Interpore 500R复合人骨髓基质干细胞构建组织工程骨

目的：研究可吸收性珊瑚羟基磷灰石（Interpore 500R）作为骨组织工程支架材料的特点。方法：取人骨髓基质干细胞于含100ml/L胎牛血清的DMEM培养液中培养，并向成骨细胞诱导。将细胞与可吸收性珊瑚羟基磷灰石复合，通过扫描电镜观察细胞附着情况，共聚焦显微镜观察I型胶原的分泌。同时将细胞/Interpore500R复合物植入裸鼠体内构建骨组织。40d后取裸鼠标本组织切片、HE染色观察成骨情况。结果：骨髓基质干细胞在可吸收性羟基磷灰石表面附着良好，可分泌I型胶原，在裸鼠体内形成组织工程骨。结论：可吸收性羟基磷灰石生物相容性好，细胞附着后仍继续保持成骨细胞特性，并可形成骨组织。作为骨组织工程的支架材料，应用前景良好。     

新型多孔磷酸钙复合骨髓基质干细胞组织工程实验研究

目的观察新型生物材料多孔磷酸钙的生物相容性及复合骨髓基质干细胞（BMSCs）异位成骨情况。方法体外培养第2代Beagle犬BMSCs,转染绿色荧光蛋白（GFP）后与多孔磷酸钙（CPC）复合培养,获得最佳复合浓度,倒置和荧光显微镜、扫描电镜下观察BMSCs黏附和生长情况,复合体植入裸鼠皮下8周观察异位成骨。结果BMSCs转染GFP与多孔CPC复合培养1 d,细胞从材料中爬出,形态正常,7 d可见细胞伸出伪足,分泌基质;复合体可异位成骨。结论多孔CPC生物相容性好,是一种较理想的骨组织工程支架材料。     

大鼠骨髓基质干细胞体外培养及成骨作用的实验研究

目的研究大鼠骨髓基质干细胞在体外条件培养下的成骨能力，为骨组织工程选择理想的种子细胞来源。方法取大鼠骨髓基质干细胞进行体外培养，用倒置相差显微镜、钙染色、扫描电镜和X线能谱等手段观察细胞的生长情况和矿化能力。结果细胞呈贴壁型生长，形态为梭形或多角形，在条件培养液中这些细胞间不发生接触抑制，而是相互重叠成多层，形成钙化结节，与成骨细胞的特点相符合。碱性磷酸酶染色呈强阳性，结节钙染色阳性，X线能谱分析显示结节的主要组成元素为钙和磷。结论体外培养的大鼠骨髓基质干细胞具有与成骨细胞相似的形态特征，并能在体外形成钙化的新骨结节。     

兔骨髓基质干细胞骨向诱导实验研究

目的:研究兔骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSC)的体外培养以及骨向诱导分化情况,进一步探讨其作为骨组织工程种子细胞的可行性。方法:无菌条件下抽取兔的股骨骨髓,然后进行骨髓基质干细胞的分离和体外培养,并向成骨细胞定向诱导分化。结果:体外分离的骨髓基质细胞呈贴壁生长,改良MTT法测定显示骨髓基质细胞于第7.8天左右可达到增殖高峰;诱导后BMSC可向成骨细胞分化,细胞呈成骨细胞形态为梭形和多角形并可形成钙化结节。改良钙钴染色法检测诱导细胞碱性磷酸活性呈强阳性。扫描电镜观察细胞呈较典型的成骨细胞状态,并可见钙盐沉积。结论:骨髓基质细胞具有来源充足,取材方便,创伤小无明显并发症。骨髓基质干细胞分化增殖能力较强,成骨能力确定。所以采用骨髓基质细胞作为种子细胞构建组织工程骨有比较可靠的依据。     

