变异链球菌表面蛋白A区与霍乱毒素B亚单位嵌合基因转基因黄瓜植株的获得及鉴定

目的:经农杆菌介导将变异链球菌表面蛋白A区与霍乱毒素B亚单位嵌合基因导入黄瓜,获得转基因黄瓜植株,为转基因可食防龋疫苗的研究提供实验基础。方法:利用双元载体pCAMBIA2301构建变异链球菌表面蛋白A区与霍乱毒素B亚单位嵌合质粒(PAcA-ctxB)的植物表达载体p2355-PAcA-CTB;电转化法导入农杆菌EHA105;采用叶盘转化法转化黄瓜,转基因植物经过卡那霉素抗性筛选、GUS基因染色、PCR及Southern blot杂交分析检测目的基因鉴定。结果:成功得到转基因黄瓜植株,卡那霉素抗性筛选、GUS基因染色、PCR及Southern blot杂交分析检测证实目的基因PAcA-ctxB已整合至黄瓜基因组中。结论:获得了含有变异链球菌表面蛋白A区与霍乱毒素B亚单位嵌合基因的转基因黄瓜植株,为转基因可食防龋疫苗的进一步研究提供了实验基础。     

霍乱毒素B亚单位嵌合体防龋疫苗研究进展

霍乱毒素B亚单位嵌合体防龋疫苗能诱导机体产生显著的免疫抗龋反应,尤其是唾液腺的IgA抗体反应,能有效地阻止致龋菌在牙面的聚集和龋坏的发生,可望成为一种安全、高效的防龋疫苗。     

变异链球菌乳酸脱氢酶与霍乱毒素B亚单位嵌合表达质粒的构建和表达

目的:构建含变异链球菌乳酸脱氢酶(LDH)和霍乱毒素B亚单位(CTB)嵌合原核表达质粒,并诱导表达融合蛋白。方法:应用PCR技术扩增LDH编码基因ldh和CT编码基因ctxB,定向克隆至原核表达质粒pET32a(+)上,通过限制性内酶切、PCR和序列测定分析鉴定后转化大肠杆菌BL21(DE3),并经IPTG诱导表达融合蛋白。结果:PCR扩增得到了ldh和ctxB;构建的质粒pET-LDH/CTB经KpnⅠ、XhoⅠ双酶切和目的基因PCR检测,均得到1.4 kb大小的片段,与预计目的基因片段大小相同;质粒pET-LDH/CTB中插入的ldh序列与GeneBank中ldh比较同源性为98%,ctxB的同源性达99%,插入的相位正确;经IPTG诱导表达了约70×103的蛋白。结论:成功构建了变异链球菌LDH和CTB嵌合表达质粒pET-LDH/CTB,并正确表达融合蛋白。     

霍乱毒素B亚单位嵌合体防龋疫苗研究进展

霍毛毒素Ｂ亚单位嵌合体防龋疫苗能诱导机体产生显著的免疫抗龄反应，尤其是唾液腺的ＩｇＡ抗体反应，能有效地阻止致龋菌在牙面的聚集和龋坏的发生，可望成为一种安全，高效的防龋疫苗。     

变形链球菌表面蛋白P1粘膜免疫动物模型的建立及霍乱毒素的免疫增强作用

用共价偶联的方法 ,将变形链球菌表面蛋白 P1与霍乱毒素 B亚单位或前霍乱原类毒素进行偶联后 ,用灌胃的方法将不同的免疫剂进行大鼠免疫实验 ,检查不同时间大鼠体内特异抗体的产生情况。结果证实了霍乱毒素 B亚单位的佐剂效果 ,同时发现前霍乱原类毒素具有强的胃肠免疫增强作用。     

