儿童急性ITP Th1/Th2细胞功能状态初步研究

目的探讨急性儿童特发性血小板减少性紫癜(ITP)Th1/Th2细胞功能状态及其在ITP免疫发病机制中的作用。方法采用流式细胞术胞内标记法检测外周血CD4+T细胞IL-4和IFN-γ阳性表达率;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及荧光定量PCR检测外周血CD4+T细胞中IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-13、T-bet、GATA-3、SOCS-1、SOCS-3和TIM-3等Th相关的细胞因子及转录因子mRNA表达。结果①急性ITP患儿Th1细胞阳性率明显低于正常同年龄对照组(3.36%±1.25%vs12.71%±2.29%,P<0.01),Th2细胞比例明显升高(2.63%±1.35%vs0.46%±0.17%,P<0.01),Th1/Th2比值显著降低(1.45±0.57vs34.13±5.76,P<0.01);②急性ITP患儿GATA-3、SOCS-3mRNA表达明显增高,T-bet及SOCS-5表达与同年龄对照组无显著差异(P>0.05),TIM-3表达明显增高(P<0.01);③急性ITP患儿CD4+T细胞高表达Th2类细胞因子IL-4、IL-5、IL-13(P<0.01),Th1类细胞因子IFN-γ与正常对照比较无显著性差异(P>0.05)。结论急性ITP患儿Th2细胞过度活化,可能与ITP免疫功能紊乱有关。     

儿童自身免疫性甲状腺疾病Th1/Th2细胞极化偏移的研究

目的 从T淋巴细胞分化的多环节观察儿童自身免疫性甲状腺疾病Graves病(GD)和桥本甲状腺炎(HT)Th1/Th2类细胞的极化偏移方向,探讨其免疫学发病机制.方法 采用ELISA和RT-PCR法同步检测GD(46例)和HT(64例)患儿的转录因子、细胞因子以及游离CD30(sCD30)水平,另设24例健康体检儿为对照组.结果 GD、HT患儿外周血单个核细胞(PBMC)转录因子GATA-3的表达较正常组明显降低,T-bet、T-bet/GATA-3比值明显升高.GD、HT患儿PBMC产生IFN-γ水平和IFN-γ/IL-4比值较正常组明显增加,而IL-4水平明显减少.GD、HT患儿sCD30水平高于正常对照组.结论 GD及HT患儿的前体T细胞具有向Th1分化发育的趋向.     

急性特发性血小板减少性紫癜儿童T-bet和GATA3的表达

目的：通过分析急性特发性血小板减少性紫癜（ITP）儿童血中转录因子T-bet和GATA3 mRNA的表达及细胞因子IFN-γ和IL-4的含量,探讨急性ITP发病机制中Th1/Th2细胞分化的趋势及其与转录因子的关系。方法：利用RT-PCR技术,测定急性TIP患儿发作期（n=30）和缓解期（n=28）外周血中T-bet和GATA3 mRNA 的表达,并使用ELISA法检测血浆IFN-γ和IL-4含量。20例健康儿童作为对照组。结果：ITP患儿发作期血中T-bet mRNA表达和IFN-γ含量明显高于缓解期和对照组（P＜0.01）。发作期血中GATA3 mRNA表达和IL-4的含量明显低于缓解期和对照组（P＜0.01）。结论：儿童急性ITP存在明显的Th1优势分化现象,且可能与转录因子T-bet和GATA3的调控作用有关。［中国当代儿科杂志,2010,12（1）：29-31］     

