沙眼衣原体热休克蛋白60抗原基因的克隆和表达

目的：对沙眼衣原体热休克蛋白60（Chsp60）进行表达和纯化，以获得高纯度的蛋白抗原。方法：应用PCR扩增技术分离Chsp60的基因全长，采用基因工程的方法，应用融合表达载体重组、克隆得到Chsp60特异抗原基因的重组菌株，经诱导表达获得重组融合蛋白，并经亲和层析获得纯品。结果：得到了热休克蛋白60重组克隆菌株，成功地诱导表达并纯化了相对分子质量为87000的融合蛋白，纯度达90％以上，产量为2．5mg/L。结论：获得的相对分子质量为60000的特异性抗原可用于检测衣原体感染患者血清中的抗体，有助于探讨Chsp60在免疫发病中的作用。     

沙眼衣原体热休克蛋白60基因的克隆和表达

目的 探讨克隆和表达沙眼衣原体热休克蛋白60(hsp60)基因.方法 PCR分离扩增hsp60的基因片段,纯化后双酶切,克隆到原核表达载体pET-28a,构建重组表达载体pET-28a-hsp60.PCR、双酶切及测序鉴定.转染大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE、Western印迹检测.结果 PCR与双酶切结果显示所构建的重组质粒已成功地克隆hsp60基因,测序结果与基因库公布的一致.SDS-PAGE检测表达产物.在相对分子量60 000处有表达条带.Western印迹鉴定是表达目的蛋白.纯化后纯度达90%以上,产量为17.85 mg/L.结论 构建pET-28a-hsp60重组体并成功表达可溶性hsp60蛋白.     

沙眼衣原体质粒编码蛋白3的致病性及免疫保护性研究

目的 探索沙眼衣原体（CT）质粒编码蛋白3(Pgp3)的致病性及免疫保护性。方法 CT L2构建株（GFP）、野生株（WT）和质粒缺失株（PF）分别感染Hela细胞,蛋白质免疫印迹法（Western blotting）和间接免疫荧光法（IFA）检测Pgp3蛋白表达水平;L2 GFP、WT和PF菌株经阴道分别感染C3H小鼠,感染后不同时间点经IFA评估生殖道包涵体形成单位（IFU）数量;组氨酸标记的Pgp3(His-Pgp3)体外刺激人输卵管上皮细胞,24 h后经Hoechst 33 528染色和流式细胞术检测细胞凋亡情况;L2 WT体外感染L929和L929-Pgp3细胞,在感染后30、60及80 h固定细胞并计算IFU和细胞核数量。L2 GFP和WT菌株经阴道分别感染C3H小鼠,50 d后各组均以L2 WT菌株攻毒,攻毒后不同时间点评估生殖道IFU数量。结果 L2 GFP Pgp3蛋白表达水平高于L2 WT,L2 PF无Pgp3蛋白表达;小鼠感染后第3、7、10和14天,L2 GFP感染组IFU数量显著高于L2 WT和L2 PF感染组,且L2 GFP组感染周期最长;Pgp3体外干预组...     

E型沙眼衣原体重组主要外膜蛋白诱导出的小鼠免疫效应

目的 检验自行研制的E型沙眼衣原体重组主要外膜蛋白(rMOMP)诱导小鼠产生的特异性免疫应答效应.方法 3～4周清洁级BALB/C雌鼠36只,分为佐剂组、单独组和对照组,每组12只.佐剂组采用纯化的rMOMP 50 μg和等体积的弗氏佐剂、单独组单用纯化的rMOMP 50μg、对照组单用PBS200μL,于第0、2、4周分别双侧股四头肌进行免疫.ELISA法检测小鼠血清中沙眼衣原体特异性IgG抗体以及阴道冲洗液中沙眼衣原体特异性sIgA抗体,ELISA法检测细胞因子IFN-γ,MTT法检测小鼠脾淋巴细胞特异性增殖反应;同源攻击后阴道宫颈脱落细胞沙眼衣原体培养,观察小鼠的迟发型超敏反应以及小鼠的血清抗体中和试验.结果 佐剂组小鼠血清沙眼衣原体特异性IgG抗体A_(405)值为0.641±0.059,淋巴细胞增殖指数5.085±1.291,迟发型超敏反应右足足垫增厚0.324 ±0.054 mm.单独组小鼠血清特异性IgG抗体A_(405)值为0.424±0.015,淋巴细胞增殖指数3.123±0.840,迟发型超敏反应右足足垫增厚0.272±0.064mm.佐剂组各项指标的检测结果都高于单独组(P<0.05)和对照组(P<0.01).结论 沙眼衣原体rMOMP能刺激机体产生有效的特异性体液和细胞免疫.     

