察羟甲基戊二酰辅酶Ａ还原酶降解蛋白１（ＨｍｇＣｏＡｒｅｄｕｃｔａｓｅｄｅｇｒａｄａ-ｔｉｏｎ１,ＨＲＤ１）在糖尿病小鼠视网膜不同时期的表达变化。方法　ＳＴＺ诱导的糖尿病Ｃ５７ＢＬ／Ｊ小鼠,分别于糖尿病成功造模后１个月、３个月、６个月,选取糖尿病小鼠视网膜组织,利用免疫荧光、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ、ＲＴ-ＰＣＲ技术检测ＨＲＤ１在糖尿病不同时期的表达变化。结果　免疫荧光观察到ＨＲＤ１绿色荧光强度在１个月、３个月、６个月糖尿病小鼠视网膜随糖尿病进程逐渐减弱。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ、ＲＴ-ＰＣＲ检测可见在１个月、３个月、６个月糖尿病小鼠视网膜组织ＨＲＤ１基因水平和蛋白水平表达较对照组均明显减少（ｍＲＮＡ:Ｐ１ ＝０．０４０５;Ｐ２＝０．００６２;Ｐ３＝０．００４１;蛋白:Ｐ１＝０．０１０９;Ｐ２＝０．００１３;Ｐ３＝０．０００３）。结论ＨＲＤ１可能在糖尿病视网膜病变发生发展过程中起到一定作用。     

骨形态发生蛋白-6对氧化应激状态下的视网膜色素上皮细胞基质金属蛋白酶及其抑制剂的影响

目的　探讨骨形态发生蛋白-６（ｂｏｎｅｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎ-６,ＢＭＰ-６）保护视网膜色素上皮细胞免受氧化应激损伤的可能作用机制。方法　将ＡＲＰＥ-１９细胞分别置正常对照、７５μｍｏｌ·Ｌ－１ Ｈ２Ｏ２（Ｈ２Ｏ２ 组）、７５μｍｏｌ·Ｌ－１ Ｈ２Ｏ２ ＋１５０ｎｇ·ｍＬ－１ＢＭＰ-６（Ｈ２Ｏ２ ＋ＢＭＰ-６组）及１５０ｎｇ·ｍＬ－１ＢＭＰ-６（ＢＭＰ-６组）环境中培养０ｈ、３ｈ、６ｈ、９ｈ及１２ｈ后,用ＭＴＴ法观察细胞的活性,确定试剂的干预时间。选定作用时间后采用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ及ＲＴ-ｑＰＣＲ测定基质金属蛋白酶-２（ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ-２,ＭＭＰ-２）、基质金属蛋白酶-９（ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ-９,ＭＭＰ-９）以及基质金属蛋白酶抑制剂（ｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ-１,ＴＩＭＰ-１）蛋白及ｍＲＮＡ水平的变化。结果　作用３ｈ及６ｈ后,Ｈ２Ｏ２组、ＢＭＰ-６组及Ｈ２Ｏ２＋ＢＭＰ-６组细胞活性（３ｈ为０．５２４８±０．０２４０、１．０１２５±０．０１７７、０．５９１７±０．０９９８;６ｈ为０．４５９３±０．０３０９、１．０７７５±０．０２１４、０．５８２０±０．０１３９）差异均有统计学意义（均为Ｐ＜０．０５）。ＭＭＰ-２、ＭＭＰ-９、ＴＩＭＰ-１的ｍＲＮＡ及蛋白水平的检测结果是一致的,Ｈ２Ｏ２ 组、ＢＭＰ-６组及Ｈ２Ｏ２ ＋ＢＭＰ-６组两两比较差异均有统计学意义（均为Ｐ＜０．０５）,各组的不同时间差异也均有统计学意义（均为Ｐ＜０．０５）。Ｈ２Ｏ２组随着作用时间的延长,ＭＭＰ-２、ＭＭＰ-９在蛋白及ｍＲＮＡ水平的含量表达明显增加,而ＴＩＭＰ-１在蛋白及ｍＲＮＡ水平的表达均是降低的。ＢＭＰ-６组ＭＭＰ-２、ＭＭＰ-９在蛋白及ｍＲＮＡ水平的表达明显降低,而ＴＩＭＰ-１在蛋白及ｍＲＮＡ水平的表达均是升高的。ＢＭＰ-６＋Ｈ２Ｏ２ 组ＭＭＰ-２、ＭＭＰ-９的水平均较单纯Ｈ２Ｏ２组的水平低,而ＴＩＭＰ-１的水平是升高的。结论　Ｈ２Ｏ２是通过打破基质金属蛋白及其抑制剂的平衡起到氧化损伤作用。而ＢＭＰ-６可以保护视网膜色素上皮细胞免受氧化应激的损伤,其可能机制是通过基质金属蛋白酶系统起作用的。     

