小鼠骨髓间充质干细胞对胚胎干细胞造血分化的影响

骨髓间充质干细胞作为骨髓基质细胞的前体细胞 ,在体外具有一定的造血支持作用 ,与造血干细胞共移植可促进其植入。本研究旨在初步探讨应用小鼠骨髓间充质干细胞与胚胎干细胞共培养作为一种新的分化体系的可行性。首先分离、培养并鉴定小鼠骨髓间充质干细胞 ,然后利用扩增培养的骨髓间充质干细胞与胚胎干细胞共培养 ,通过造血集落培养和RT PCR观察造血分化的特点。结果表明 ,分离、扩增培养至第四代之后的骨髓间充质干细胞形态均一 ,高表达Sca 1,CD2 9,CD4 4和CD10 5 ,而CD34和CD4 5等造血与内皮细胞特异性表面标志呈阴性 ;特异性诱导体系内传代后 (>4代 )的骨髓间充质干细胞可向脂肪细胞和成骨细胞分化。与悬浮分化体系相比 ,骨髓间充质干细胞共培养体系中初始分化的胚胎干细胞含有显著增加的拟胚体形成细胞而没有造血集落形成细胞。此外 ,RT PCR检测发现 :共培养细胞表达胚胎干细胞特异性转录因子Oct 4 ,而造血标记Flk 1,GATA 1和 β H1为阴性。结论 :间充质干细胞在一定程度上抑制了胚胎干细胞的初始分化 ,但是共培养体系来源的拟胚体产生造血集落的能力显著高于悬浮体系     

抑制Ras信号通路可减弱小鼠胚胎干细胞的造血分化

为了探讨Ras信号通路对小鼠胚胎干细胞（Embryonic Stem cells,ES cells）造血分化的影响,将突变型基因RasN17转染小鼠ES细胞,免疫印迹检测RasN17的表达对Erk1/2及Akt磷酸化的作用,应用半定量RT-PCR检测ES细胞在分化过程中与造血相关的基因的表达。结果表明：RasN17的表达能抑制Erk1/2和Akt的磷酸化,携带RasN17基因的ES细胞在分化过程中Runx1、SCL及beta-major珠蛋白等基因的表达被显著抑制,而FLK1的表达不受影响。结论：ES细胞体外造血分化需要Ras通路的活化。     

胚胎期造血干细胞来源及其调控

胚胎干细胞是体内各种组织包括造血组织干细胞的来源,在胚胎干细胞向造血干细胞的分化及造血干细胞自身的发育过程中有着复杂的基因调控。原始造血产生于卵黄囊已被普遍认可,但永久造血产生于何处仍有争论。目前认为,至少有两个独立的部位与永久造血有关,即卵黄囊和胚内的ＰＡＳ／ＡＧＭ区。对胚胎期造血及其调控的研究不仅有助于探明某些血液病的发病机制,而且在基因治疗和造血干细胞工程方面也将具有重大作用。     

人胎盘造血干/祖细胞的增殖分化能力

近年来有研究表明，人胎盘组织富含造血干细胞，而且其CD34^＋CD38^-、CD34^＋CD38^＋造血干／祖细胞（HSPC）的百分率明显高于脐血。但有关人胎盘组织CD34^＋HSPC亚群的增殖分化能力的研究却未见报道。我们采用免疫磁珠分选人胎盘组织CD34^＋CD38^-和CD34^＋CD38^＋HSPC亚群，并用不同培养体系进行血细胞集落培养，以评价其增殖分化能力。     

C57BL/6小鼠来源的胚胎干细胞建系及体外定向造血分化的研究

哺乳动物的胚胎造血表现为时间和空间的连续变化。既往研究表明，129小鼠来源的胚胎干细胞系（em-bryonic stem cells，ES细胞）的体外分化能在一定程度上模拟胚胎造血。为研究C57BL/6小鼠来源的ES细胞系体外定向造血细胞分化的特点，分离C57BL/6小鼠3.5天囊胚的内细胞团建立ES细胞系并采用常规方法鉴定，应用体外二步分化法形成拟胚体并进行集落培养，细胞化学染色和RT-PCR鉴定造血前体细胞。结果表明：所建ES细胞系MES-1符合建系标准，其体外分化后可在不同阶段的拟胚体中发现多种造血前体细胞的有序出现，包括原始红系前体细胞，永久红系前体细胞，混合集落形成细胞和粒单系集落形成细胞。RT-PCR分析显示，拟胚体表达多种造血特异性的转录因子和造血标记。结论：自C57BL/6小鼠建立的ES细胞系MES-1体外定向造血细胞分化在一定程度上能模拟胚胎造血。     