变形链球菌表面蛋白多肽片段在转基因番茄中的表达

目的在获得含编码变形链球菌表面蛋白唾液粘附区片段基因的转基因番茄原代种子的基础上,应用分子生物学的方法检测外源基因在转基因植株中的表达。方法用CTAB法提取子代番茄总DNA,PCR筛选含变形链球菌PAc基因唾液粘附区片段的转基因番茄子代植株;用Trizol提取番茄总RNA,RT- PCR检测外源基因的转录情况;提取番茄果实总蛋白,用Bradford法测定番茄果实总蛋白含量;通过Western blot检测外源蛋白的表达情况,并用ELISA法对外源蛋白含量进行定量测定。结果获得植物细胞染色体上整合有外源基因并发生表达的转基因番茄子代植株;Western blot和ELISA分析表明含编码变形链球菌表面蛋白唾液粘附区片段基因的转基因番茄子代植株能有效表达外源蛋白,该蛋白含量占番茄可溶性总蛋白的1.2%。结论含编码变形链球菌表面蛋白唾液粘附区片段基因的转基因番茄子代植株能有效表达外源蛋白。     

表面蛋白抗原P及其在变异链球菌生物膜形成中的作用

变异链球菌表面蛋白抗原(SPA)P是一类介导细菌黏附和生物膜形成的重要的黏附毒力因子,具有高度保守性.SPAP含有1 561个氨基酸残基,其线性结构氨基酸序列由前导肽区、N端、A区、V区、P区、C端和细胞壁锚着端组成.SPAP具有的淀粉样纤维特性,在细菌生物膜形成中十分重要.SPAP可与牙面获得性膜中的唾液成分结合,介导变异链球菌对牙面的初始黏附.SPAP通过分选酶转移肽共价结合到细菌胞壁表面,在内源性的表面蛋白释放酶作用下又可从细菌胞壁表面释放出来,从而使变异链球菌生物膜降解.本文就SPAP的结构、淀粉样纤维特性,变异链球菌黏附,SPAP各区在生物膜形成中的作用等研究进展作一综述,明确其生物学特性,对于龋病病因学和龋病防治的意义不言而喻.     

变形链球菌葡聚糖结合蛋白B基因在大肠杆菌中的表达及纯化

目的 :在大肠杆菌中表达变形链球菌葡聚糖结合蛋白B基因 (glucanbindingproteinB ,gbpB) ,并对重组蛋白进行初步纯化 ,为下一步制备多抗和进行相关的研究奠定基础。方法 :将克隆到的gbpB全长编码区基因克隆到表达载体 pPROEXTMHTb ,构建表达质粒 pPROEXTMHTb - gbpB ,以大肠杆菌E .coliBL2 1(DE3)为宿主菌进行诱导表达 ,表达产物经镍 -次氮基三乙酸 (Ni-NTA)柱进行亲和层析纯化。结果 :工程菌经IPTG诱导 3h后 ,在SDS -PAGE上出现一条新的蛋白条带 ,相对分子量 (Mr)为 4 .5～ 5 .0× 10 3 ,以可溶形式存在 ,经Ni-NTA柱纯化后获得纯度较高的重组葡聚糖结合蛋白B。结论 :获得Mr为 4 .5～ 5 .0× 10 3 的重组葡聚糖结合蛋白B     

琥珀酸脱氢酶基因B亚单位在散发性副神经节瘤中的突变

目的:探讨人线粒体琥珀酸脱氢酶(SDH)基因B亚单位(SDHB)基因突变与散发性副神经节瘤之间的关系。方法:取8例散发性副神经节瘤患者的肿瘤石蜡标本,提取基因组DNA,对SDHB基因的8个外显子进行PCR扩增和测序分析,与Genebank中人类SDHB基因序列及SNP数据库比对,寻找突变位点。结果:8例肿瘤组织标本中,在64个外显子中发现8例9个核苷酸改变。其中1例1个核苷酸改变为基因点突变,突变率为12.5%,为第2外显子第64位碱基C突变为T(c.136C>T),导致第2外显子编码的第22位密码子由精氨酸密码子突变为终止子(p.Arg46X)。另外8例8个为单核苷酸多态性改变。结论:散发性副神经节瘤患者中存在SDHB基因突变,可能与副神经节瘤的发生有关。     