玻璃体内注射色素上皮源性因子对大鼠早期糖尿病视网膜病变的保护作用

目的　观察玻璃体内注射色素上皮源性因子（ｐｉｇｍｅｎｔｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ-ｄｅｒｉｖｅｄｆａｃｔｏｒ,ＰＥＤＦ）对ＳＤ糖尿病大鼠视网膜ＰＥＤＦ、血管内皮生长因子（ｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ,ＶＥＧＦ）、炎性相关因子细胞间黏附分子-１（ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒｃｅｌｌａｄｈｅｓｉｏｎｍｏｌｅ-ｃｕｌｅ-１,ＩＣＡＭ-１）和单核细胞趋化蛋白-１（ｍｏｎｏｃｙｔｅｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎ-１,ＭＣＰ-１）以及细胞通透性相关因子紧密连接蛋白-１（ｚｏｎｕ-ｌａｏｃｃｌｕｄｅｎｓ-１,ＺＯ-１）和蛋白激酶Ｂ（ｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＢ,ＰＫＢ,又称Ａｋｔ）表达的影响,探讨ＰＥＤＦ对早期糖尿病视网膜病变的保护作用。方法　选取６～８周龄ＳＤ大鼠６０只,随机分为４组:正常对照组（ＣＯＮ组）、糖尿病组（ＤＭ组）、糖尿病生理盐水注射组（ＤＭ＋ＮＳ组）和糖尿病ＰＥＤＦ注射组（ＤＭ＋ＰＥＤＦ组）。链脲佐菌素诱导建立糖尿病模型后第１周、２周、３周时,ＤＭ＋ＰＥＤＦ组大鼠玻璃体内注射ＰＥＤＦ,而ＤＭ＋ＮＳ组注射同样体积的生理盐水。第４周时处死大鼠,摘出眼球,进行视网膜组织病理学及电镜观察。并采用免疫组织化学方法检测视网膜ＰＥＤＦ、ＶＥＧＦ、ＩＣＡＭ-１、ＭＣＰ-１以及ＺＯ-１、Ａｋｔ的表达情况。结果　糖尿病大鼠均造模成功。４周糖尿病病程尚不能导致明显的视网膜新生血管形成。在透射电镜下,ＤＭ组大鼠视网膜可见神经节细胞水肿,线粒体肿胀变大,基质肿胀明显,可见大部分或全部的嵴消失,部分双侧膜融合,粗面内质网扩张,而玻璃体内ＰＥＤＦ注射可以明显地改善这一病理改变。ＤＭ组大鼠ＰＥＤＦ主要表达于视网膜神经纤维层、神经节细胞层以及内丛状层、光感受器基质以及色素上皮层、脉络膜等部位;ＶＥＧＦ主要表达于神经节细胞层,ＩＣＡＭ-１主要表达在光感受器层,ＭＣＰ-１主要表达在视网膜内层细胞,包括节细胞层和内核层,ＺＯ-１蛋白主要表达于内核层的细胞以及神经节细胞,Ａｋｔ主要表达于内丛状层以及脉络膜的细胞浆中。同ＣＯＮ组相比,ＤＭ组、ＤＭ＋ＮＳ组视网膜中ＰＥＤＦ、ＶＥＧＦ表达差异均无统计学意义（均为Ｐ＞０．０５）,而ＩＣＡＭ-１、ＭＣＰ-１表达增加,ＺＯ-１、Ａｋｔ表达减少,差异均有统计学意义（均为Ｐ＜０．０５）。ＤＭ＋ＰＥＤＦ组大鼠视网膜中ＰＥＤＦ、ＶＥＧＦ的表达较ＤＭ组和ＤＭ＋ＮＳ组差异均无统计学意义（均为Ｐ＞０．０５）,但ＩＣＡＭ-１、ＭＣＰ-１表达减少,ＺＯ-１、Ａｋｔ表达增多,差异均有统计学意义（均为Ｐ＜０．０５）。结论　ＰＥＤＦ可以明显地改善糖尿病视网膜病变早期视网膜神经节细胞的损害,通过减少炎性因子和增加细胞连接蛋白而减轻血-视网膜屏障的破坏,从而对早期糖尿病视网膜病变起一定的防治作用。     

