梅毒螺旋体膜蛋白Tpp47通过RhoA/ROCK信号通路调控血管内皮细胞通透性

目的 探讨梅毒螺旋体膜重组蛋白Tpp47对血管内皮细胞通透性影响的调控机制。 方法 用人脐静脉内皮细胞（HUVEC）构建细胞单层模型,重组蛋白Tpp47（rTpp47）直接与HUVEC单层模型混合培养,或RhoA/ROCK信号通路特异性抑制剂Y-27632预处理后再用rTpp47刺激HUVEC单层模型,以煮沸灭活的rTpp47处理HUVEC单层模型为阴性对照组,采用ELISA检测各组培养1、4 h时辣根过氧化物酶（HRP）流量,培养12 h用荧光染料罗丹明-鬼笔环肽染色细胞骨架系统,共聚焦显微镜下观察细胞骨架蛋白F肌动蛋白排列变化。用Western 印迹检测rTpp47与煮沸灭活的rTpp47分别处理HUVEC单层模型后细胞RhoA的表达水平。 结果 rTpp47刺激HUVEC单层模型1 h时HRP流量（0.81 ± 0.10）高于阴性对照组（0.39 ± 0.09）,差异有统计学意义（P < 0.05）,而此时Y-27632预处理组HRP流量（0.51 ± 0.10）与单用rTpp47刺激组及阴性对照组相比,差异无统计学意义（均P > 0.05）。培养4 h时,单用rTpp47刺激组HRP流量显著增加（2.31 ± 0.14）,且高于Y-27632预处理组（1.21 ± 0.12）及阴性对照组（0.73 ± 0.12）,差异有统计学意义（均P < 0.05）,而Y-27632预处理组与阴性对照组之间差异无统计学意义。rTpp47刺激HUVEC后,与煮沸灭活的rTpp47作用HUVEC相比,细胞中RhoA表达增加。同时,rTpp47刺激细胞中骨架蛋白F肌动蛋白重排,在胞质中形成应力纤维,抑制剂Y-27632可部分抑制F肌动蛋白重排。 结论 梅毒螺旋体膜重组蛋白Tpp47可通过RhoA/ROCK信号转导通路调控血管内皮细胞通透性。     

梅毒螺旋体诱导巨噬细胞分泌的外泌体特征及其对人脐静脉内皮细胞增殖的影响

目的 探讨梅毒螺旋体（Tp）体外诱导巨噬细胞分泌的外泌体特征及其对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）增殖水平的影响。方法 自雄兔睾丸分离Tp。将人单核巨噬细胞（THP-1）诱导为巨噬细胞后,分为实验组（Tp刺激）和对照组（不用Tp刺激）,12 h后继续培养48 h,收集巨噬细胞外泌体悬液,利用差速离心法和膜亲和试剂盒提取外泌体,运用透射电镜、Western印迹鉴定外泌体,Nanoparticle tracking analysis（NTA）粒径分析仪定量分析外泌体。将HUVEC分为实验组、对照组和外泌体洗脱液组,分别用外泌体悬液（4.5 × 108颗粒,实验组和对照组）、外泌体洗脱液刺激培养一定时间后,激光共聚焦扫描显微镜观察HUVEC对外泌体的吞噬,CCK8法检测HUVEC增殖活性。结果 透射电镜下的外泌体呈杯托样,为直径30 ~ 100 nm的微小囊泡。Western印迹显示,外泌体丰富表达膜蛋白CD63、CD9和CD81。相同实验条件下,NTA测定显示,实验组与对照组外泌体粒径（u = 1.90,P > 0.05）、浓度（z = -1.604,P = 0.109）差异均无统计学意义。两组外泌体分别与HUVEC共培养5 h后,激光共聚焦显微镜下见胞内散在分布被吞噬的绿色荧光外泌体。实验组、对照组外泌体分别作用于HUVEC 12 h后细胞增殖水平均高于外泌体洗脱液组,差异均有统计学意义（P < 0.05）;在24 h和48 h时对照组细胞增殖水平仍高于外泌体洗脱液组,在48 h达到峰值（P < 0.05）,实验组细胞增殖水平趋于正常;在72 h时实验组、对照组细胞增殖水平与外泌体洗脱液组差异无统计学意义（P > 0.05）。结论 THP-1来源的巨噬细胞分泌的外泌体在48 h内能显著提高HUVEC细胞增殖水平,在48 h达到峰值。在Tp刺激下,THP-1来源的巨噬细胞分泌的外泌体在形态、大小、浓度上与无Tp刺激巨噬细胞分泌的外泌体相似,但仅在短时间（12 h）内提高HUVEC增殖水平。     