Bio-Oss胶原结合骨髓基质细胞构建组织工程骨的实验研究

目的:研究Bio-Oss胶原作为骨组织工程支架材料的可行性。方法:抽取成年小型猪骨髓,贴壁法获得骨髓基质细胞(BMSCs),经成骨诱导培养液体外培养、扩增、诱导后观察细胞增殖情况,并进行I型胶原、骨钙素的免疫细胞化学检测。将培养的第3代细胞接种于Bio-Oss胶原,进行超微结构观察,并将Bio-Oss胶原/BMSCs复合物植入裸鼠背部皮下,4、8周后进行组织学检测。结果:当接种密度为0.8×106/ml时,细胞与支架材料之间有最大附着量;VonKossa染色可见钙结节形成;I型胶原、骨钙素免疫细胞化学染色呈阳性;超微结构观察可见细胞生长附着于材料网孔内表面;组织学检测提示,8周时复合物内有新骨形成。结论:Bio-Oss胶原/BMSCs复合物显示成骨活性,Bio-Oss胶原可用作骨组织工程支架材料。     

珊瑚复合人骨髓基质细胞构建组织工程骨

目的：观察人骨髓基质细胞在角孔珊瑚上立体培养后的生长情况及其在体内的成骨能力。方法：穿刺抽吸人髂骨区骨髓基质细胞，体外培养扩增、诱导后，接种于角孔珊瑚中立体培养5d，观察细胞在角孔珊瑚表面的贴附及伸展情况；将上述细胞/角孔珊瑚复合物植入体内，观察植入物在体内的成骨情况。结果：细胞可在角孔珊瑚中立体培养成活。体内植入后4周，复合物中有少量新骨形成；体内植入后8周，复合物中出现大量较成熟骨组织；而对照组4、8周均无骨组织形成。结论：穿刺抽吸的人骨髓基质细胞可作为骨组织工程的种子细胞，角孔珊瑚可作为骨组织工程的支架材料。     

骨髓基质干细胞片层的制备及其在组织工程骨中应用的初步研究

目的：探讨骨髓基质干细胞（bone marrow stromal cells,BMSCs）片层（cell sheet）的制备方法,并观察其在实验犬体内构建组织工程骨时的成骨作用。方法：密度梯度离心法获取实验犬骨髓基质干细胞,经成骨诱导培养后,利用温度感应性培养皿（temperature-responsive culture dish）制备细胞片层后在体外包裹犬同种异体脱钙骨基质（demineralized bone matrix,DBM）,相差显微镜和扫描电镜观察细胞及片层形态;将复合体植入实验犬背阔肌筋膜下,组织学方法观察术后组织工程骨的骨形成情况。结果：细胞片层成功制备,并与支架材料复合良好,术后16周组织学显示形成类似板层骨的致密骨组织。结论：利用温度反应性培养皿可成功制备BMSC细胞片层,细胞片层包裹支架材料后在实验动物体内可形成具有类似板层骨结构的组织工程骨。     

β-磷酸三钙复合骨髓基质细胞构建组织工程骨的实验研究

目的：验证β-磷酸三钙与骨髓基质细胞复合形成组织工程骨的可行性。方法：取犬骨髓,贴壁法获得骨髓基质细胞,经成骨诱导培养液体外培养,倒置相差显微镜观察其形态、增殖情况,选择CD29,CD90,hamIgG应用流式细胞术检测细胞表面抗原,VonKossa染色,将培养的第3代细胞接种于多孔支架材料β-磷酸三钙（β-TCP）,进行细胞增殖率检测,并于1、3、7d扫描电镜观察细胞材料的复合情况。结果：原代培养20d后分离获得骨髓基质细胞,VonKossa染色鉴定其成骨能力;细胞表面抗原检测显示CD29＋,CD90＋,hamIgG-,与文献报道一致;细胞增殖率曲线结果显示,细胞粘附多孔β-TCP后增殖率没有明显差异;扫描电镜观察可见细胞生长附着于材料网孔内表面。结论：β-磷酸三钙/骨髓基质细胞复合物显示良好的成骨活性,β-TCP可以用于骨组织工程支架材料。     