拮抗TGF-β1可抑制胚胎干细胞来源BL-CFC的产生和分化

胚胎干细胞来源的BL-CFC体外可分化产生造血和内皮细胞。为了研究TGF-β1对BL-CFC产生和分化的调控作用,在拟胚体培养阶段施加TGF-β1和TGF-β1中和抗体,观察不同阶段TGF-β1对BL-CFC的数目及其定向内皮和造血细胞分化能力的影响。结果表明：在拟胚体培养阶段拮抗TGF-β1的作用可显著降低BL-CFC的数量（P〈0.01）;与之吻合的,中和TGF-β1后拟胚体中Flk-1＋细胞比例降低。此外,在拟胚体培养阶段加入TGF-β1可显著增强BL-CFC的造血和内皮细胞分化能力,而中和TGF-β1后分化能力降低。结论：TGF-β1对BL-CFC的产生和分化发挥正向调节作用。     

小鼠高增殖潜能混合巨核细胞集落的鉴别

小鼠高增殖潜能混合巨核细胞集落的鉴别万海英，韩忠朝，阮长耿巨核细胞和血小板的生成过程是极其复杂的。在人类或小鼠的巨核细胞培养时已可识别三组巨核祖细胞，包括混合细胞集落（ｍＣＦＵ－ＭＫ）；爆式细胞集落（ＢＦＵ－ＭＫ）及集落形成单位（ＣＦＵ－ＭＫ）［Ｉｎ...     

碱性成纤维细胞生长因子对胚胎干细胞来源集落形成细胞的作用

背景:有研究表明,在卵黄囊造血、胎肝造血和在胚胎干细胞向造血干细胞分化过程中,碱性成纤维细胞生长因子可强烈表达.目的:在拟胚体培养阶段施加碱性成纤维细胞生长因子,验证碱性成纤维细胞生长因子对集落形成细胞产生的调控作用.方法:购买小鼠胚胎干细胞D3细胞系,取第3～5代小鼠原代胚胎成纤维细胞,加入新配制含丝裂霉素C的DMEM生长培养基孵育2.5 h,使饲养层细胞失去增殖能力;加入胰酶消化适度,离心后制成单细胞悬液,以10×104/cm2的密度种至用明胶包被的培养瓶中,放入孵箱内培养24 h之后使用.复苏胚胎干细胞D3细胞并将其接种于饲养层细胞之上.在拟胚体培养阶段按培养基成分不同分为2组:对照组(标准培养基+血管内皮生长因子+干细胞因子组)、实验组(标准培养基+血管内皮生长因子+干细胞因子+碱性成纤维细胞生长因子组).各组于培养3,6d时分别计数克隆形成数,通过免疫荧光法检测Flk-1+细胞表达情况,并用IMAGE-PRO PLUS图像分析系统统计阳件细胞数及平均吸光度值.结果与结论:与对照组比较,在拟胚体培养阶段加入碱性成纤维细胞生长因子可显著增加集落形成细胞的数量(P＜0.01),Flk-1阳性细胞数及平均吸光度值也显著增加(P＜0.01).证明碱性成纤维细胞生长因子能够有效地促进胚胎体的扩增以及成血管血液干细胞的产生与增殖.     

胚胎干细胞研究进展

胚胎干细胞（embryonic stem cells．ESCs）是由动物或人囊胚的内细胞团（inner cell mass，ICM）或原始生殖细胞（primordial germ cells，PGCs）分离出来，经体外分化抑制培养筛选出的具有全能性的胚胎细胞。经适当的因子诱导，ESCs可以分化成一种或多种细胞类型。自1981年英国剑桥大学的Evans和Kaufman等用不同的方法成功地分离、建立了小鼠ESCs系以来．历经将近20年，第一株人ESCs系在美国威斯康星大学成功建立。同一年．     

人胚胎干细胞HuES17向造血干细胞的分化

背景:人类胚胎干细胞是来源于着床前囊胚的内细胞团,能在长期培养中无限增殖并保持未分化状态,且具有分化成人体组织各种细胞类型能力的细胞。目的:进一步验证人胚胎干细胞HuES17细胞株向造血干细胞分化的能力。方法:人胚胎干细胞HuES17采用与人包皮成纤维细胞二维共培养的方式培养,采用人胚胎干细胞与小鼠骨髓基质细胞(OP9)二维共培养的方法诱导胚胎干细胞向造血干细胞分化。结果与结论:人胚胎干细胞与小鼠骨髓基质细胞(OP9)二维共培养诱导造血分化的第四五天即开始出现OP9细胞逐渐老化,很快死亡;可以观察到人胚胎干细胞分化,然而,随着OP9细胞死亡,分化的人胚胎干细胞亦死亡,不能诱导人胚胎干细胞向造血干细胞分化。提示人胚胎干细胞HuES17细胞株可能不能向造血干细胞分化,或向造血干细胞分化的能力较低。     