梅毒免疫和梅毒螺旋体的研究进展

梅毒螺旋体有着独特的基因和蛋白结构,对其基因分型有利于梅毒分子流行病学的研究.梅毒螺旋体缺乏脂多糖与外膜蛋白,但可表达多种脂蛋白,这些脂蛋白同梅毒螺旋体的组织黏附及播散有关,同时可诱导机体发生免疫应答.机体对于梅毒螺旋体的免疫应答过程十分复杂,固有免疫、体液免疫及细胞免疫均在梅毒螺旋体的感染过程中参与了应答过程.Th1型细胞免疫在梅毒的发生发展过程中起重要作用,梅毒患者在局部及系统免疫方面都存在细胞免疫的异常.     

衡阳和江门地区梅毒螺旋体基因分型的初步研究

目的 了解湖南衡阳和广东江门地区梅毒螺旋体(TP)基因亚型的分布.方法 收集衡阳和江门地区疑似硬下疳病例的标本85份,经TP polA PCR筛选后,阳性者用PCR扩增各标本中TP的arp和tpr基因,酶切tpr基因扩增产物,分析各TP菌株arp基因长度和tpr基因的限制性片段长度多态性(RFLP),进行分型.结果 TP polA PCR阳性者69例,可用于分型者57例,分为10个亚型,其中14d亚型为26例,其他亚型包括10d(1),12a(3),12g(2),13d(6),14a(5),14b(2),14f(6),15d(5),16d(1);衡阳和江门地区TP基因亚型分布大致相同.结论 衡阳和江门地区存在TP的多亚型,都以14d亚型为主(占45.6%),无明显地区性差异.     

梅毒螺旋体对人脑微血管内皮细胞趋化因子配体6、8、10表达的影响

目的 探讨梅毒螺旋体对人脑微血管内皮细胞（HBMEC）趋化因子配体（CXCL）表达的影响。方法 将培养的HBMEC分为4组,分别加入用细胞培养液稀释的有活性的梅毒螺旋体、灭活的梅毒螺旋体、脂多糖和细胞培养液（梅毒螺旋体组、灭活梅毒螺旋体组、脂多糖组和空白对照组）刺激6、12、24 h,用荧光定量PCR和酶联免疫吸附试验分别检测细胞中CXCL6、CXCL8和CXCL10基因和蛋白表达水平。利用Transwell小室细胞迁移实验检测梅毒螺旋体刺激后HBMEC对人早幼粒细胞白血病细胞HL-60的趋化作用。结果 在各时间点,梅毒螺旋体组HBMEC中CXCL6、CXCL8和CXCL10的mRNA表达水平均显著高于空白对照组和灭活梅毒螺旋体组（P＜0.05）,而灭活梅毒螺旋体组与空白对照组之间差异无统计学意义（均P＞0.05）。和脂多糖组相比,梅毒螺旋体组的CXCL6和CXCL8 mRNA表达降低（P＜0.05）,CXCL10差异无统计学意义（P＞0.05）。在各时间点,梅毒螺旋体组HBMEC培养上清液中CXCL6和CXCL8含量均高于空白对照组和灭活梅毒螺旋体组（均P＜0.05）,而后2组间差异无统计学意义（均P＞0.05）。各时间点培养上清液中CXCL10含量在梅毒螺旋体组、灭活梅毒螺旋体组和空白对照组间差异无统计学意义（均P＞0.05）;梅毒螺旋体组Transwell小室下室中迁移的HL-60细胞数量（A570）均高于另2组（均P＜0.05）。结论 有活性的梅毒螺旋体可上调HBMEC中CXCL6、CXCL8和CXCL10基因表达水平,增加CXCL6和CXCL8的分泌,增强HBMEC对HL-60细胞的趋化作用,这可能在神经梅毒的发病中起一定作用。     