沙眼衣原体主要外膜蛋白在大肠杆菌中的表达与鉴定

目的 克隆沙眼衣原体主要外膜蛋白(MOMP)基因,构建原核表达重组载体,并通过E.coli BL21实现MOMP的融合表达.方法 用PCR法扩增MOMP基因,克隆插入到pUCm-T载体中,序列测定正确后,将其亚克隆到原核表达载体pET-22b(+)中,采用Ni-NTA亲和层析法纯化表达产物,对表达产物进行SDS-PAGE和蛋白质印迹鉴定.结果 PCR扩增出约1200bpDNA片段,序列测定证实与基因库登陆的D型沙眼衣原体一致;表达产物的相对分子质量为47000,与预期分子质量相符,蛋白印迹证实表达产物为特异性蛋白.结论 沙眼衣原体MOMP基因可以在大肠杆菌中得到表达,其表达产物能与相应的抗体结合,为沙眼衣原体核酸疫苗的研究奠定了基础.     

沙眼衣原体多形外膜蛋白PmpI的原核表达、纯化、抗体制备及鉴定

目的：克隆、表达沙眼衣原体多形外膜蛋白I（PmpI）基因,并进行免疫原性鉴定,分析其生物学特征。方法用生物信息软件分析沙眼衣原体多形外膜蛋白PmpI的基因序列并预测PmpI蛋白的B细胞抗原表位。以D型沙眼衣原体DNA为模板,PCR扩增PmpI基因N端90~1464碱基序列,构建原核载体进行诱导表达。Ni离子亲合层析柱纯化重组蛋白,制备PmpI多克隆抗体并用Western印迹法检测其免疫原性。结果对蛋白质的二级结构和柔性区、氨基酸的亲水性、抗原指数和表面可及性预测结果综合分析,推测该蛋白含有8个优势B细胞表位。PCR扩增D型沙眼衣原体PmpI基因核苷酸序列长度为1375 bp。成功构建pET28a?PmpI原核表达重组体,经诱导表达、亲和层析纯化后获得了相对分子质量为50000的重组蛋白并制备其多克隆抗体。结论成功克隆并表达了D型沙眼衣原体多形外膜蛋白N?PmpI,为研究该蛋白的生物学功能奠定了一定基础。     

鼠肺炎沙眼衣原体质粒蛋白pgp5的克隆表达鉴定及免疫原性分析

目的获取鼠肺炎沙眼衣原体(Chlamydia muridarum)质粒蛋白pgp5的基因及纯化的蛋白并鉴定其免疫原性。方法设计引物,PCR扩增目的基因,将其定向插入到原核表达载体pET28a中,然后将重组质粒转化入大肠杆菌E.coli DH5α中,并用PCR扩增及序列测定等方法对重组质粒进行鉴定。再将重组质粒转化入感受肽Rosetta(DE3)并诱导表达,用镍柱纯化pgp5-his融合蛋白。用纯化后的目的蛋白免疫新西兰家兔,酶联免疫吸附试验(ELISA)测定抗体效价,Western blot、细胞免疫荧光方法检测抗体与pgp5蛋白的结合。结果所获得的pgp5基因片段经测序长度为795 bp,检索确认其序列与GeneBank一致。十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹实验均显示获得相对分子质量约29 000的纯化蛋白。ELISA检测多克隆抗体效价达1∶100 000。细胞免疫荧光检测结果显示抗体可与体外培养的鼠肺炎沙眼衣原体特异性结合。结论成功表达pgp5-his融合蛋白,并制备了高效价、高特异性的抗pgp5抗体,为进一步研究奠定了基础。     