转录因子T-bet和GATA-3对婴幼儿喘息性支气管炎的免疫调控作用

目的探讨转录因子T-bet和GATA-3对小儿喘息性支气管炎的免疫调控作用。方法对32例喘息性支气管炎(喘支组)和30例正常儿童(对照组)抽取抗凝静脉血5 mL,Ficoll分离外周血淋巴细胞,以终质量浓度为100 mg/L的植物血凝素(PHA)刺激48 h,采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测培养上清液干扰素-γ(IFN-γ)和白细胞介素-4(IL-4)水平,用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测淋巴细胞T-bet、GATA-3的mRNA表达水平。结果喘支组淋巴细胞培养上清液IFN-γ水平[(528±164)ng/L]低于对照组[(870±203)ng/L](P<0.05),而IL-4水平[(106±29)ng/L]明显高于对照组[(47±15)ng/L](P<0.01);喘支组和对照组淋巴细胞T-bet mRNA水平分别为(0.11±0.03)(、0.17±0.03),GATA-3 mRNA分别为(0.54±0.09)、(0.41±0.07),提示喘支组T-bet mRNA表达较对照组减少(P<0.05),而GATA-3 mRNA明显高于对照组(P<0.01);喘支组IFN-γ水平与T-bet mRNA表达I、L-4与GATA-3 mRNA表达均呈正相关(r=0.57,0.60 P均<0.01);IFN-γ与IL-4水平、T-bet mRNA与GATA-3 mRNA表达均呈负相关(r=-0.38,-0.46 P均<0.05)。结论1.喘支组患儿淋巴细胞合成IL-4水平增高,IFN-γ减少,存在以Th2细胞过度分化为特征的T辅助细胞分化失衡。2.喘支组患儿T细胞分化失衡受到核转录因子T-bet和GATA-3的调控,T-bet表达减少可能是一重要因素。     

转录因子T-bet、GATA-3在过敏性紫癜患儿发病机制中的作用

目的 探讨转录因子T-bet和GATA-3在过敏性紫癜(HSP)患儿发病机制中的作用.方法 本院儿科2009年2月-2010年2月收治急性期HSP患儿46例(HSP组)以及健康对照儿童30例(健康对照组).采用SYBR Green I实时荧光定量PCR方法检测其外周血单个核细胞T-bet mRNA、GATA-3 mRNA的表达.应用Luminex-100液相芯片技术检测其血浆细胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ水平.结果 HSP组患儿外周血单个核细胞T-bet mRNA相对表达水平(53.98±35.79)低于健康对照组(181.56±96.90)(P＜0.001).GATA-3 mRNA相对表达水平(964.30±655.18)高于健康对照组(78.09±57.20)(P ＜0.001).HSP组血浆细胞因子IL-2[( 16.54±7.38) ng?L-1],IFN-γ[(11.31±8.02) ng?L-1]的表达显著低于健康对照组[(35.73±22.66) ng?L-1,(30.67±21.29) ng?L-1](P＜0.001,0.05),IL-4[(74.66±26.15) ng.L-1]的表达高于健康对照组[(51.81±27.76) ng?L-1].IFN-γ水平与T-bet mRNA表达呈正相关(r=0.882,P＜0.01);IL4水平与GATA-3 mRNA的表达呈正相关(r=0.886,P＜0.01).结论 HSP患儿急性期存在Th1/Th2失衡,主要表现为Th2优势活化,该失衡与其特异性转录因子T-bet mRNA表达降低、GATA-3 mRNA 表达增高有关,本研究为阐明Th1/Th2失衡的分子机制之一提供了实验依据.     

哮喘缓解期患儿Th1/Th2相关上游转录因子及细胞因子的表达

目的从基因和蛋白质水平了解哮喘缓解期患儿T辅助淋巴细胞(Th)免疫平衡状况。方法选取24例哮喘缓解期和12例健康儿童作为对照,采用酶联免疫吸附法(ELISA)和实时荧光定量PCR(real time PCR)法分别测定外周血细胞因子干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素-4(IL-4)水平及外周血单个核细胞(PBMC)中特异性转录因子T-bet、GATA-3表达情况。结果病例组血浆IL-4水平(37.14±12.77)ng/L显著高于对照组(27.08±6.12)ng/L,t=2.467 P<0.05;病例组PBMC中GATA-3的表达强度(5.45±1.11)较对照组(4.70±0.86)显著增高(t=2.049 P<0.05);病例组与对照组比较IFN-γ/IL-4及T-bet/GATA-3比率均显著降低(t=-2.208,-4.212 P<0.05,P<0.01)。结论哮喘缓解期患儿体内存在基因和蛋白质水平Th1/Th2平衡的紊乱,以Th2亚群亢进为主。     