人类胚胎干细胞向造血细胞和内皮细胞诱导分化的初步研究

胚胎干(ES)细胞是一种能够自我更新、长期增殖并且具有多向分化潜能的干细胞。近年来的研究表明，小鼠胚胎干细胞体外分化能够模拟体内造血发育的过程。为探讨诱导人类胚胎干细胞向造血细胞和内皮细胞的分化的方法．将人类胚胎干细胞去饲养层，形成拟胚体(EB)培养3天后消化；采用基质细胞条件培养基联合细胞因子的诱导体系。诱导8天后，种植到半固体培养基中培养7—14天。应用RT—PCR检测诱导细胞flk-1、BMI-1、scl、Zeta—globin造血相关基因的表达；流式细胞术检测KDR、CD34等造血细胞表面抗原的表达；免疫组织化学检测集落细胞的表面标记。结果表明：①半固体培养基中出现20—30个细胞组成的集落，集落细胞再种植仍然能够形成大小相似的细胞集落；另外一些较大的细胞集落中CIM5细胞呈阳性．．②部分细胞贴壁生长形成内皮细胞样集落，Ⅷ因子、KDR、UEA检测均为阳性．．③在ES细胞内有少量flk-1、BMI-1表达，而scl、Zeta—globin基因不表达；自发分化3天的EB可见flk-1、BMI-1表达上调；消化形成单细胞并诱导4天，检测到flk-1、BMI-1、scl、Zeta—globin基因的表达。第8天仍然检测到flk-1、BMI-1、scl基因的表达，Zeta—globin基因不表达。④诱导8天的细胞中表达flk-1阳性细胞的率为9．8％．CD34阳性细胞占总细胞量的16．8％，对照组ES细胞阳性率分别为0．04％和0．16％；EB自发分化阳性率分别为0．36％和1．16％。结论：采用基质细胞条件培养基联合细胞因子的培养体系，可诱导人类胚胎干细胞向造血细胞及内皮细胞分化。     

骨髓移植造血重建过程中干／祖细胞增殖特性的研究

为了探讨骨髓移植造血重建过程中干/祖细胞增殖的特性,我们采用病理形态学、BMNC计数、抗5-FU BMNC计数、外源性CFU-S(12)和骨髓连续移植等方法,对造血重建过程不同阶段的干/祖细胞增殖特性,进行了动态的对比研究。实验结果表明,在移植后第3天,骨髓内可见少数淋巴样细胞呈小灶性分布,第5—9天细胞灶迅速扩大,细胞形态表现为淋巴样细胞,至第11天才出现不同阶段的分化细胞;第5—9天BMNC数和抗5-FU BMNC数迅速增加,随后增殖速度明显减缓;第9天骨髓的CFU-S(12)数和重建长期造血的能力高于第5天和21天的骨髓。本实验结果提示,骨髓移植后造血细胞呈小灶性分布,重建造血初期造血干/祖细胞迅速增殖而无明显分化表现,此阶段骨髓细胞的重建长期造血能力增强,提示造血干细胞有扩增。     

不同的胞外基质对人胚胎干细胞分化为造血祖细胞的影响简

本研究建立人胚胎干细胞分化为造血细胞的新诱导体系,并探讨不同的胞外基质对产生造血祖细胞的影响.选择3种胞外基质——matrigel、纤维黏连蛋白（fibronectin）和Ⅳ型胶原蛋白（collagen Ⅳ）包被培养板,采用直接贴壁培养的诱导方法,分步添加造血生长因子诱导人胚胎干细胞向造血祖细胞分化,用造血集落形成试验检测集落形成细胞数,流式细胞术以及实时定量PCR方法检测造血特异性标志物的表达,比较这3种胞外基质对生成造血祖细胞的差异.结果表明,诱导14 d时Ⅳ型胶原蛋白组形成造血集落形成细胞数目、产生CD34阳性细胞数以及造血特异性基因SCL和CD34的表达量均明显高于matrigel和纤维黏连蛋白两组（P＜0.05）.结论：人胚胎干细胞在胞外基质上直接贴壁诱导能有效地分化为造血祖细胞,且Ⅳ型胶原蛋白更有利于向造血系的分化.     

