变异链球菌LuxS基因缺陷突变株的构建及其生物膜结构的初步观察研究

目的:通过同源重组法构建变异链球菌LuxS基因缺陷突变菌株,比较其与变异链球菌UA159标准株在生物膜形成上的差异。方法:运用基因同源重组方法将氯霉素抗性基因(Cmr)与LuxS基因上下游区域的2个基因片段按一定顺序重组到PUC载体的多克隆位点中,构建出带氯霉素抗性标志的重组质粒,将载体质粒转化到含完整LuxS基因的变异链球菌UA159中,利用氯霉素抗性筛选出LuxS基因缺陷的突变株,并利用聚合酶链式反应(PCR)和哈氏弧菌发光实验进行检测。以釉质磨片为载体,在扫描电镜下观察上述两菌株含有20 g/L葡萄糖、20 g/L蔗糖的乳酪消化胨酵母(TPY)液体培养基中形成24 h的生物膜。结果:PCR基因扩增结果显示:突变株LuxS基因已被Cmr基因完全替换,成功的构建了变异链球菌LuxS基因突变株,并且突变株不能诱导哈氏弧菌BB170的生物发光。当用葡萄糖作为补充糖源时,变异链球菌UA159标准株和LuxS基因突变株所形成的生物膜表现型未见明显差异;而用蔗糖作为补充糖源时,两菌株所形成的生物膜有明显不同,UA159生物膜相对平滑均质,而LuxS基因突变株生物膜呈松散的蜂房状,基质间有较大的间隙,形成较大的团簇状菌落。结论:成功构建出LuxS基因缺陷的变异链球菌突变株,与变异链球菌UA159标准株其生物膜结构发生改变,提示LuxS会影响变异链球菌生物膜的形成。     

变异链球菌LuxS基因表达载体的构建

目的构建可用于变异链球菌表达系统的含LuxS基因的原核表达载体。方法应用聚合酶链反应(PCR)方法分别从变异链球菌的DNA、载体pEGFP-N1中扩增出LuxS基因的启动子(pLuxS)和绿色荧光蛋白(gfp)基因片段,经回收、纯化后,利用分子克隆技术分别克隆入载体pUC19中。结果通过对重组质粒pUC19-pLuxS-gfp的酶切图谱和DNA序列测定分析证实插入片段序列正确。结论成功构建出原核表达重组质粒pUC 19-pLuxS-gfp为下一步的功能研究奠定了基础。     

大肠杆菌密度感应缺陷株中LuxS的表达及其对生物膜形成的影响

目的：研究在大肠杆菌密度感应缺陷株中表达LuxS蛋白对于生物膜形成相关基因的影响。方法：在大肠杆菌密度感应缺陷株MDA12中表达LuxS蛋白,继而通过Real-time PCR检测菌株间生物膜形成相关基因的表达差异。结果：野生株中生物膜形成相关基因motA、motB表达量约为MDA12的2～5倍,而表达了LuxS蛋白的MDA12中该基因的表达量则为6-8倍,且差异具有统计学意义。结论：大肠杆菌密度感应缺陷株内表达LuxS,可以恢复其密度感应系统继而恢复生物膜形成相关基因的表达。     

LuxS基因缺失对变异链球菌生物学性状的影响

目的:观察LuxS基因突变对变异链球菌生物性状的影响。方法:将变链菌标准株和LuxS突变株分别培养于TSA、TSA-Cmr、BHI培养基培养48 h,通过菌落形态观察、常规生化检测、革兰染色涂片观察和生长曲线,比较两种菌株的生长特性;体外建立LuxS基因突变株和标准株的生物被膜模型,结晶紫染色,观察比较两菌株形成生物被膜的能力。结果:在含氯霉素的TSA-Cmr固体培养基中增塑,标准株基本不能生长,而突变株的生长状况基本正常。在不含氯霉素的TSA固体培养基中培养,两种菌株的菌落形态没有明显差别,革兰染色镜下观察,可见标准株菌体呈长链状排列且相互缠绕,而突变株菌体多呈短链状排列,形成长链的较少。生长曲线观察发现:两菌株在生长模式上基本一致,均呈典型的"S"型曲线,只是在进入生长的稳定期后,两者在细菌饱和度上有一定差异,即11.5～22.5 h之间各时间点标准株的A值均明显高于LuxS突变株(P<0.05)。在BHI培养基中两菌株均能形成生物被膜,但结构存在差异:标准株形成光滑且均匀分布的生物被膜,而突变株的生物被膜形态较粗糙。结论:LuxS基因突变对变异链球菌的生长以及生物被膜形成能力等生物学性状有一定影响。     