儿童过敏性哮喘尘螨特异性免疫治疗中干扰素-γ白介素4 T-bet和GATA-3 mRNA表达变化的研究

目的 探讨在过敏性哮喘尘螨特异性免疫治疗(SIT)过程中,与TH1/TH2细胞分化相关的干扰素-γ(IFN-γ)、白介素4(IL-4)、T-het和GATA-3 mRNA在外周血单个核细胞(PBMCs)中表达的变化.方法 根据进行抗原特异性免疫治疗(SIT)的时间,采集郑州大学第一附属医院儿科门诊2007年11月至2008年9月收治的过敏性哮喘惠儿36例,对其SIT治疗前、治疗16周后和治疗1年后的外周静脉血分离外周血单个核细胞,提取总RNA,逆转录成cDNA,利用SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR的方法检测每组中IFN-γ、IL-4、T-bet和GATA-3mRNA表达情况.同时,观察患儿治疗前后的临床疗效.结果 随着SIT治疗的进行,患儿临床症状明显减轻,外周血中在mRNA表达水平IFN-γ/IL-4和T-bet/GATA-3的比值逐渐升高.结论 哮喘患儿特异性免疫治疗有效;治疗后TH1/TH2细胞的失衡得到一定的纠正;T-bet和GATA-3转录因子在哮喘的发生和SIT治疗中起重要作用.     

急性特发性血小板减少性紫癜患儿T细胞亚群、NK细胞及IFN-γ、IL-4变化的探讨

目的通过检测急性特发性血小板减少性紫癜(ITP)患儿T细胞亚群、NK细胞、IFN-γ、IL-4,探讨急性ITP患儿的发病机制。方法采用流式细胞仪检测32例急性ITP患儿及20例对照儿童外周血T细胞亚群、NK细胞比例,采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验定量方法检测两组儿童外周血IFN-γ、IL-4水平,并采用t检验和直线相关分析进行比较分析。结果急性ITP患儿CD3+、CD4+、CD4+/CD8+细胞水平均明显低于对照组(P值均<0.001),CD8+细胞水平明显高于对照组(P<0.001);NK细胞水平与对照组比较差异无显著性(P>0.05);血清IFN-γ水平明显高于对照组(P<0.01),IL-4水平明显低于对照组(P<0.01);CD4+、CD8+细胞百分比的改变与血小板计数无明显相关性(P>0.05),IFN-γ与IL-4水平呈明显负相关(P<0.001)。结论急性ITP患儿存在T淋巴细胞亚群失衡,同时存在细胞因子紊乱,可能是Th1优势疾病,NK细胞与儿童急性ITP发病机制的关系尚不明确。     

特发性血小板减少性紫癜患儿Th1／Th2细胞因子水平及其临床意义

目的研究血清IL-4、IFN-γ水平异常在急慢性特发性血小板减少性紫癜(ITP)发病机制及治疗选择中的意义。方法应用ELISA方法检测30例急性ITP患儿、30例慢性ITP患儿病程中各期IL-4、IFN-γ水平,以正常同龄体检儿童作对照进行统计学分析;调查急、慢性ITP患儿起病的诱发因素、对治疗的反应及疾病转归。结果①急性ITP患儿血清IL-4水平明显高于对照组(P<0.01),而IFN-γ水平则明显低于对照组(P<0.01)。②急性ITP转化为慢性ITP者,初测血清IFN-γ水平明显高于对照组和其他慢性ITP组(P<0.01),而IL-4水平轻度升高,其中难治性ITP者初测IFN-γ水平更高,IL-4水平与对照组比较差异无统计学意义。③慢性ITP患儿血清IL-4水平轻度升高(P<0.05),IFN-γ水平明显降低,(P<0.01)。④对于慢性ITP低IFN-γ水平者,选择IFN-α可获满意疗效。结论儿童急慢性ITP初始发病时存在不同的免疫异常机制;急性ITP中高IFN-γ和IL-4无明显变化是预后不良因素之一;对于慢性ITP及难治性ITP血清IL-4和IFN-γ水平监测可作为选择治疗方案的参数。     