载辛伐他汀PLGA/CPC支架材料复合BMSCs修复大鼠颅骨缺损的实验研究

目的:探讨载辛伐他汀PLGA/CPC支架材料复合骨髓间充质干细胞(BMSCs)构建组织工程骨,修复大鼠颅骨临界尺寸骨缺损的可行性以及效果。方法:24只雄性大鼠随机均分为3组;在大鼠颅骨人字缝两侧各做一直径5 mm的骨缺损。每组16个骨缺损再随机分为:载辛伐他汀PLGA/CPC/BMSCs(Brdu标记的BMSCs)组(n=4);载辛伐他汀PLGA/CPC组(n=4);单纯PLGA/CPC组(n=4)以及空白对照组(n=4)。术后4、8、12周取标本分别进行大体观察,HE染色及免疫组织化学染色来评价骨再生情况。结果:术后4、8、12周组织学观察表明载辛伐他汀PLGA/CPC/BMSCs组的成骨质量和速度明显优于其他3组,免疫组化结果显示载辛伐他汀PLGA/CPC/BMSCs组骨钙素(OC)阳性表达IOD值明显高于其他3组。结论:载辛伐他汀PLGA/CPC支架材料复合BMSCs可以诱导大鼠颅骨临界尺寸骨缺损内的新骨形成,成骨质量优于其他3组,而且可以明显缩短骨愈合时间。     

骨髓基质干细胞与不同支架材料复合异位成骨能力的实验研究

目的:研究骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)与不同支架材料复合后的异位成骨能力。方法:将体外诱导培养的成年犬骨髓基质干细胞,以1×106/cm2的密度接种到冻干骨基质(fdDBM)、磷酸三钙(TCP)、孔径分别为200μm及500μm的珊瑚羟磷灰石(CH200、CH500)等支架材料上,分别于体外培养的第4￣7天进行扫描电镜及石蜡切片HE染色,了解细胞在不同支架上的黏附及生长情况,并于1周后将大小为10mm×5mm×2mm的上述细胞支架复合物(fdDBM、TCP、CH200、CH500)分别植入裸鼠(n=8)背部皮下,每只裸鼠均植入4个实验组及1组无细胞的fdDBM空白支架对照组。9周后,取材行石蜡切片及HE染色,以IMAGER-PROPLUS软件测量每组的新生骨小梁量,并采用SAS软件包行单因素方差分析。结果:犬BMSCs与4种支架材料均黏附良好,TCP、CH200及CH5003组各样本均能观察到新骨形成,fdDBM及fdDBM空白对照组分别有75%、25%的样本有新骨形成;其中,TCP组的TBV值(28.2%±2.86%)显著高于CH200组(24.1%±4.12%)及CH500组(18.1%±4.66%)(P<0.01)。结论:BMSCs与4种材料的相容性良好。TCP与BMSCs复合后异位成骨效果显著,是很有希望的骨组织工程支架材料。     

骨髓基质细胞-Bio-oss修复颅骨缺损的实验研究

目的：分析和评价体外培养扩增的骨髓基质细胞（BMSCs）/Bio-oss修复大鼠颅骨极量骨缺损的效果.方法：取同基因大鼠的BMSCs,经体外分离培养扩增,与Bio-oss复合后充填颅骨极量骨缺损.在不损伤硬脑膜的情况下,磨除全层颅骨,造成动物标准缺损,用含或不含BMSCs的Bio-oss充填颅骨缺损.不充填物缺损作为空白对照.术后12周处死动物,取缺损区及周围骨质进行肉眼、X线片及组织学观察.结果：所有植入物无排除或感染.无论X线摄片及组织切片均表明,BMSCs/Bio-oss骨修复能力明显优于的空白组及平片用Bio-oss组.结论：BMSCs-Bio-oss复合物充填相对于单纯材料充填具有明显的骨缺损修复能力,是治疗各种骨缺损较有效的方法.     