变异链球菌LuxS突变株的构建及其耐酸性的测试

目的:把构建好的含有luxS基因两侧同源序列的重组质粒转入变异链球菌进行luxS的敲除以形成luxS突变株,同时测试变异链球菌失去luxS基因后在pH 3.0酸性环境中的生长情况.方法:把含有luxS基因两侧同源序列的重组质粒(pMD-19TUKD)转化入变异链球菌UA159中,利用间源重组,等位基因交换进行luxS基因敲除,再对此突变株进行PCR的检测,利用测试A值、梯度稀释和平板计数法,对变异链球菌luxS突变株和野生型的变异链球菌在pH 3.0酸性环境下生存情况进行比较.结果:成功的构建了变异链球菌luxS的突变株,并且变异链球菌失去luxS基凶后,在酸性环境下的生存能力相对于野生型的变异链球菌低.结论:LuxS基因对变异链球菌的耐酸性起着重要作用.     

变形链球菌LuxS蛋白与LuxS/AI-2群体感应系统的研究进展

口腔环境是一个多菌群共存的环境,变形链球菌是口腔主要致龋菌之一。群体感应使细菌能够感受自身和其他细菌的变化,适应环境,协调菌群之间的生存,已经成为新的药物干扰靶点。与变形链球菌群体感应密切相关的主要是LuxS蛋白和信号分子AI-2,本文从LuxS蛋白的基因、结构、作用机制和功能到LuxS/AI-2群体感应系统的作用作一综述。     

变异链球菌密度感应系统调控变链素的研究进展

密度感应是指细菌根据菌群密度的变化分泌和感应信号分子一感受态调节肽(CSP),调控相关基因的表达.变链素是变异链球菌合成分泌的抗菌性多肽,在菌群中可调节相关细菌的生物学行为.变异链球菌密度感应系统可调控变链素的合成和分泌,参与菌群间的交流,调控牙菌斑生物膜的稳定性.下面就近年来受密度感应系统调控的变链素的研究进展作一综述.     

LuxS基因突变对变形链球菌产酸代谢的影响

目的：研究LuxS基因突变对变形链球菌产酸代谢的影响,以探讨变形链球菌LuxS基因缺陷菌株致龋毒力的变化。方法：采用比浊法测定不同培养条件下变形链球菌LuxS基因缺陷菌株培养液的吸光度A值;同时测定不同培养条件下培养基上清液的pH值。结果：基因缺陷株细菌A值显著低于标准株（P〈0．05）;培养基初始pH〉5．0时,其产酸量小于亲代株,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论：变形链球菌LuxS基因缺陷菌株的产酸代谢能力下降,其致龋力小于亲代菌株。     

口腔链球菌丙酮酸氧化酶基因缺陷型变异株的构建

目的:利用口腔链球菌丙酮酸氧化酶基因(sopox) 的克隆序列,重组构建新的不能产生H2O2 的口腔链球菌变异株。方法:口腔链球菌株ATCC10557 经培养后用酚-氯仿法抽提细菌染色体基因组DNA ,经PCR 扩增sopox 基因,用BamHI 进行限制酶切;参照Chris 方法进行电转化,挑选阳性菌落测定其上清液中H2O2 的含量;将细菌传3～4 代后再次重复上述检测。结果:转化子经筛选后得到1 株阳性菌落,测定上清液中H2O2 含量,第1 次检测表明变异株产生H2O2 的量仅有所下降(介于阳性对照ATCC 10557 和阴性对照大肠杆菌JM109 之间) ,经3～4 次传代后变异株中上清液H2O2 量已经明显低于阴性对照。结论:成功构建了口腔链球菌丙酮酸氧化酶基因缺陷型变异株。     