特发性血小板减少性紫癜患儿Thl/Th2细胞因子水平及其临床意义

目的 研究血清IL-4、IFN-γ水平异常在急慢性特发性血小板减少性紫瘢(ITP)发病机制及治疗选择中的意义.方法 应用ELISA方法检测30例急性ITP患儿、30例慢性ITP患儿病程中各期IL-4、IFN-γ水平,以正常同龄体检儿童作对照进行统计学分析;调查急、慢性ITP患儿起病的诱发因素、对治疗的反应及疾病转归.结果 ①急性111P患儿血清IL-4水平明显高于对照组(P＜0.01),而IFN-γ水平则明显低于对照组(P＜0.01).②急性ITP转化为慢性ITP者,初测血清IFN-y水平明显高于对照组和其他慢性ITP组(P＜0.01),而IL-4水平轻度升高,其中难治性IYP者初测IFN-γ水平更高,IL-4水平与对照组比较差异无统计学意义.③慢性ITP患儿血清IL-4水平轻度升高(P＜0.05),IFN-γ水平明显降低,(P＜0.01).④对于慢性ITP低IFN-γ水平者,选择IFN-α可获满意疗效.结论 儿童急慢性ITP初始发病时存在不同的免疫异常机制;急性ITP中高IFN-γ和IL-4无明显变化是预后不良因素之一;对于慢性ITP及难治性ITP血清IL-4和IFN-γ水平监测可作为选择治疗方案的参数.     

巨细胞病毒感染对调节性T细胞和Ⅰ型、Ⅱ型辅助性T细胞分化增殖的影响

目的定量检测巨细胞病毒（murine cytomegalovirus,MCMV）感染小鼠脾细胞调节性T细胞（Treg）、辅助性T细胞1型和2型（Th1/Th2）特异性转录因子Foxp3、T-bet和GATA-3mRNA水平的动态变化,探讨MCMV在急慢性感染期对Treg、Th1和Th2细胞分化增殖的影响及其意义。方法建立MCMV全身播散型感染模型,根据主要脏器内病毒滴度,确定感染后28d为本模型急、慢性期界定点。42只模型鼠分别于接种病毒后第1、3、7、14、28、45、60天各处死6只小鼠,分离脾细胞,以灭活MCMV抗原为刺激原,体外培养5d,另设42只正常小鼠作为模拟感染对照。用Real-timeRT-PCR法检测小鼠脾细胞Foxp3、T-bet和GATA-3mRNA表达强度。结果MCMV感染组第7天T-betmRNA表达显著增高达峰值,与模拟感染对照组比较差异有统计学意义（P〈0.01）,随后下降,到第28天降到对照组相当水平,至第60天显著低于对照组（P〈0.01）;而GATA-3mRNA在感染后第3天表达开始升高,第7天达峰值,第14天开始缓慢下降,但至第60天仍显著高于对照组（P〈0.05）;Foxp3mRNA表达在感染后14天明显低于对照组,第28天显著降低（P〈0.01）,但至第45天开始明显上调,第60天升高更显著（P〈0.01）。结论在感染急性期,Treg未被诱导活化,宿主产生有效Th1/Th2应答反应,但随后逐渐下降,并向Th2偏移;在感染慢性期,Treg细胞增殖活化显著,进一步抑制Th1和Th2反应,且对Th1抑制效应更强,提示CMV诱导Treg细胞增殖活化是其抑制宿主抗病毒免疫而呈持续慢性感染的重要原因。     