衣原体噬菌体phiCPG1衣壳蛋白Vp1对豚鼠结膜炎衣原体及E型沙眼衣原体的抑制作用

目的 探讨豚鼠结膜炎衣原体（GPIC）噬菌体衣壳蛋白Vp1对GPIC及E型沙眼衣原体的抑制作用,为沙眼衣原体感染的治疗提供新的思路。 方法 用Vp1-pET30a（+）重组质粒菌表达Vp1蛋白,Western印迹法鉴定蛋白,透析袋纯化蛋白,BCA法测定蛋白浓度,将GPIC、E型沙眼衣原体分别与Vp1蛋白、Tris甘氨酸溶液、S蛋白及培养液室温孵育3 h,衣原体培养过程中分别 加入相同浓度的上述液体,72 h或48 h后,免疫荧光计数包涵体数。 结果 GPIC在Vp1蛋白组、Tris甘氨酸溶液组、S蛋白组及培养液组培养72 h,包涵体计数分别为5.0 ± 1.5、24 ± 1.2、25 ± 1.7及25 ± 1.5,各组包涵体数比较,差异有统计学意义（F = 476.632,P < 0.05）。Vp1蛋白组GPIC包涵体数显著低于Tris甘氨酸溶液组、S蛋白组及培养液组（P < 0.05）,而后3组之间差异无统计学意义（P > 0.05）。与阴性对照组（培养液组）相比,Vp1蛋白对GPIC的抑制率为（80.2 ± 3.99）%。此外,Vp1蛋白对E型沙眼衣原体的抑制率为（77.2 ± 1.79）%,t检验示Vp1对GPIC的作用与对E型沙眼衣原体的作用差异无统计学意义（t = 2.057,P > 0.05）。 结论 Vp1蛋白可明显抑制GPIC的感染,同时对E型沙眼衣原体有相似的抑制作用。     

沙眼衣原体多形外膜蛋白PmpG的克隆、表达、纯化及鉴定

目的 克隆、表达、纯化E型沙眼衣原体多形外膜蛋白（PmpG）,并鉴定其免疫原性。方法 用PCR技术扩增从E型沙眼衣原体中提取的PmpG基因片段,再将其定向插入到原核表达载体PET30a（+）中,构建重组表达质粒,将其转化入E.coli DH5α中,并用酶切分析、PCR扩增及基因序列测定等对重组质粒进行鉴定,诱导表达后用SDS-PAGE及Western印迹进行鉴定,然后进行蛋白纯化,并免疫BALB/c小鼠鉴定其免疫原性。结果 PCR扩增出约1092 bp DNA片段,序列测定证实与基因库的E型沙眼衣原体一致;表达产物的相对分子质量为55 000,与预期分子量相符,Western印迹证实表达产物为特异性蛋白,纯化后的蛋白免疫小鼠获得抗原特异性抗体。结论 构建的PmpG原核表达载体在大肠杆菌中得到了表达,且具有免疫原性。     

沙眼衣原体E型MOMP基因原核表达载体的构建和纯化

目的:构建沙眼衣原体E型主要外膜蛋白(MOMP)基因的原核表达载体,并在大肠杆菌(BL-21)中融合表达,为沙眼衣原体疫苗的研究提供材料。方法:用PCR技术扩增E型沙眼衣原体MOMP基因片段,再将其定位插入到原核表达载体pGEX中,构建重组表达质粒。然后将重组表达质粒转化入大肠杆菌(BL-21)中,并用酶切分析、PCR扩增及部分序列测定等方法对重组质粒进行了鉴定。然后诱导表达,用SDS-PAGE及蛋白印迹进行鉴定,然后进行蛋白纯化。结果:PCR扩增出约1202bp DNA片段,序列测定证实与GenBank登陆的E型沙眼衣原体一致;表达产物的相对分子量为66KD,与预期分子量相符,蛋白印迹证实表达产物为特异性蛋白,并纯化获得大量蛋白。结论:成功的构建了原核表达载体pGEX/MOMP,在大肠杆菌中得到了表达,并得到了纯化后的蛋白。     