白介素2与梅毒螺旋体膜蛋白Gpd双价核酸疫苗的免疫活性及保护作用研究

目的 探讨白介素2(IL-2)基因与梅毒螺旋体(Treponema pallidum,Tp)Gpd抗原编码基因融合构建双价核酸疫苗免疫新西兰兔后的免疫应答效果及感染Tp后的保护作用.方法 定向克隆构建真核表达重组体pcDNA3.1(+)/Gpd-IL-2,与先期构建的pcDNA3.1(+)/Gpd真核表达重组体分别设为两个疫苗实验组,同时设pcDNA3.1(+)空质粒对照组及PBS对照组,共4组,每组18只雄性新西兰兔,肌肉多点注射初次免疫,于初次免疫后第10周各实验组兔皮下接种Tp标准株进行感染实验,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测不同时间点免疫兔特异性抗体产生水平和脾细胞IL-2及干扰素γ(IFN-γ)诱导水平,噻唑蓝法检测兔脾淋巴细胞增殖水平.结果 用pcDNA3.1(+)/Gpd-IL-2融合双价疫苗和pcDNA3.1(+)/Gpd单基因疫苗在免疫期间和感染期间均能检测到高滴度的IgG特异性抗体,最高滴度分别可达1∶4096和1∶1024(P值均＜0.01);两疫苗组之间在免疫及感染期间不同时间点比较差异也有统计学意义(P值均＜ 0.01);免疫后第8周双价融合核酸疫苗组及单基因核酸疫苗组兔脾细胞培养上清中IFN-γ分别为(447±22.4)μg/L、(225±17.6)μg/L,IL-2分别为(167±15.7)μg/L、(110±12.6)μg/L,均高于空质粒对照组和空白对照组(P值均＜ 0.01);感染期间不同时间点兔脾细胞受相应蛋白刺激均有明显增殖反应,检测指标均显著高于空质粒对照组和空白对照组(P值均＜ 0.01).早期感染皮损观察显示双价融合核酸疫苗组较之单基因疫苗组有着更低的皮损Tp检测阳性率(17.5％)、溃疡病灶发生率(15％)以及更短的皮损愈合时间.结论 用pcDNA3.1(+)/Gpd-IL-2双基因融合疫苗在兔体内能更有效地诱导保护性体液免疫和细胞免疫应答.     

白藜芦醇对婴儿血管瘤内皮细胞活性的影响

【摘要】 目的 研究葡萄糖转运体1（Glut-1）抑制剂白藜芦醇（RSV）对婴儿血管瘤内皮细胞（HemEC）活性的影响。方法 收集4例增殖期与4例消退期婴儿血管瘤（IH）组织,采用免疫组化观察Glut-1的表达。从4例增殖期IH组织中提取原代HemEC,采用qPCR与Western印迹检测HemEC与对照脐静脉内皮细胞 （HUVEC）中Glut-1 mRNA与蛋白的表达水平。体外培养HemEC,分别采用0（对照组）、50、100、200、400、800 μmol/L RSV干预24 h,采用CCK-8法检测各组HemEC增殖能力,计算半抑制浓度（IC50）。分别采用Transwell实验、流式细胞仪观察HemEC迁移能力及凋亡水平。组间比较采用t检验或方差分析,组间多重比较采用LSD-t检验。结果 免疫组化显示,增殖期及消退期IH组织中血管内皮细胞Glut-1均阳性,但增殖期表达丰富,消退期表达明显降低。HemEC中Glut-1 mRNA及蛋白表达水平（1.793 ± 0.041、1.959 ± 0.144）均高于HUVEC（0.820 ± 0.073、0.648 ± 0.046,t = 16.35、12.28,均P < 0.001）。采用Glut-1抑制剂RSV干预HemEC后,0 ~ 800 μmol/L组HemEC增殖活性差异有统计学意义（F = 1 043.00,P < 0.001）,所有RSV干预组HemEC的增殖活性均低于对照组（P < 0.05）。GraphPad Prism 8计算得出RSV IC50浓度为150 μmol/L,Transwell实验与流式细胞仪检测显示,150 μmol/L RSV干预组HemEC组细胞迁移数（61 ± 5）低于对照组（150 ± 6,t = 15.11,P < 0.001）,凋亡率（13.01% ± 0.45%）高于对照组（3.93% ± 0.68%,t = 19.34,P < 0.001）。结论 糖酵解关键酶Glut-1在IH增殖期组织与HemEC中高表达,RSV干预可以抑制HemEC增殖及迁移能力并促进其凋亡。     