犬骨髓基质干细胞复合珊瑚羟基磷灰石皮下成骨的实验研究

目的：犬自体皮下非受力部位植入犬骨髓基质干细胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）复合珊瑚羟基磷灰石（coralline hydroxyapatite，CHA），观察成骨情况及其转归。方法：体外分离培养、成骨诱导、扩增犬BMSCs，并通过细胞化学、免疫细胞化学检测成骨表型。将第2代细胞接种于CHA上，形成细胞一材料复合物，植于9只犬右侧腹部皮下，并在对称部位植入CHA作为对照。术后4、12、26周取材，HE染色，观察新生组织结构；通过形态计量学分析，对成骨情况量化，并行t检验。结果：成骨诱导后，细胞碱性磷酸酶染色阳性，免疫细胞化学显示骨钙蛋白表达阳性。HE染色示植入4周后，无明显骨形成；12周后，实验组有较多新生骨小梁形成，苦味酸-硫堇和Masson染色示骨基质和胶原形成良好；26周后，实验组骨小梁量有减少趋势。图像分析显示，实验组12周成骨量最高，差异有统计学意义。结论：犬BMSCs诱导后具有成骨活性，复合CHA后，可促进形成组织工程化骨。在无应力刺激情况下，随时间延长．局部成骨活动减弱。     

纳米羟基磷灰石/胶原/聚乳酸材料复合自体骨髓基质细胞修复犬下颌骨节段性缺损的实验研究

目的观察多孔块状纳米羟基磷灰石／胶原／聚乳酸材料（nHAC／PLA）作为支架与自体骨髓基质细胞（BMSCs）复合对大动物承力骨节段性缺损的修复能力,并探讨合适的术中固定方法,为临床应用提供实验依据。方法将多孔块状nHAC／PLA加工成3．0cm×2．0cm×1．0em的长方体状。体外培养犬髂骨来源的BMSCs,经过BrdU标记及成骨诱导后,与nHAC／PLA复合,并植人犬下颌骨3．Ocm长的节段性缺损处,经过6个月的饲养,通过影像学和组织形态学观察修复骨缺损的能力。并通过免疫组织化学的方法检测种子细胞的归宿。同时设自体髂骨移植组及单纯材料植入组作为对照。结果术后6个月,下颌骨缺损区被nHAC／PLA＋BMSCs复合形成的组织工程骨完全修复,形态恢复良好,大量成熟的骨组织充满缺损区的全层,材料大部分被吸收。从免疫组织化学染色结果看,组织工程骨细胞来源于种子细胞BMSCs。用钛重建板和微型钛板联合固定或单纯用钛重建板固定都可行。结论nHAC／PLA作为支架材料与自体BMSCs复合形成的组织工程骨可以修复大动物承力骨较大的节段性缺损,并可直接用钛重建板对其进行固定。     

应用富血小板血浆和骨髓基质细胞构建细胞-膜片及其异位成骨的实验研究

目的：探讨应用富血小板血浆（platelet rich plasma,PRP）和骨髓基质细胞（marrow stromal cells,MSCs）构建细胞-膜片的方法并评价膜片包裹珊瑚支架后的异位成骨能力。方法：将体外培养扩增的兔MSCs悬液与PRP混合,滴加到6孔培养板上,再滴加牛凝血酶溶液,形成凝胶样MSCs／PRP混合物,置于孵箱内培养。第1周用DMEM完全培养液,后2周改用DMEM诱导培养液。用得到的细胞-膜片包裹珊瑚圆片后,植入裸鼠背部皮下,以单纯珊瑚植入作对照。术后4周和8周取材,通过组织学观察,评价其异位成骨情况。结果：细胞-膜片具有一定的韧性和可操作性。扫描电镜观察显示：膜片由大量的纺锤样成骨细胞有规律地密集在一起而形成。组织学观察显示：术后4周和8周,膜-支架复合体珊瑚支架的表面及其孔洞内有大量的软骨或骨形成,以软骨内成骨的方式成骨;单纯珊瑚植入组,珊瑚表面及其孔洞内有大量纤维结缔组织长入,未见软骨或骨形成。结论：用PRP和MSCs构建细胞-膜片的方法简便,膜片包裹珊瑚支架形成的膜一支架复合体具有良好异位成骨能力。     