变异链球菌密度感应信号分子AI-2的研究进展

密度感应是细菌根据菌群密度的变化,分泌和感应特定的信号分子,激活相关基因的表达,从而调节细菌生物学行为的一种机制。目前细菌信号分子自体诱导物Ⅱ(autoinducer 2,AI-2)被认为是细菌通用的信号分子,参与口腔细菌间的交流,调控牙菌斑生物膜的稳定性。本文即对密度感应信号分子AI-2的合成转运及调控作用方面的研究进展作一综述。     

变异链球菌luxS基因对多糖基质代谢的影响

目的:利用变异链球菌luxS基因敲除的突变株,研究该基因缺陷对于生物膜多糖基质的影响。方法:通过向生物膜培养悬液中加入与细菌直径相近的磁性小珠,利用这些小珠由于生物膜约束而在磁场中位移受限的原理,采用生物膜定量分析仪,定量比较luxS突变株与野生株在利用外源性碳水化合物合成生物膜多糖基质能力方面的差异。采用SPSS 10.0软件包对实验数据,进行Dunnet双侧t检验。结果:变异链球菌luxS基因突变株与野生株均可利用碳水化合物合成胞外多糖基质,且外源性糖的加入可显著促进生物膜的形成。在加入1%蔗糖时,2菌株生物膜均在1h内迅速形成,而两者之间无显著差异。在加入1%葡萄糖时,两菌株的生物膜形成速度均有所加快,突变株的改变则更为明显。结论:luxS基因参与调节细菌对多糖基质代谢的过程,而其对于生物膜形成的影响也更多是通过调节多糖基质代谢实现的。     

变形链球菌luxS基因突变对口腔混合细菌生物膜的影响

目的 研究致龋菌变形链球菌luxS基因在口腔细菌混合培养形成牙菌斑生物膜中的作用。方法 将变形链球菌野生株(UA159)及其2种luxS基因突变株（luxS基因高表达株和luxS基因缺陷株）分别与口腔细菌嗜酸乳杆菌（ATCC4356）按照1∶1比例接种于牛心脑浸液培养基,体外混合培养不同时间,包括生物膜形成过程中的初期（4 h）、中期（14 h）、晚期（24 h）,通过MTT法检测混合菌在生物膜形成的量。通过激光共聚焦显微镜观察混合细菌24 h形成的生物膜结构,实时定量PCR检测变形链球菌相关基因（ftf, smu630, brpA, gbpB, gtfB, vicR, comDE和relA）的表达。采用SPSS17.0软件包对数据进行统计学分析。结果 变形链球菌野生株及其2种luxS基因突变株与嗜酸乳杆菌混合培养14 h后,生物膜的量分别为0.481±0.024、0.591±0.023和0.279±0.019;24 h后,混合细菌形成生物膜的量趋势与该时间点一致,变形链球菌高表达株高于野生株,而缺陷株明显降低;但4 h后形成的生物膜组间无显著差异。激光共聚焦显微镜结果表明,高表达株和野生株的集聚程度更高,形成生物膜的结构更加紧密;而缺陷株生物膜菌间结构比较稀疏。以变形链球菌野生株和嗜酸乳杆菌混合形成的生物膜中相关基因的表达为标准,高表达株相关基因的表达均增加,缺陷株表达均降低,且各组间存在显著差异（P<0.05）。结论 变形链球菌luxS基因影响与具核梭杆菌混合培养形成的牙菌斑生物膜,为进一步研究该基因在生物膜中的作用及其调控机制提供了依据。     