急性期川崎病γ干扰素组蛋白乙酰化改变及意义初探

目的探讨急性期川崎病(KD)患儿IFN-γ组蛋白乙酰化改变及其在KD免疫发病机制中的作用。方法以2015年2月至2016年6月深圳市儿童医院诊断并住院治疗的KD患儿为KD组,经IVIG治疗后为KD-IVIG组,KD组依冠状动脉有无损伤分为冠状动脉损伤(KD-CAL+)亚组和无冠状动脉损伤(KD-CAL-)亚组,于IVIG治疗前、后取血备检;同期体检的健康儿童为对照组。采用染色质免疫共沉淀法检测外周血CD4+T细胞IFN-γ组蛋白H3乙酰化水平及组蛋白乙酰化酶p300和去乙酰化酶HDAC1/2结合水平;流式细胞术检测外周血CD4+IFN-γ+细胞(Th1)比例及IFN-γ、p STAT4、p STAT5和T-bet蛋白表达水平;实时荧光定量PCR检测CD4+T细胞IFN-γ、IL-2Rα/β、IL-12Rβ1/2、IL-18Rα/β和ITLR4m RNA表达;ELISA检测外周血浆中IL-12、IL-2和IL-18浓度。结果 1KD患儿38例(男20例),年龄1~5.2岁;KD-CAL+亚组16例,KD-CAL-亚组22例。对照组32例(男17例),年龄1.2~4.9岁。KD组和对照组年龄、性别差异无统计学意义。2急性期KD患儿Th1细胞比例、IFN-γm RNA和蛋白表达及其组蛋白乙酰化水平显著高于对照组(P0.05),且KDCAL+亚组高于KD-CAL-亚组(P0.05),经IVIG治疗后明显恢复(P0.05)。3急性期KD患儿CD4+T细胞IFN-γ组蛋白乙酰化酶p300结合水平显著增加(P0.05),HDAC1/2结合水平明显降低(P0.05),p300/HDAC1/2明显高于对照组且与IFN-γ组蛋白H3乙酰化水平呈正相关(r=0.52;P0.05),经IVIG治疗后均有所恢复(P0.05)。其中KD-CAL+亚组p300结合水平及p300/HDAC1/2比值均高于KD-CAL-亚组(P0.05),而HDAC1/2结合水平则低于后者(P0.05)。4急性期KD患儿血浆IL-2、IL-12和IL-18浓度显著增高(P0.05),CD4+T细胞表面受体IL-2Rα/β、IL-12Rβ1/2、IL-18Rα/β和TLR4及其下游信号分子p STAT5、p STAT4、T-bet和My D88表达明显上调(P0.05),且KD-CAL+亚组前述各项均高于KDCAL-亚组(P0.05),经IVIG治疗后均有不同程度恢复(P0.05)。结论 IFN-γ组蛋白过度乙酰化可能是导致急性期KD患儿免疫功能紊乱的重要因素之一。     

急性特发性血小板减少性紫癜患儿外周血淋巴细胞PPAR-γ mRNA表达变化及其与血浆IL-13的相关性

目的：PPAR-γ与免疫细胞分化、凋亡、增殖和细胞因子分泌调控均密切相关,该实验旨在研究急性特发性血小板减少性紫癜(ITP)患儿外周血淋巴细胞PPAR-γ mRNA表达变化及其与血浆IL-13的相关性。方法：序贯收集2007年9月至2008年7月符合试验入选标准的急性ITP患儿53例,同时收集相匹配的同期体检儿童50例作为对照。RT-PCR法检测ITP患儿外周血淋巴细胞PPAR-γ mRNA的表达,ELISA 法检测血浆中IL-13水平。结果：急性ITP患儿外周血淋巴细胞PPAR-γ mRNA表达显著高于正常对照组［（0.78±0.03） vs （0.52±0.05）,P<0.05］;急性ITP患儿血浆中IL-13的含量显著高于正常对照组［(160.21±34.26)pg/mL vs (121.42±12.69)pg/mL,P<0.05］。急性ITP患儿血浆中的IL-13含量与外周血淋巴细胞PPAR-γ mRNA表达变化呈正相关(r=0.89,P<0.05)。结论：急性ITP患儿外周血淋巴细胞PPAR-γ mRNA表达上升,并与IL-13水平呈正相关,PPAR-γ与IL-13可能均参与了急性ITP的发病过程。［中国当代儿科杂志,2009,11（5）：367-370］     