变形链球菌葡聚糖结合蛋白B基因防龋疫苗的构建及其在哺乳动物细胞中的表达

目的：观察变形链球菌葡聚糖结合蛋白B(gbpB)真核表达质粒pcDNA3．1( )-gbpB在哺乳动物细胞COS-7的表达情况，方法：通过基因重组技术构建真核表达质粒pcDNA3．1( )-gbpB，通过脂质体转染法将其转染车COS-7细胞，通过免疫组化SABC法检洲其在COS-7细胞的表达结果：pcDNA3．1( )-gjhB质粒转染的细胞胞浆中呈棕黄色染色，胞核中无着色，pcDAN3．1( )空载体转染的细咆咆浆及胞核无着色，空白对照组也无着色结论：质粒pcDNA3．1( )-ghpB转染COS-7后能够住细胞内翻译、表达，表达的蛋白质位于胞浆中．可与抗GbpB抗体特异性结合，具存抗原性，可作为基因疫苗。     

Biological functions of glucan-binding protein B of Streptococcus mutans

INTRODUCTION: Streptococcus mutans has been implicated as a major causative agent of dental caries in humans. Bacterial components associated with the adhesion phase of S. mutans include glucosyltransferases, protein antigen C and proteins that bind glucan. At least four glucan-binding proteins (Gbp) have been identified; GbpA, GbpB, GbpC and GbpD. METHODS: In our previous study, the contributions of GbpA and GbpC to the virulence of S. mutans were investigated; however, the biological function of GbpB and its role in the virulence of S. mutans remain to be elucidated. Using a GbpB-deficient mutant strain (BD1), we demonstrated in the present study that GbpB has a role in the biology of S. mutans. RESULTS: The growth rate of BD1 was lower than that of other strains, while it was also shown to be less susceptible to phagocytosis and to form longer chains than the parental strain MT8148. In addition, electron microscope observations of the cell surfaces of BD1 showed that the cell-wall layers were obscure. CONCLUSION: These results suggest that GbpB may have an important role in cell-wall construction and be involved in cell separation and cell maintenance.     

变形链球菌葡糖基转移酶真核表达质粒pcDNA3-gtfB的构建

目的:构建变形链球菌葡糖基转移酶真核表达质粒pcDNA3-gtfB,为以其作为基因疫苗进行免疫动物实验奠定物质基础。方法:以变形链球菌GS-5全染色体DNA为模板,通过PCR方法扩增获得含有多个编码变形链球菌葡糖基转移酶抗原表位的目的基因gtfB,将分离纯化的目的基因和质粒pcDNA3用KpnÑ、XhoÑ双酶切,酶切产物在 T4 DNA连接酶作用下进行体外重组,用改良Hanahan法转化感受态大肠杆菌JM109,采用氨苄青霉素抗性LB平板初步筛选阳性克隆子后,抽提重组质粒,进行酶切鉴定,DNA序列测定。结果:经PCR扩增获得的目的基因分子量与预计相同,并定向插入真核表达载体pcDNA3,插入相位正确,未改变目的基因的阅读框架。结论:真核表达质粒 pcDNA3-gtfB含有多个葡糖基转移酶免疫显性抗原表位编码基因,且选用的高表达真核表达载体pcDNA3,能直接激活抗原提呈细胞,可以使重组质粒pcDNA3-gtfB具有较强的免疫原性和免疫反应性,为利用其作为基因疫苗防龋奠定了基础。     

变形链球菌葡聚糖结合蛋白B的纯化

目的：从变形链球菌S.mutans Ingbritt(serotype c)培养液上清中纯化葡聚糖结合蛋白B。方法：Sephadx G-200凝胶（α-1,6键葡聚糖）亲和层析和Q－SephroseFF离子交换层析。结果：纯化出约10μg具有葡聚糖结合特性的GbpB蛋白。结论：通过Sephadx G-200凝胶（α-1,6键葡聚糖）亲和层析和Q－Sephrose FF离子交换层析纯化出变链菌葡聚糖结合蛋白B。     