梅毒螺旋体融合双价DNA疫苗的构建及其免疫活性研究

目的 构建含有梅毒螺旋体Gpd和Tp92抗原编码基因的真核表达重组体,并检测其在兔体内的免疫应答效果。方法 定向克隆构建双基因融合真核表达重组体pcDNA3.1(+)/Gpd-Tp92,用免疫组化技术检测其在HeLa细胞中的表达;同时将其与先期构建的pcDNA3.1(+)/Gpd、pcDNA3.1(+)/Tp92真核表达重组体分别免疫新西兰兔,ELISA检测免疫兔特异性抗体产生水平和脾细胞IFN-γ诱导水平,MTT法检测兔脾细胞增殖水平。结果 pcDNA3.1(+)/Gpd-Tp92在HeLa细胞中能有效表达。新西兰兔分别接种3种核酸疫苗后,均能产生特异性抗体,第3次免疫后2周抗体最高滴度均可达1:1024及以上,免疫后兔脾细胞受相应蛋白刺激有明显增殖反应,细胞培养上清中IFN-γ水平显著升高。检测指标均显著高于空质粒对照组和空白对照组(P<0.05)。3组核酸疫苗组抗体诱导水平差异无统计学意义,但Gpd-Tp92融合核酸疫苗组刺激机体引发特异性淋巴细胞增殖能力较之两单基因核酸疫苗组有明显提高。结论 梅毒螺旋体真核表达重组体pcDNA3.1(+)/Gpd-Tp92的成功构建及对新西兰兔产生强特异免疫应答的有效刺激,为梅毒DNA疫苗的研究奠定一定的实验基础。     

白念珠菌对人血管内皮细胞表面黏附分子表达和细胞因子分泌的影响

目的 观察白念珠菌对人血管内皮细胞表面细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)表达及分泌白介素6(IL-6)、白介素8(IL-8)水平的影响.方法 分离健康产妇胎盘脐静脉内皮细胞进行原代培养,细胞长至单层时,与白念珠菌共培养不同时间,再用逆转录-聚合酶链反应法分析内皮细胞表面ICAM-1mRNA、VCAM-1mRNA的表达,用ELISA法检测IL-6、IL-8分泌水平.结果 白念珠菌刺激4h后血管内皮细胞表达ICAM-1 mRNA、VCAM-1 mRNA明显增加,至8h达到峰值.而IL-6,IL-8的分泌在4h后也明显增加(P<0.05),24h到达高峰(P<0.01).结论 白念珠菌可诱导人血管内皮细胞ICAM-1 mRNA、VCAM-1 mRNA表达及促进IL-6、IL-8分泌.     