白介素2基因佐剂对沙眼衣原体E型DNA疫苗的免疫增效作用

目的 探讨小鼠白介素2重组质粒对沙眼衣原体E型DNA疫苗细胞免疫效果的影响。方法 以BALB/c小鼠为实验动物,采用肌内接种免疫的方式,将小鼠分为接种空质粒的阴性对照组、DNA疫苗免疫组、DNA疫苗联合小鼠白介素2重组质粒免疫组和接种灭活沙眼衣原体 E型原体的阳性对照组,观察小鼠后足垫局部的肿胀情况、脾淋巴细胞增殖试验、血清IL-4和IFN-γ水平和同型沙眼衣原体生殖道攻击后局部的衣原体培养情况。结果 4组实验动物的脾淋巴细胞增殖指数分别为1.37 ± 0.21、2.52 ± 0.30、3.64 ± 0.41、3.77 ± 0.34,联合免疫组和阳性对照组比较差异无统计学意义,与另2组比较,差异有统计学意义。4组的血清IL-4分别为（25.37 ± 18.93）、（24.75 ± 8.49）、（21.74 ± 6.43）、（38.49 ± 12.24） pg/ml,灭活原体组高于其他各组;4个组的血清IFN-γ分别为（310.8 ± 160.7） pg/ml、（601.3 ± 357.9） pg/ml、（1923.3 ± 518.1） pg/ml、（2712.5 ± 887.2）pg/ml,联合免疫组和阳性对照组相当,与另两组比较,差异有统计学意义。沙眼衣原体E型原体攻击后,空质粒组小鼠生殖道局部能够培养出衣原体;另3个组衣原体培养阴性。 结论 白介素2基因佐剂能够增强沙眼衣原体E型DNA疫苗的细胞免疫效应,且以Th1型反应为主。     

广州地区沙眼衣原体omp1基因分型及突变研究

目的 探讨不同omp1基因型沙眼衣原体（Ct）在广州地区非淋菌性尿道（宫颈）炎患者中的分布情况。方法 从性病和妇科门诊及外展现场采集男性尿道和女性宫颈拭子,提取Ct基因组DNA为模板,巢式PCR扩增Ct omp1基因VD1 ~ VD3并测序分型,分析Ct型别决定簇VD1 ~ VD2区域的氨基酸突变情况。结果 共检测1208份拭子,检出Ct 132株,对其中130株进行测序分型,共发现10个omp1基因型,分别为E型38株（29.23%）、D型25株（19.23%）、J型24株（18.46%）、F型21株（16.15%）、G型7株（5.38%）、H型5株（3.85%）、K型5株（3.85%）、B型、Ja型各2株（各1.54%）、I型1株（0.77%）;可见E、D、J、F 4个型别为主要感染型别,共占83%。序列分析发现,D、B、K 3个型别在VD1 ~ VD2区域的氨基酸存在突变。另有2例为混合感染未能确定型别。结论 广州地区Ct omp1基因型别感染以E、D、J、 F 4种型别为主,共占83%,Ct B型也发现于男性尿道和女性宫颈。     

Analysis of rectal Chlamydia trachomatis serovar distribution including L2 (lymphogranuloma venereum) at the Erasmus MC STI clinic, Rotterdam