变形链球菌表面蛋白遗传多态性与龋病发生关系的研究Ⅱ表面蛋白V区、P区编码基因序列的测定

目的 :对不同粘附力变形链球菌临床分离株表面蛋白V区、P区编码基因进行序列测定。方法 :实验菌株选自本实验室前期工作所获得的spaP pv经AluI酶切后呈不同基因型的不同粘附力血清c型变形链球菌临床分离株。提取全菌DNA ,经PCR扩增表面蛋白V区、P区编码基因spaP pv( 2 0 60～ 3 15 7bp)后 ,进行序列测定。结果 :不同粘附力变链菌临床株spaP pv经AluI酶切后呈a、b 2种基因型的菌株测出的spaP pv序列均有 7个AluI酶切位点 5′ AG↓CT 3′。 10株a型菌株序列除了几个碱基点突变外均相同 ,9株b型菌株序列亦如此。a型有 2个DNA片段与b型不同 ,经分析 ,这 2个变异片段均位于V区。结论 :变链菌临床株表面蛋白粘附性能的差异可能是编码基因可变区域V区出现变异所致     

Fibrillar strains of Streptococcus sanguis biotype I carry a surface protein which cross-reacts with Antigen B from Streptococcus mutans Ingbritt

Eleven strains of Streptococcus sanguis biotype I carrying peritrichous fibrils and 4 strains with lateral tufts of fibrils were screened for crossreactivity with Antigen B (AgB), a protein with a molecular weight of 190,000, isolated from Streptococcus mutans Ingbritt. An antigen of similar molecular weight, which cross-reacted serologically with AgB was detected by immunodiffusion, Western blotting and dot immuno-binding in strains of S. sanguis biotype I with peritrichous fibrils but not in tufted strains. One strain, S. sanguis LGR2 carried dense fibrils (5+ density) and the gold label appeared to be associated with the fibrils. However, over all the strains there was no correlation between the density of fibrils and the amount of AgB labelling. Immunonegative staining confirmed the absence of AgB cross reactivity in the tufted strains of S. sanguis I, although the gold labelled the tuft fibrils non-specifically. Antigen B was located on the cell surface of S. mutans Ingbritt and the label extended 45.9±9.9 nm from the cell wall although the strain was non-fibrillar.     

变异链球菌葡聚糖结合蛋白B的生物学特性研究进展

变异链球菌是人类龋病的主要致病菌,葡聚糖结合蛋白是其重要的毒力因子之一.葡聚糖结合蛋白B在变异链球菌的致龋、维持细菌形态、发挥细胞壁生理功能等方面有重要作用,同时其N端具有免疫原性,可应用于免疫防龋.下面就葡聚糖结合蛋白B的生物学特性研究进展作一综述.     

Biological functions of glucan‐binding protein B of Streptococcus mutans

Introduction: Streptococcus mutans has been implicated as a major causative agent of dental caries in humans. Bacterial components associated with the adhesion phase of S. mutans include glucosyltransferases, protein antigen C and proteins that bind glucan. At least four glucan‐binding proteins (Gbp) have been identified; GbpA, GbpB, GbpC and GbpD. Methods: In our previous study, the contributions of GbpA and GbpC to the virulence of S. mutans were investigated; however, the biological function of GbpB and its role in the virulence of S. mutans remain to be elucidated. Using a GbpB‐deficient mutant strain (BD1), we demonstrated in the present study that GbpB has a role in the biology of S. mutans. Results: The growth rate of BD1 was lower than that of other strains, while it was also shown to be less susceptible to phagocytosis and to form longer chains than the parental strain MT8148. In addition, electron microscope observations of the cell surfaces of BD1 showed that the cell‐wall layers were obscure. Conclusion: These results suggest that GbpB may have an important role in cell‐wall construction and be involved in cell separation and cell maintenance.