哮喘儿童细胞因子信号转导抑制因子mRNA表达与Th1/Th2的关系

目的：细胞因子信号转导抑制因子(SOCS)对JAK-STAT途径的细胞因子如白介素、干扰素等的调节起重要作用,目前SOCS与哮喘的关系仍在研究中。本研究观察SOCS1和SOCS3 mRNA在哮喘儿童外周血单个核细胞（PBMC）中的表达水平与CD4+ T细胞IFN-γ/IL-4平衡及特异性IgE（sIgE）的关系。方法：采集44例4~14岁过敏性哮喘患儿及30例健康儿童PBMC,分别用流式细胞仪分析CD4+ T细胞IFN-γ/IL-4比值,另提取总RNA,采用SYBR Green I逆转录荧光定量PCR的方法检测每组SOCS1和SOCS3 mRNA的表达。结果：哮喘组患儿外周血IFN-γ阳性的CD4+T细胞百分比［（15.7±2.0）%］及IFN-γ/IL-4比值（3.4±1.5）均低于对照组［分别为（19.1±2.7)%、4.8±2.9］;而SOCS1 mRNA（⊿Ct值11.1±1.9）表达显著高于对照组（⊿Ct值12.6±2.8）。两组儿童SOCS1 mRNA表达均与外周血分泌IFN-γ的CD4+ T细胞百分比呈负相关（P<0.05）。SOCS1和SOCS3与sIgE均无相关性。结论：SOCS1 mRNA在哮喘组患儿外周血中高表达,并与Th2占优势的免疫失衡有关。     

白细胞介素6/STAT3信号活化在急性免疫性血小板减少性紫癜患儿辅助性T淋巴细胞17/调节性T淋巴细胞失衡中的作用

目的探讨IL-6/STAT3信号活化在儿童急性免疫性血小板减少性紫癜(ITP)辅助性T淋巴细胞17(Th17)/调节性T淋巴细胞(Treg)失衡中的作用。方法选择急性ITP患儿30例,同年龄健康对照组30例。ELISA法检测其血浆IL-6水平;荧光定量PCR检测CD4+T淋巴细胞RORγt mRNA、FOXP3 mRNA、细胞因子信号转导抑制因子(SOCS)1 mRNA、SOCS3 mRNA表达;流式细胞术检测其外周血CD4+CD25+FOXP3+T淋巴细胞、CD4+IL-17A+T淋巴细胞比例及CD4+T淋巴细胞磷酸化STAT3(pSTAT3)蛋白平均荧光强度(MFI);甲基化特异性定量PCR检测CD4+T淋巴细胞SOCS1基因外显子2、SOCS3基因5’端非翻译区(5’-UTR)3个可能的STAT3结合位点CpG岛甲基化水平。结果 1.与健康对照组比较,ITP组患儿CD4+IL-17A+T淋巴细胞比例及RORγt mRNA表达水平显著上调(Pa<0.05),CD4+CD25+FOXP3+T淋巴细胞比例及FOXP3 mRNA表达显著降低(Pa<0.05),Th17/Treg比值明显升高(P<0.05);2.与健康对照组比较,ITP组患儿IL-6表达水平显著上调(P<0.05),且pSTAT3 MFI值亦明显增高(P<0.05);3.与健康对照组比较,ITP组患儿CD4+T淋巴细胞SOCS1和SOCS3 mRNA水平显著增加(Pa<0.05),与其Th17/Treg比值均呈负相关(r=-0.63、-0.70,Pa<0.05);健康对照组SOCS1基因外显子2、SOCS3基因5’-UTR区第3个STAT3结合位点的CpG岛完全去甲基化,急性ITP患儿呈低甲基化状态(Pa<0.05),其去甲基化水平与表达呈正相关(r=0.76、0.65,Pa<0.05)。各组SOCS3基因5’-UTR区第1、2个STAT3结合位点CpG岛均处于完全去甲基化状态(Pa>0.05)。结论 SOCS1和SOCS3基因低甲基化所致IL-6/STAT3信号异常活化可能是急性ITP患者Th17/Treg细胞失衡的因素之一。