NB-UVB辐射对HUVEC分泌sE-selectin及sICAM-1的影响

目的研究NB-UVB辐射对TNF-α刺激人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)表达可溶性E选择素(sE-se-lectin)及可溶性细胞间黏附分子(sICAM-1)的影响。方法体外培养人脐静脉血管内皮细胞(HU-VEC),将HUVEC接种于96孔塑料培养板,分为对照组,TNF-α组,TNF-α+NB-UVB60mJ/cm2剂量组,TNF-α+NB-UVB40mJ/cm2剂量组,TNF-α+NB-UVB20mJ/cm2剂量组。TNF-α刺激浓度为10ng/mL;NB-UVB高,中,低剂量组剂量分别为20,40,60mJ/cm2。采集上清,ELISA法检测可溶性E选择素(sE-selectin)和可溶性细胞间黏附分子1(sICAM-1)含量。结果 NB-UVB能剂量依赖性地抑制TNF-α刺激后HUVEC分泌sE-selectin和sICAM-1。结论 NB-UVB可能通过抑制血管内皮细胞表达黏附分子在治疗炎症性皮肤病中发挥免疫调节作用。     

梅毒螺旋体粘附于人脑微血管内皮细胞的实验研究

目的 观察梅毒螺旋体对人脑微血管内皮细胞（HBMEC）的粘附。 方法 将HBMEC接种于24孔板玻片中,加入1.6 × 107条/ml的梅毒螺旋体悬液混合培养,分别于培养0.5、2、4 h,运用扫描电镜检查梅毒螺旋体与HBMEC的粘附方式;加不同密度（4 × 106条/ml、8 × 106条/ml、1.6 × 107/条ml）梅毒螺旋体悬液混合培养,于不同的时间点（2、4、6、16 h）运用暗视野显微镜检查计数单个HBMEC上粘附的梅毒螺旋体数量。采用重复测量资料的方差分析对实验数据进行分析。 结果 扫描电镜结果显示,梅毒螺旋体与HBMEC粘附时表现为集中粘附于HBMEC膜表面的某一区域,且在粘附的部位两者发生部分融合。加入不同浓度的梅毒螺旋体悬液与HBMEC混合培养后,不同时间点细胞上粘附的梅毒螺旋体数目差异有统计学意义（F = 387.72,P < 0.001）,单个细胞上的梅毒螺旋体数量随着混合培养时间的延长而逐渐增多,6 h时达到高峰,然后呈下降趋势,在16 h时为最低。在各观察时间点,不同密度组细胞上粘附的梅毒螺旋体数目差异也有统计学意义（F = 593.23,P < 0.001）,时间与密度存在交互作用（F = 98.74,P < 0.001）。 结论 梅毒螺旋体可以粘附于体外培养的HBMEC,部分梅毒螺旋体可能通过末端与HBMEC膜溶解粘附于细胞表面。     

人脂肪间充质干细胞体外向黑素细胞分化的研究

【摘要】 目的 建立体外诱导人脂肪间充质干细胞（hADSC）向黑素细胞分化的方法。 方法 由人皮下脂肪分离培养获得hADSC,流式细胞仪检测细胞表型,成骨成脂分化证明分化潜能。将干细胞生长因子（SCF）、内皮素3 （EDN-3）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）等加到条件培养基中,促使第5代hADSC向黑素细胞方向诱导,诱导至第10周。未诱导组为正常对照组。使用实时荧光定量PCR检测黑素相关基因小眼畸形转录因子（MITF）,酪氨酸激酶受体c-Kit（KIT）,多巴色素异构酶（DCT）,酪氨酸酶（TYR）,酪氨酸酶相关蛋白1（TYRP1）,性别决定区域相关转录因子10（SOX10） mRNA的表达量,统计学分析采用单因素方差分析及LSD-t检验。诱导结束后,通过免疫细胞化学法、细胞免疫荧光法进行鉴定。 结果 流式细胞仪显示分离培养获得的hADSC高表达CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166,阳性率均在95%以上;低表达或不表达CD31、CD34、CD45,人白细胞DR抗原（HLA-DR）。成骨成脂分化结果显示hADSC具有分化潜能。实时荧光定量PCR结果显示,诱导10周后,MITF、KIT、DCT、TYR、TYRP1、SOX10 mRNA的表达水平分别为0.325 ± 0.012,0.042 ± 0.006,0.046 ± 0.013,0.036 ± 0.005,0.041 ± 0.003,0.225 ± 0.014,与诱导0周组相比,均有上调（P < 0.05）。诱导结束后,免疫细胞化学MITF、HMB45染色阳性,细胞免疫荧光TYRP1、S100阳性表达。 结论 由人脂肪间充质干细胞诱导所得细胞具有一定的黑素细胞生物学特性。     