一氧化氮在8-Br-cAMP对视网膜母细胞瘤细胞株影响中的作用

目的研究８－Ｂｒ－ｃＡＭＰ对人视网膜母细胞瘤ＨＸＯ－Ｒｂ４４细胞作用后产生一氧化氮（ＮＯ）的效应,以探讨ＨＸＯ－Ｒｂ４４细胞分化和凋亡的机制。方法应用原位杂交和 ＲＮＡ斑点印迹技术检测 ＮＯＳ ｍＲＮＡ及 Ｂｃｌ－２ ｍＲＮＡ;应用硝酸还原酶法检测ＮＯ的含量;应用蛋白斑点印迹技术检测一氧化氮合成酶（ＮＯＳ）的酶活性;应用免疫细胞化学及蛋白质斑点印迹技术检测 ＮＳＥ的免疫反应性（ＩＲ）。结果 ＮＯＳ ｍＲＮＡ,ＮＯＳ酶活性,ＮＯ含量和 ＮＳＥ－ＩＲ均为实验组（ＥＧ）强于对照组（ＣＧ）（Ｐ＜０．０１）,而Ｂｃｌ－２ ｍＲＮＡ为ＥＧ弱于ＣＧ（Ｐ＜０．０５）,并在ＥＧ标本上可见ＨＸＯ－Ｒｂ４４细胞呈现神经样的突起。结论 ８－Ｂｒ－ｃＡＭＰ可使 ＨＸＯ－Ｒｂ４４细胞生成 ＮＯ增加,促进 ＮＯＳ的酶活性和 ＮＯＳ ｍＲＮＡ的表达,提高ＮＳＥ－ＩＲ,并降低 Ｂｃｌ－２ ｍＲＮＡ的表达。结果表明,８－Ｂｒ－ｃＡＭＰ具有促使 ＨＸＯ－Ｒｂ４４细胞向神经细胞分化并诱导该细胞凋亡的效应,提示ＮＯ可能参与此效应。     

DNA损伤标志物γH2AX在氧诱导视网膜新生血管形成中的作用

背景 氧浓度变化诱导产生视网膜新生血管,并导致细胞DNA损伤反应.以往认为促血管生成因子过度表达是血管新生的原因,但DNA损伤是否与视网膜新生血管有关尚不清楚. 目的 探讨参与DNA损伤修复的磷酸化蛋白γH2AX与小鼠视网膜血管新生的关系. 方法 应用72只17日龄C57BL/6J小鼠按照随机数字表法随机分为正常对照组、氧诱导视网膜病变(OIR)模型组、OIR阳性对照组和OIR阴性对照组,每组18只.视网膜铺片免疫荧光法对比观察视网膜新生血管形态学变化及γH2AX表达情况.将人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)分为正常对照组、低氧模型对照组、阳性干扰组和阴性干扰组.细胞处理后12h,采用免疫荧光法比较并分析各组γH2AX的表达情况,采用Western blot法定量检测各组γH2AX的表达. 结果 正常对照组、OIR模型组、OIR阳性对照组和OIR阴性对照组17日龄小鼠视网膜新生血管面积和无灌注区面积比较,总体差异均有统计学意义(F=437.62、93.05,均P＜0.01),其中OIR模型组和OIR阴性对照组小鼠视网膜新生血管面积和无灌注区面积均较正常对照组明显增大;OIR阳性对照组小鼠视网膜新生血管面积和无灌注区面积均较OIR模型组和OIR阴性对照组明显减小,差异均有统计学意义(均P＜0.01).17日龄小鼠视网膜γH2AX焦点团聚集出现情况与新生血管和无灌注区面积大小变化趋势相一致.正常对照组、低氧模型对照组、阳性干扰组和阴性干扰组HUVECs中γH2AX焦点阳性细胞百分数比较,差异有统计学意义(F=64.97,P＜0.01),其中低氧模型对照组和阴性干扰组γH2AX焦点阳性细胞百分数均较正常对照组明显增大,差异均有统计学意义(均P＜0.01);阳性干扰组均较低氧模型对照组和阴性干扰组明显减小,差异均有统计学意义(均P＜0.01).各组HUVECs间γH2AX的表达量与免疫荧光趋势相一致.结论 缺氧环境下,γH2AX在小鼠视网膜血管和体外培养的HUVECs中均大量表达.γH2AX的表达与视网膜血管新生有关.低氧诱导的DNA损伤修复反应可能与视网膜血管新生有一定关系.     