变形链球菌luxS基因在硫代谢中的功能研究

目的 采用前期实验已构建成功的luxS基因缺失的变形链球菌突变株,分析luxS基因在口腔变形链球菌的密度感应及硫代谢中的双重作用.方法 在不同硫限定条件培养基(半胱氨酸、蛋氨酸、标准株无菌上清液、S-腺苷高半胱氨酸、S-腺苷甲硫氨酸,空白对照为脑心浸液培养基)中分别对不同培养时间(24、48 h)的变形链球菌标准株和突变株的生长进行吸光度值(A值)的测定与分析,通过激光扫描共聚焦电子显微镜观察测定并比较不同培养条件下两菌株生物膜厚度的差异.结果 在半胱氨酸培养基中培养48 h,突变株生长A值及生物膜厚度均有所增长,分别为(1.301±0.009)和(45.009±0.429)μm,但未及标准株水平(P＜0.05);在蛋氨酸及S-腺苷高半胱氨酸培养基中培养24 h,突变株的生长A值及生物膜厚度与空白对照相比均有所补充,在蛋氨酸培养基中突变株的生长A值及生物膜厚度分别为(0.448±0.028)和(37.068±2.392)μm,在S-腺苷高半胱氨酸培养基中,突变株的生长A值及生物膜厚度分别为(0.460±0.005)和(27.343±1.107)μm,但均未及标准株水平(P＜0.05),48 h时达到标准株水平;在标准株上清液培养基中突变株的生长A值及生物膜厚度均明显增高且超过标准株水平;在S-腺苷甲硫氨酸培养基中两菌株的生长A值及生物膜厚度与空白对照相比均有不同程度的降低.结论 luxS基因在变形链球菌中不但具有密度感应功能,在硫代谢方面也发挥着一定作用.

Abstract：

Objective To investigate the function of luxS in sulfurmetabolism of Streptococcus mutans (Sm). Methods The growth with absorbency(A) of the standards and mutant strains was measured and analyzed in the sulfur-limited defined medium at different periods. The laser scanning confocal microscopy( LSCM ) was used to observe and compare the biofilm thickness of the two kinds of strains at different culture conditions. Results The significant increases in the thickness of mutant strain biofilm and its growth were observed after the addition of cysteine, but did not reach the standards strain levels ( P ＜0. 05). The growth and the biofilm thickness of the mutant strains were ( 1. 301 ±0. 009) and (45.009 ±0. 429) μm. When methionine and S-adenosylhomocysteine of certain concentrations were respectively added, the biofilm thickness and the growth of mutant strain were raised but did not reach the level of the standards strain at 24 h( P ＜0. 05 ), but at 48 h they did. When the methionine was added in the mutant strains for 24 h, the biofilm thickness and the growth of mutant strain were (0. 448 ± 0. 028 ) and ( 37. 068 ± 2. 392 ) μm, as for the adding of S-adenosylhomocysteine were (0. 460 ± 0. 005 ) and ( 27. 343 ±1. 107 ) μm. When adding the supernatant fluid of standard strains, the biofilm thickness and the growth levels of mutant strain were much higher than those of the standards strain. The biofilm thickness and growth of both kinds of strains decreased after the addition of S-adenosylmethionine. Conclusions luxS gene plays not only a role in quorum sensing but also a role in sulfurmetabolism.     

变异链球菌生物膜成熟初期蛋白表达分析

目的探讨变异链球菌生物膜成熟初期可溶性蛋白表达情况。方法采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）技术，分析变异链球菌生物膜成熟初期不同时间点（16、18、20、22、24h）菌体可溶性蛋白的表达情况．并通过光学显微镜观察各时间点菌斑生物膜的形态和结构特征。结果镜下见16h形成的生物膜主要由散在微菌落构成．随时间延长其菌落逐渐变大并与相邻菌落融合（18～22h）．最终相互重叠（24h）。比较5个时间点变异链球菌生物膜中菌体可溶性蛋白未见特异表达的蛋白条带．且相同位置的蛋白条带在蛋白表达量上差异无统计学意义。结论本研究条件下，可观察到变异链球菌菌落从聚集到重叠形成成熟生物膜的过程．16-24h成熟初期变异链球菌生物膜中菌体可溶性蛋白表达差异无统计学意义。     