OBJECTIVES: Compared to urogenital infections, little is known of serovar distribution in rectal chlamydial infection. The aim of this study was to explore possible relations between demographics, sexual behaviour, clinical manifestations, rectal symptoms, and chlamydial serovars including L2 (lymphogranuloma venereum). METHODS: Genotyping was done prospectively in all rectal chlamydial infections since the outbreak of proctitis caused by lymphogranuloma venereum in February 2003. 33 (15.1%) rectal Chlamydia trachomatis infections from the years 2001 and 2002 were genotyped retrospectively. RESULTS: Of all 219 rectal chlamydial infections, detected in the period July 2001 to August 2005, a total of 149 (68.0%) were successfully genotyped including 21 (14.1%) infections with serovar L2. In univariable and multivariable analyses, L2 serovar positive patients were significantly more often HIV positive (p = 0.002; OR: 6.5; 95% CI: 2.0 to 21.1), and had had sex in the past 6 months with more partners compared to other serovars. Furthermore, patients with L2 proctitis presented far more often with self reported rectal symptoms (p<0.005; OR: 19.4; 95% CI: 4.9 to 77.0) and clinical manifestations (p<0.005; OR: 15.4; 95% CI: 4.5 to 52.5). CONCLUSIONS: Chlamydial infections with serovar L2 show a different clinical and epidemiological pattern compared to serovar D-K. LGV proctitis is significantly associated with HIV positivity and a high number of sexual partners and causes more rectal symptoms and clinical manifestations. Neither young age nor ethnicity were identified as risk factors for any of the serovars investigated in this study.     

两种沙眼衣原体检测方法在男性不同人群中的应用与评价

目的:评价QuichVue沙眼衣原体快速检测试剂与Roche Amplicor衣原体PCR酶联检测试剂在男性不同人群中的应用。方法:采用病例对照研究,收集98例性病门诊非淋菌性尿道炎(NGU)病人9、3例性病门诊有非婚性行为但无尿道炎的就诊者及98例健康体检者三组人群的尿道拭子,分别用QuichVue和Amplicor Ct Test进行沙眼衣原体的检测。结果:NGU组QuichVue和Amplicor Ct Test沙眼衣原体的检出率分别为36.73%(36/98)和56.12%(55/98),两者检测阳性率间的差异有显著性(P<0.01);如以Roche PCR为金标准,QuichVue的敏感性和特异性分别为57.14%和90.48%。门诊对照组两种方法的检出率分别为12.15%(13/93)和9.67%(9/93),差异无显著性;QuichVue的敏感性和特异性分别为33.33%和88.1%。健康体检者QuichVue阳性率为7.14%(7/98),PCR阳性率为2.04%(2/98),两者间差异无显著性;QuichVue的敏感性为50.00%、特异性为93.75%。结论:QuichVue快速检测可用于有尿道炎症状的病人的沙眼衣原体检测,不宜用于低感染率人群的筛查。     

Screening for Chlamydia trachomatis: a systematic review of the economic evaluations and modelling

OBJECTIVE: To review systematically and critically, evidence used to derive estimates of costs and cost effectiveness of chlamydia screening. METHODS: Systematic review. A search of 11 electronic bibliographic databases from the earliest date available to August 2004 using keywords including chlamydia, pelvic inflammatory disease, economic evaluation, and cost. We included studies of chlamydia screening in males and/or females over 14 years, including studies of diagnostic tests, contact tracing, and treatment as part of a screening programme. Outcomes included cases of chlamydia identified and major outcomes averted. We assessed methodological quality and the modelling approach used. RESULTS: Of 713 identified papers we included 57 formal economic evaluations and two cost studies. Most studies found chlamydia screening to be cost effective, partner notification to be an effective adjunct, and testing with nucleic acid amplification tests, and treatment with azithromycin to be cost effective. Methodological problems limited the validity of these findings: most studies used static models that are inappropriate for infectious diseases; restricted outcomes were used as a basis for policy recommendations; and high estimates of the probability of chlamydia associated complications might have overestimated cost effectiveness. Two high quality dynamic modelling studies found opportunistic screening to be cost effective but poor reporting or uncertainty about complication rates make interpretation difficult. CONCLUSION: The inappropriate use of static models to study interventions to prevent a communicable disease means that uncertainty remains about whether chlamydia screening programmes are cost effective or not. The results of this review can be used by health service managers in the allocation of resources, and health economists and other researchers who are considering further research in this area.