红细胞生成素基因修饰的间充质干细胞条件培养基促进人胚胎干细胞向造血细胞分化

本研究探讨EPO基因修饰的间充质干细胞条件培养液对人胚胎干细胞向造血细胞诱导分化的影响。通过重组慢病毒系统感染人间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC）,建立能够稳定高效表达红细胞生成素（erythropoietin,EPO）的细胞株EPO／MSC。用EB培养液诱导人胚胎干细胞形成拟胚体,然后用EPO／MSC条件培养液处理拟胚体细胞;通过免疫荧光、集落形成实验和RT—PCR检测等方法对诱导的细胞进行了相关鉴定。结果表明：EPO／MSC体外能够稳定表达EPO。条件培养液诱导生成的细胞表达造血干／祖细胞抗原CD34和相关造血基因,可产生不同的造血集落,且明显高于对照组。结论：EPO基因修饰的间充质干细胞条件培养液能显著促进人胚胎干细胞向造血细胞分化。     

胚胎干细胞的研究进展

胚胎干细胞（ESC）是来源于哺乳动物早期胚胎的内细胞团中的一种二倍体细胞,具有发育的全能性。ESC的体内和体外分化在分子水平有许多相似之处。在现有培养条件下。小鼠ESC体外分化的细胞类型或结构主要有4种：内皮细胞与血管,肌细胞和心肌、造血细胞和神经细胞,最近的研究提示;造血干细胞（HSC）来源于胚胎内的特定区域,HSC的产生可能受尚未发现的胚胎生长因子调节。ESC为从胚胎着手明确早期造血过程提供了方便有效的实验途径。人ESC的研究及应用尚面临一系列伦理问题,对ESC的研究具有广阔的应用前景。     

体外诱导人类诱导性多能干细胞分化为造血干 / 祖细胞的研究简

本研究探讨体外诱导人诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cell,iPSC）分化为造血干/祖细胞的能力.在体外用小鼠骨髓基质细胞OP9与人类iPSC共培养的方法,将iPSC诱导分化为造血干/祖细胞;用流式细胞术检测造血干/祖细胞表面标志物的表达水平;用实时定量PCR检测分化过程中iPSC及造血干/祖细胞的相关基因mRNA表达水平的变化;用免疫磁珠法分离CD34＋造血干/祖细胞并进行半固体集落形成实验检测细胞的集落形成能力.结果表明,iPSC与OP9细胞共培养诱导造血分化的第4天即可观察到iPSC形态变化;流式细胞术检测显示,分化得到的细胞表达已知的造血干/祖细胞相关表面标志物CD34和CD43分子.在体外分化过程中多能性的标志基因Oct4的表达逐渐下降,造血相关转录因子Gata-2的表达逐渐升高,而Runx-1的表达量则呈波浪式变化,CD34表达量逐渐升高.集落培养14 d能够得到红系集落（CFU-E）,粒系集落（CFU-G）,巨核系集落（CFU-M）,粒-巨核系集落（CFU-GM）和混合系集落（CFU-GEMM）.结论：iPSC细胞能够在体外通过与OP9细胞共培养分化为造血干/祖细胞.     

骨髓内皮细胞条件培养液促进小鼠胚胎干细胞向造血分化

为观察骨髓内皮细胞条件培养液(BECM)和(或)细胞因子(VEGF SCF EPO)对小鼠胚胎干细胞(ESC-D3细胞)生成造血干／祖细胞的促进作用，先将ESC-D3细胞形成4天胚状体(Day 4 embryoid body,4dEB)，再诱导4dEBs生成造血干／祖细胞。实验分4组，第1，2和3组分别为BECM VEGF SCF EPO，BECM和VEGF SCF EPO组，第4组为自发分化对照组。检测各组造血干／祖细胞特异抗原、造血转录因子表达以及造血集落的形成。结果显示，BBCM和(或)细胞因子诱导生成的细胞均表达造血干／祖细胞抗原(c-kit,Sca-1,Thy-1和CD34)和造血转录因子(c—myb，SCL和β-H1)基因mRNA，培养后可产生HPP-CFC和BFU-E。从诱导ESC-D3细胞生成造血干／祖细胞的数量和生成的集落总数看，BBCM联合细胞因子组诱导效率均显高于单用组和对照组。结论：骨髓内皮细胞条件培养液能显促进胚胎干细胞早期造血分化，且骨髓内皮细胞条件培养液与细胞因子联合时效果更强。     

端粒／端粒酶系统与人类造血细胞

人类造血细胞与大多数体细胞一样,其端粒也随着细胞的每次分裂而不断丧失,因此不同发育阶段的造血细胞以及不同分化阶段的造血细胞其端粒的平均长度是不同的,并显示出相应不同的增殖和分化潜能与支持造血能力。端粒酶虽然在某种程度上能延缓造血干细胞自身端粒缩短的速度,但决不能完全阻止其丢失,并且正常造血细胞与恶性血液肿瘤细胞的端粒长度及其端粒酶活性也存在着明显的差异。这些发现为更深入地探讨正常造血细胞增殖、分化、成熟和凋亡的调控机制以及恶性血液肿瘤的发病机理、诊断和治疗的新策略研完提供了重要的理论依据。