变异链球菌luxS基因对牙菌斑生物膜形成的影响研究

目的敲除变异链球菌中的luxS基因,构建luxS突变株,测试变异链球菌失去luxS基因后形成牙菌斑生物膜的能力。方法把luxS基因敲除重组质粒转入变异链球菌UA159中,得到转化菌,在含有卡拉霉素的培养基中进行筛选,得到变异链球菌luxS基因突变株,并利用聚合酶链式反应（PCR）和哈氏弧菌发光实验对变异链球菌luxS突变株进行检测,通过扫描电镜,对不同时间段变异链球菌luxS突变株和变异链球菌UA159在BHIS培养液（含1%蔗糖的脑心浸液）和BHIG培养液（含1%葡萄糖的脑心浸液）中形成的生物膜进行比较。结果成功的构建了变异链球菌luxS突变株,在BHIS培养液中,变异链球菌luxS突变株形成生物膜的能力比变异链球菌UA159弱,而在BHIG培养液中,二者无显著差异。结论变异链球菌luxS基因对牙菌斑生物膜的形成有重要的影响,并且luxS基因对变异链球菌生物膜的调控是蔗糖依赖型的。     

LuxS基因缺失对变形链球菌耐酸性的影响

目的:探讨变形链球菌Ingbritt C (血清C型) 国际标准株与LuxS基因缺失的变形链球菌突变株之间耐酸能力的差异.方法:配制相同浓度的变形链球菌标准株与LuxS缺陷株菌悬液,分别在不同pH值(pH3.5～7.0)的BHI液体培养基中培养相同时间后,用紫外分光光度计测定吸光度,比较2 种菌株的生长情况;先在轻度酸性环境(pH5.5)中预酸化,再将2 种菌株于致死性pH值环境(pH3.0)中培养,比较其适应性耐酸能力.结果:①pH值为6.0～7.0时,2 种菌珠在相同pH值条件下生长情况间的差异无显著性(P>0.05), 且3 组不同pH值条件下细菌生长情况间的差异亦无显著性(P>0.05);②pH值为4.5～5.5时,2 种菌株的生长情况的差异有显著性(P<0.05);③在pH值为3.0时,LuxS缺陷株的生存率(0.006 5%)要明显低于标准株的生存率(0.078%),差异有显著性(P<0.05).④在pH值5.5环境下预酸化后,LuxS缺陷株的生存率(0.747%)约为标准株生存率(8.65%)的1/10.结论:在亚致死性pH值中,变形链球菌标准株与LuxS缺陷株的耐酸能力具有差异,标准株的耐酸能力强于LuxS缺陷株,2 种菌株均表现出了适应性耐酸的能力;变形链球菌LuxS缺陷株对酸的敏感性增加,而适应性耐酸能力仍然存在.     

呋喃C-30对变异链球菌生物膜早期形成的影响

目的：探讨密度感应拮抗剂呋喃C-30对变异链球菌生物膜早期形成的影响。方法：将体外合成的密度感应拮抗剂呋喃C-30按终浓度10、100μmol/L分别配制于含变异链球菌的牛心脑浸液培养基,37℃微需氧培养24h,形成生物膜后,用生物膜定量分析仪检测生物膜形成的量。结果：100μmol/L呋喃C-30组变异链球菌生物膜的形成受到显著抑制,磁珠成像开始减弱和完全消失的时间均迟于对照组;生物膜开始形成后,其生物膜形成指数低于对照组,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论：呋喃C-30在100μmol/L浓度时能有效抑制变异链球菌生物膜的形成,其应用可能为龋病防治提供新的思路。