阿维A对HaCaT细胞体外凋亡和胰岛素样生长因子结合蛋白7及血管内皮生长因子表达的影响

目的 探讨阿维A对HaCaT细胞体外凋亡和胰岛素样生长因子结合蛋白7（IGFBP7）及血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响。 方法 将10-5、10-6、10-7、10-8 mol/L的阿维A分别作用于HaCaT细胞24、48、72 h后,采用CCK8法检测细胞增殖情况;流式细胞仪检测阿维A对HaCaT细胞凋亡率的影响;Western印迹和RT-PCR法检测阿维A对HaCaT细胞IGFBP7、VEGF蛋白及其mRNA表达的影响。 结果 10-8 mol/L阿维A处理HaCaT细胞48 h时表现出对细胞增殖的抑制作用,随着时间延长和药物浓度升高,抗增殖作用亦增强,当药物浓度增加到10-5 mol/L时,48 h和72 h的抑制率分别为39.94% ± 2.27%和49.77% ± 1.87%。与对照组相比,10-5 mol/L阿维A作用48 h后,凋亡率由1.803% ± 0.313%（对照组）上升至7.617% ± 0.767%（阿维A组）（P ＜ 0.05）,IGFBP7的表达由0.436 ± 0.013上升至0.939 ± 0.040（P ＜ 0.05）,IGFBP7 mRNA的表达由0.190 ± 0.056上升至0.872 ± 0.079（P ＜ 0.05）,VEGF的表达由0.798 ± 0.036下降至0.213 ± 0.032（P ＜ 0.05）,VEGF mRNA的表达由0.933 ± 0.054下降至0.274 ± 0.041（P ＜ 0.05）。 结论 阿维A可促进HaCaT细胞的体外凋亡,并可在蛋白及mRNA水平上调IGFBP7及下调VEGF的表达。     

lncRNA LEF1-AS1通过靶向miR-612调控皮肤鳞状细胞癌细胞株增殖、凋亡、迁移侵袭的体外实验研究

【摘要】 目的 探讨长链非编码RNA（lncRNA）LEF1-AS1对皮肤鳞状细胞癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响及其机制。方法 通过干扰皮肤鳞状细胞癌SCC13细胞LEF1-AS1的表达和过表达、抑制miR-612的表达,将SCC13细胞分为转染LEF1-AS1干扰序列、无义序列的干扰LEF1-AS1组、干扰对照组,转染miR-612过表达序列、无义序列的miR-612过表达组、过表达对照组,以及转染LEF1-AS1干扰序列与miR-612抑制序列的干扰抑制组,和转染LEF1-AS1干扰序列与miR-612抑制无义序列的干扰抑制对照组。采用qRT-PCR法检测各组细胞miR-612的相对表达,CCK8法检测细胞增殖,流式细胞仪分析细胞的凋亡情况,Transwell试验检测细胞的迁移、侵袭能力,Western印迹检测细胞周期蛋白依赖激酶1（cyclinD1）、细胞周期蛋白依靠性激酶抑制剂（p21）、Bcl-2家族蛋白（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、基质金属蛋白酶2（MMP-2）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）的表达。用LncBase Predicted v.2 在线预测网站预测lncRNA LEF1-AS1与miR-612之间的互补序列,将互补/非互补序列用于构建荧光素酶报告基因质粒,分别与miR-612过表达及过表达对照基因共转染SCC13细胞,验证lncRNA LEF1-AS1与miR-612的结合能力。两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验。结果 miR-612过表达组细胞增殖能力、迁移及侵袭细胞数均低于过表达对照组（均P < 0.05）,凋亡率高于过表达对照组（P < 0.05）。干扰LEF1-AS1组、干扰对照组、干扰抑制组、干扰抑制对照组miR-612的相对表达差异有统计学意义（F = 150.78,P < 0.001）,24、48、72 h时的增殖能力差异有统计学意义（均P < 0.05）,凋亡率、迁移及侵袭细胞数差异均有统计学意义（均P < 0.05）。干扰LEF1-AS1组细胞中miR-612表达、凋亡率高于干扰对照组,48、72 h细胞增殖能力、迁移细胞数和侵袭细胞数低于干扰对照组（均P < 0.05）,而干扰抑制组细胞中miR-612表达、细胞凋亡率低于干扰抑制对照组,48、72 h细胞增殖能力、迁移细胞数和侵袭细胞数高于干扰抑制对照组（均P < 0.05）。Western印迹显示,4组细胞cyclinD1、p21、Bcl-2、Bax、MMP-2、MMP-9蛋白相对水平差异均有统计学意义（均P < 0.001）,干扰LEF1-AS1组cyclinD1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白相对水平均高于干扰对照组,p21、 Bax蛋白相对水平低于干扰对照组（均P < 0.05）;而干扰抑制组cyclinD1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白相对水平均高于干扰抑制对照组,p21、 Bax蛋白相对水平低于干扰抑制对照组（均P < 0.05）。共转染互补序列后,miR-612过表达组细胞荧光活性低于过表达对照组（t = 21.19,P < 0.001）;而共转染非互补序列后,miR-612组细胞荧光活性与过表达对照组差异无统计学意义（t = 0.28,P = 0.78）。结论 lncRNA LEF1-AS1调控皮肤鳞状细胞癌细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭,机制与靶向miR-612相关。     