Toll样受体4对氧诱导视网膜新生血管发生的促进作用及其机制

背景 研究发现,Toll样受体(TLRs)在视网膜新生血管的形成中发挥重要作用,但其作用机制尚不清楚. 目的 探讨TLR4对小鼠氧诱导视网膜病变(OIR)中新生血管生成的作用及其机制. 方法 将18只7日龄新生C57BL/6J小鼠以随机数字表法按小鼠窝别分为常氧组、OIR组及OIR+脂多糖(LPS)-EB组,常氧组小鼠在正常氧环境中饲养,OIR组及OIR+LPS-EB组小鼠于生后第7天(P7)与母鼠置于体积分数(75±2)％高氧氧箱中饲养5d以诱导OIR模型,于P12在正常氧环境中饲养,OIR+LPS-EB组P12小鼠腹腔内注射LPS-EB,剂量为1 mg/kg,OIR组同法注射PBS.各组摘取P17小鼠眼球于质量分数4％多聚甲醛中固定并行视网膜铺片和Lectin染色,计算视网膜无血管区和新生血管区面积占全视网膜的百分比.各组制备P17小鼠眼后节组织冰冻切片并行免疫荧光检测,计数小鼠5 mm视网膜全长活化小胶质细胞数目;采用CD11b和TLR4免疫荧光双标记法检测各组小鼠视网膜小胶质细胞中CD11b、TLR4的表达及其分泌血管内皮生长因子(VEGF)、白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平.结果 常氧组P17小鼠视网膜血管分布和形态正常,OIR组和OIR+LPS-EB组P17小鼠视网膜中央均出现无血管区和新生血管簇,OIR+LPS-EB组小鼠视网膜无血管区面积比为(18.47±1.32)％,新生血管面积比为(3.29±0.85)％,分别大于OIR组的(15.78±1.44)％和(1.77±0.19)％,差异均有统计学意义(t=3.36,P=0.01;t=4.22,P=0.00).免疫荧光结果显示,常氧组P17小鼠视网膜中活化小胶质细胞数量极少,OIR组和OIR+LPS-EB组P17小鼠视网膜中活化小胶质细胞荧光强度增强,活化小胶质细胞数量增加,其中OIR+LPS-EB组小鼠视网膜中小胶质细胞数明显多于OIR组,差异有统计学意义[(95.50士4.77)/5 mm与(74.83±4.17)/5 mm,t=8.00,P＜0.01].常氧组小鼠视网膜中TLR4阳性小胶质细胞数量极少,OIR组和OIR+LPS-EB组小鼠视网膜中TLR4荧光增强,TLR4阳性小胶质细胞数量明显增加,OIR+LPS-EB组小鼠视网膜中TLR4阳性小胶质细胞数目明显多于OIR组,差异有统计学意义[(49.50±6.38)/5 mm与(28.17±6.24)/5 mm,t=5.86,P＜0.01)].常氧组P17小鼠视网膜中CD11b和VEGF/IL-1β/TNF-α共表达的小胶质细胞数量分别为(1.17±0.75)/5 mm、0和0,而OIR+LPS-EB组小鼠视网膜中共表达CD11b和VEGF/IL-1β/TNF-α的小胶质细胞数量多于OIR组,差异有统计学意义[(44.50±8.78)/5mm与(28.50±5.61)/5 mm,F=44.07,P＜0.01;(24.10±6.49)/5 mm与(16.00±3.46)/5 mm,F=11.31,P＜0.01;(33.83±14.82)/5 mm与(23.00±2.83)/5 mm,t=19.92,P＜0.01]. 结论 TLR4可促进OIR小鼠视网膜新生血管的生成,其作用机制可能与TLR4激活视网膜小胶质细胞中相关的下游信号通路,促进血管生长因子及炎性因子的释放有关.     