骨髓基质干细胞诱导内皮细胞与自体骨髓基质干细胞低氧条件下培养后的成骨能力

目的:探讨骨髓基质干细胞(BMSCs)诱导内皮细胞(ECs)与自体BMSCs低氧条件下联合培养对BMSCs成骨能力的影响.方法:体外分离培养兔BMSCs并向ECs诱导培养,用CD34免疫细胞化学染色鉴定内皮细胞表型:实验分组为BMSCs常氧成骨诱导培养组,BMSCs低氧成骨诱导培养组,BMSCs+ ECs常氧成骨诱导联合培养组BMSCs+ECs低氧成骨诱导联合培养组,持续培养7d,前6d应用PNPP法每天固定时间测定碱性磷酸酶(ALP)活性并作统计学分析;茜素红染色观察第7d矿化结节形成情况.低氧组为1.0％O2浓度.采用SPSS11.0软件包对数据进行方差分析和q检验.结果:BMSCs在一定诱导条件下可诱导为ECs,CD34免疫细胞化学染色为阳性;统计学分析表明,BMSCs+ ECs低氧成骨诱导联合培养组的ALP活性表达显著高于其他3组(P＜0.05).只有BMSCs+ ECs低氧成骨诱导联合培养组有钙化结节形成,茜素红染色呈橘红色.结论:在一定时间内,由BMSCs诱导来源的ECs与自体BMSCs低氧条件下联合培养,BMSCs的成骨活性可显著提高.     

骨髓基质干细胞向内皮细胞诱导分化的方法及临床应用前景

骨髓基质干细胞是一种多潜能干细胞,能自我复制并能分化为多种细胞系,目前被广泛用于再生医学的研究.在体外,经过一定细胞因子和细胞外基质的诱导,可定向分化为血管内皮细胞;在体内,骨髓基质干细胞被移植到缺血区后可发生血管生成.故临床上骨髓基质干细胞可用于少血管或无血管区的血管构建和受损组织的修复,但也可引起血管再狭窄、肿瘤生...     

水凝胶与陶瓷化骨及β-磷酸三钙复合对骨髓基质细胞成骨能力的影响

目的：观察水凝胶（hydrogel，HG）分别与陶瓷化骨（ceramic bovine bone，CBB）、β-磷酸三钙（β-tricalcium phosphate，β-TCP）复合成的复合材料对骨髓基质细胞（MSCs）的生长、分化的影响，寻找更适合骨组织工程的复合物支架材料。方法：将诱导的骨髓基质细胞接种于CBB/HG、β-TCP/HG上，另外MSCs分别接种于单纯的CBB、β-TCP上作为对照，进行体外培养。5、10d取材，细胞计数观察贴附及增殖情况，扫描电镜观察细胞形态以及材料的贴附情况，检测碱性磷酸酶的活性以及免疫组织化学方法检测Ⅰ型胶原的分泌情况。结果：骨髓基质细胞与各组材料均能形态良好贴附，两种复合材料上贴附的细胞数量明显高于对照组，CBB/HG、β-TCP/HG两组间细胞的碱性磷酸酶的活性以及Ⅰ型胶原的分泌量无明显差别，但显著高于对照组。结论：CBB/HG、β-TCP/HG均能促进骨髓基质细胞分化及基质分泌，是一良好的组织工程骨构建复合材料。     

培养状态下成人骨髓基质细胞的生长特性

目的研究培养状态下成人骨髓基质细胞的生长特性,为自体骨组织工程的功能细胞培养提供实验基础研究。方法培养健康成人骨髓基质细胞连续8代,测定第3、6代细胞的生长曲线、分裂指数、贴壁率及倍增时间。结果所测第3、6代细胞生长曲线基本相同,12h内细胞贴壁率达88.54%,分裂指数最高达15‰。结论在本实验条件下,细胞生长较稳定,接种成活率较高,增殖速度较快,可用于自体骨组织工程。