人羊膜上皮细胞复合去表皮的真皮构建组织工程皮肤修复裸鼠皮肤缺损的实验研究

目的 探索由人羊膜上皮细胞(hAEC)、成纤维细胞与去表皮的真皮(DED)构建组织工程皮肤修复裸鼠全层皮肤缺损的可行性.方法 采用低浓度胰蛋白酶多步消化分离法提取hAEC,并用两步酶消化法处理健康小儿包皮,获得成纤维细胞悬液,传代培养.将体外扩增培养至第3～5代的成纤维细胞和第2代hAEC分别接种在DED真皮面和基底膜面,体外器官培养构建组织工程皮肤.取3～4周龄健康雄性裸鼠20只,抽签法随机分为2组,在所有小鼠背部正中制备全层皮肤缺损模型.组织工程组用构建的组织工程全层皮肤覆盖创面;对照组创面仅覆盖凡士林油纱.分别于术后第7、14、21、28天对裸鼠全身及移植部位大体观察,比较两组间创面愈合时间及创面愈合率,并对移植部位行组织学观察.结果 hAEC具有干细胞特征,免疫荧光显示其表达结合转录因子4(0CT-4)、阶段特异性胚胎抗原4(SSEA-4).器官培养2周后,体外构建的组织工程皮肤形成4～9层复层表皮,且表皮的组织结构形态与正常皮肤类似.移植组织工程皮肤至裸鼠创面后肉眼观察显示,在移植后第7、14、21天,组织工程组创面愈合率分别为57.49％±6.11％、92.80％±3.10％、98.83％±0.25％,均明显高于对照组(22.93％±4.26％、54.57％±7.94％、91.16％±4.79％),差异均有统计学意义(n=10,t值分别为27.36、32.23、11.80,均P＜0.001),组织工程组创面愈合时间[(21.51±1.51)d]明显短于对照组[(28.80±1.14)d](n=10,￡=42.23,P＜0.001),且在移植后第28天移植物颜色与自体皮肤颜色接近.组织学观察显示,组织工程组上皮层次清晰,角化明显,真皮层细胞生长良好;对照组移植区上皮较薄且有部分缺损,真皮层次欠佳,且可见炎症细胞浸润.结论 用hAEC、成纤维细胞复合DED构建的组织工程皮肤移植后能在裸鼠体内存活,且创面愈合更佳,可望成为一种较理想的组织工程皮肤.