Ras相关的C3肉毒毒素底物1的小发夹RNA干扰活性氧-核因子κB通路抑制小鼠视网膜新生血管生成

目的 观察Ras相关的C3肉毒毒素底物1的小发夹RNA(Racl-shRNA)在小鼠氧致视网膜病变中对视网膜新生血管(RNV)生成的抑制作用及对活性氧(ROS)-核因子κB(NF-κB)通路的影响.方法 将108只7日龄C57BL/6J小鼠随机平均分为3组.其中2组Smith法建立氧致视网膜病变模型;11日龄时玻璃体腔注射Racl-shRNA表达质粒或无意义质粒,分别作为基因干预组和空白对照组.第3组于正常氧环境中饲养,11日龄时玻璃体腔注射Racl-shRNA表达质粒作为空白干预组.15、17日龄时行荧光视网膜铺片,观察视网膜血管发育及新生血管情况.17日龄时计数眼球切片中突破内界膜的血管内皮细胞核数.17日龄时进行原位杂交法和荧光实时定量逆转录-聚合酶链反应法检测小鼠视网膜Racl和NF-κB p65亚单位的mRNA含量;免疫组织化学和蛋白质免疫印记检测Racl和NF-κB p65的蛋白表达.结果 基因干预组视网膜Racl的mRNA水平较空白对照组明显下调(t=4.500,P=0.001).与空白对照组比较,基因干预组视网膜铺片中无灌注区、荧光渗漏和新生血管丛明显减轻,突破内界膜的血管内皮细胞核显著减少(t=6.521,P<0.001);视网膜NF-κB p65的核易位水平明显下降(t=16.008,P<0.001),同时mRNA表达亦明显下调(t=3.354,P=0.006),与Racl mRNA表达呈正相关(r=0.580,P=0.012).结论 小鼠玻璃体腔注射脂质体包裹的Racl-shRNA表达质粒可有效沉默视网膜Racl基因表达,阻断ROSNF-κB通路而参与抑制相对缺氧状态下RNV生成.     

精氨酸-谷氨酰胺在幼鼠早产儿视网膜病变模型中的应用(英文)

目的:观察精氨酸-谷氨酰胺(Arg-Gln)对早产儿视网膜病变动物模型视网膜新生血管的抑制作用。方法:48只7日龄的C57BL/6J新生鼠暴露在750mL/L高氧环境中5d,然后回到正常空气中建立早产儿视网膜病变的动物模型。在鼠龄12d时实验组(36只)新生鼠每天两次腹腔注射Arg-Gln(剂量分别为1.0,3.0,5.0g/kg,每组12只),连续注射5d;对照组(12只)每天两次腹腔注射PBS,连续5d。所有小鼠均于17d处死,视网膜铺片,ADP酶染色观察视网膜血管情况。HE染色,在光学显微镜下观察并计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞细胞核数目。Real-time RT-PCR方法测量每组视网膜VEGF mRNA水平。结果:与对照组相比,实验组以剂量依赖方式无灌注区面积和新生血管团逐渐减少;实验组中最大剂量组[5.0g/(kg·d)]突破内界膜的内皮细胞细胞核数目比对照组大约减少75%(P<0.01);实验组视网膜VEGF mRNA水平与对照组相比明显下降。结论:Arg-Gln能够有效抑制早产儿视网膜病变动物模型视网膜新生血管的生成,可能为临床提供一种预防和治疗早产儿视网膜病变安全有效的新方法。     

PEDF抑制鼠视网膜新生血管的实验研究(英文)

目的:观察PEDF对氧诱导的血管增生性视网膜病变动物模型视网膜新生血管的抑制作用。方法:40只7日龄的C57BL/6J新生鼠暴露在750mL/L高氧环境中,然后回到正常空气中建立氧诱导的血管增生性视网膜病变的动物模型。随机取1眼为实验眼,在出氧箱时(12d)玻璃体腔注射PEDF,另1眼为对照组,玻璃体腔注射PBS。所有小鼠均于17d处死,视网膜铺片,ADP酶染色观察视网膜血管情况。HE染色,在光学显微镜下观察并计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞细胞核数目。结果:与对照组相比,实验组视网膜血管分布规则,未见明显的无灌注区形成;实验组突破内界膜的内皮细胞细胞核数目(10.18±1.74)比对照组(38.89±2.98)明显减少(P<0.01) ;组织切片未见视网膜毒性及炎症反应。结论:PEDF能够有效抑制视网膜新生血管的生成。     

Inhibition of retinal angiogenesis by PEDF

AIM: To investigate the effect of PEDF on retinal neovascularization in mice. METHODS: 40 7-day-old C57BL/6J mice was exposed to 750mL/L oxygen for 5 days and then to normal situation to produce the murine model of oxygen-induced retinopathy(OIR). One eye of the mouse was regarded as experimental one and the other served as control. Eyes in experimental group received intravitreal injection of PEDF and eyes in control group received intravitreal injection of PBS at postnatal day 12. All mice were executed at postnatal day 17. The changes of retinal vessels of mice were observed by ADPase histochemical technique. The inhibitory effect of PEDF on retinal neovascularization was evaluated by counting the endotheliocyte nuclei of new vessels which extended from retina to vitreous in the tissue slice of HE staining. RESULTS: Neovascularization was reduced, retinal blood vessels distributed regularly and non-perfusion areas were not found in eyes of experimental group compared with control group. The number of endotheliocyte nuclei of new vessels extending from retina to vitreous was significantly less in the eyes of experimental group (10.18±1.74) than that in control group (38.89±2.98) (P <0.01). Retinal toxicity and inflammatory reactions were not found in tissue slice. CONCLUSION: PEDF inhibits retinal angiogenesis in OIR and the feasibility should be determined for use of PEDF in ocular angiogenesis treatment.     

夜间光照对氧诱导的视网膜病变小鼠视网膜新生血管形成的影响

背景 氧诱导的视网膜新生血管形成是多种视网膜血管性疾病的病理学基础,预防视网膜新生血管的形成可缓解视网膜病变对视网膜的损害程度.研究表明夜间睡眠时给予光照可能对早期糖尿病视网膜病变(DR)患者有利,但其对早产儿视网膜病变(ROP)患者视网膜新生血管有无影响报道较少.目的 观察夜间光照对氧诱导视网膜病变(OIR)小鼠视网膜新生血管形成的影响.方法 将64只SPF级新生C57BL/6J小鼠按随机数字表法随机分为正常对照组、单纯夜间光照组、OIR模型组、OIR联合夜间光照组,每组16只小鼠.正常对照组和单纯夜间光照组小鼠生长于正常空气(氧体积分数21％);OIR模型组和OIR模型联合夜间光照组小鼠于出生后第7天置于高氧环境(75％±2％)生长,出生第12天调整氧体积分数为正常;OIR联合夜间光照组和单纯夜间光照组于出生后第12～17天给予夜间光照,光照度为100 Ix.各组小鼠均于出生后第17天摘除眼球,采用ADP酶法制备视网膜铺片,了解视网膜血管的改变情况;视网膜组织切片行苏木精-伊红染色并计数突破视网膜内界膜的新生血管内皮细胞核数;免疫组织化学法观察各组小鼠视网膜中血管内皮生长因子(VEGF)的表达,实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)法检测各组视网膜中VEGFmRNA的表达.实验动物的使用和喂养遵循ARVO声明.结果 正常对照组和单纯夜间光照组小鼠视网膜血管形态均无明显差异.OIR模型组视网膜铺片显示视网膜中央部大片无血管区,大量结构异常的新生血管形成.与OIR模型组相比,OIR模型联合夜间光照组视网膜中央无血管区面积以及新生血管分布密度减少.在实验后第17天时,正常对照组和单纯夜间光照组视网膜新生血管内皮细胞核数分别为(0.97±0.83)个和(1.00±0.72)个,OIR模型组为(38.57±5.01)个,而OIR联合夜间光照组小鼠视网膜新生血管内皮细胞核数为(16.92±3.39)个,总体差异有统计学意义(F=78.767,P=0.000),OIR联合夜间光照组视网膜新生血管内皮细胞核数明显少于OIR模型组,差异有统计学意义(t=20.446,P＜0.01).免疫组织化学法检测显示OIR模型联合夜间光照组中VEGF蛋白表达明显少于OIR模型组.正常对照组、单纯夜间光照组、OIR模型组和OIR联合夜间光照组小鼠视网膜VEGF mRNA相对表达量分别为1.00±0.00、0.94±0.07、2.08±0.50和1.43±0.21,各组间的总体差异有统计学意义(F=11.268,P=0.003),OIR模型联合夜间光照组表达较OIR模型组下调,差异有统计学意义(t=20.163,P＜0.05).结论 夜间光照可减少OIR小鼠视网膜新生血管的形成.     

基质细胞衍生因子-1在氧诱导视网膜病变小鼠视网膜中的表达

背景早产儿视网膜病变（ROP）的进展与多种新生血管调控因子有关,而基质细胞衍生因子·1（SDF．1）在氧诱导视网膜病变（OIR）动物模型视网膜中的表达及其作用机制尚不明确。目的对SDF-1在OIR小鼠模型视网膜中的表达进行定位和定量分析。方法应用随机数字表法将动物随机分组。将20只7日龄C57BL／6J幼鼠暴露在体积分数（75±2）％浓度的高氧状态下5d,随后在正常氧环境下5d,作为OIR组;另20只同日龄幼鼠作为正常对照组。通过免疫组织化学染色和实时荧光定量聚合酶链反应（real-timePCR）法观察视网膜的SDF-1的蛋白表达以及SDF-1mRNA的变化。结果OIR组12日龄小鼠的视网膜神经节细胞层可见SDF．1蛋白呈阳性表达;OIR组17习龄小鼠的神经节细胞层、内层视网膜的血管内皮细胞、新生血管内皮细胞可见SDF-1蛋白呈强阳性表达;正常对照组12日龄小鼠SDF-1蛋白和正常对照组17日龄小鼠SDF-1蛋白微弱表达于内层视网膜及视网膜血管附近。OIR组17日龄小鼠的SDF-1mRNA表达水平明显高于OIR组12日龄小鼠（P〈O．01）及正常对照组17日龄小鼠（P〈0．01）;OIR组12日龄小鼠SDF-1mRNA表达水平明显低于正常对照组12日龄小鼠（P〈0．05）。OIR组17日龄小鼠的SDF-1mRNA表达水平明显高于OIR组12日龄小鼠（t=8．072,P〈0．05）和正常对照组17日龄小鼠（t=10．026,P〈O．05）;OIR组12日龄小鼠SDF-1mRNA表达水平明显低于正常对照组12日龄小鼠（t=4．336,P〈0．05）。结论SDF-1在相对低氧状态下的视网膜中表达明显上调,因而可促进OIR的视网膜新生血管形成。     

玻璃体腔注射VAS2870对小鼠氧诱导视网膜病变的保护作用

目的：观察玻璃体腔注射VAS2870对C57小鼠氧诱导视网膜病变的影响。方法：将新生C57 BL/6 J小鼠随机分为3组,分别为正常对照组、VAS2870注射 OIR 组和无菌 PBS 缓冲液注射OIR组。将后两组小鼠在出生后第7 d ( P7)至P12置于体积分数为75%±2%的恒定高氧氧箱中以构建OIR模型,在 P12时给予幼鼠双眼玻璃体腔注射 VAS2870(0.5μL),另一组幼鼠双眼注射同等剂量的无菌PBS缓冲液。三组小鼠均在 P17时取右眼行视网膜铺片和Lectin染色,观察视网膜中央无血管区及病理性新生血管的情况;取右眼行视网膜组织定量检测 ROS/RNS 含量;取左眼应用RT-PCR检测Nox4 mRNA含量,并应用Western-blot测定视网膜组织中VEGF的表达。结果：VAS2870注射OIR组小鼠视网膜中央无血管区面积较无菌PBS缓冲液注射OIR组明显减少( P<0.05),病理性新生血管数目明显减少( P<0.05);VAS2870注射OIR组小鼠视网膜组织Nox4 mRNA的表达量明显低于无菌PBS缓冲液注射组;VAS2870注射OIR组小鼠视网膜组织ROS含量较无菌PBS缓冲液注射组明显降低( P<0.05);VAS2870注射OIR组小鼠视网膜组织VEGF的表达明显低于无菌PBS缓冲液注射组( P<0.05)。结论：在小鼠OIR模型中, VAS2870可抑制Nox4 mRNA的表达,减少ROS/RNS,下调VEGF的生成,在视网膜病变进程中具有保护作用。