hBMP-2转染自体兔骨髓基质细胞附和异体兔脱钙骨基质的成骨实验研究

目的　探讨人骨发生蛋白 2 (hBMP - 2 )转染兔自体骨髓基质细胞 (rMSCs)的骨生成诱导作用以及附和异体兔脱钙骨基质 (DBM )后的成骨效能。方法　取兔自体骨髓基质细胞培养扩增 ,用脂质体介导的方法转染人骨发生蛋白 2基因 ,将转染和未转染人骨发生蛋白 2基因的自体骨髓基质细胞附和于异体兔脱钙骨基质形成新的生物植骨材料 ,连同空白及单纯脱钙骨基质对照组植入兔前肢肌袋和桡骨缺损。 2、 4、 6、 8周分别取材进行大体、放射线和病理观察。结果　肌袋试验 6周后 ,转染人骨发生蛋白 2基因的自体骨髓基质细胞附和异体兔脱钙骨基质材料中出现骨组织细胞 ,未转染组和单纯异体兔脱钙骨基质组为纤维组织。骨缺损试验中 ,三组均能产生骨的形成和缺损的修复 ,但仍然是转染复合材料组的骨修复再生能力最大。结论　局部应用hBMP - 2基因转染的rMSCs-DBM材料可以诱导骨形成促进骨修复     

腺病毒介导BMP-2和EGFP基因转染兔骨髓基质干细胞及种植脱钙骨的体外观察

目的用腺病毒载体介导人骨形态发生蛋白-2及EGFP基因转染兔骨髓基质干细胞(rBMSC),种植DBM(脱钙骨)支架体外构建组织工程骨。方法兔髓基质干细胞(rBMSC)的分离、培养;流式细胞仪检测细胞表面标记;转染后,荧光显微镜观察细胞最适感染复数(MOI)及蛋白印迹检测外源基因的表达情况;采用Urist提供的方法制备脱钙骨(DBM),用细胞计量法测定BMSCs与DBM复合培养的黏附率。然后将转染后细胞接种到DBM支架上,用荧光显微镜观察细胞是否成功粘附于支架材料上,扫描电镜观察细胞贴附、生长状况。结果 BMSCs细胞表型鉴定:CD44表达阳性,CD45表达阴性;转染后,蛋白印迹试验检测到BMP-2表达增高;骨髓间充质干细胞与脱钙骨基质的平均粘附率为(72.74±1.99)%;扫描电镜见转染细胞生长良好,伸出丝状突起,相互连接。结论成功培养及鉴定兔BMSCs,Ad-BMP-2/EGFP可高效转染兔BMSCs,转染后的细胞种植于DBM支架材料后生长状况良好,组织工程骨构建成功。     

人骨形态发生蛋白2重组腺病毒载体的构建及其生物学活性检测

目的构建人骨形态发生蛋白2(hBMP-2)重组腺病毒载体(Ad-hBMP-2),并检测其转染后的骨髓基质细胞hBMP-2表达以及成骨能力的改变。方法采用Cre-lox重组方法构建含有hBMP-2基因的复制缺陷型重组腺病毒,并利用原位杂交和免疫组化手段观察转染后的骨髓基质细胞hBMP-2mRNA和蛋白表达情况;通过Ⅰ型胶原原位杂交、碱性磷酸酶测定、透射电镜观察以及裸鼠肌袋试验评价Ad-hBMP-2转染对兔骨髓基质细胞成骨能力的影响。结果病毒培养上清液的聚合酶链式反应证实构建的重组腺病毒含有Ad-hBMP-2基因,重组腺病毒滴度达3·8×1010pfu/L;感染增殖率为100的Ad-hBMP-2转染兔骨髓基质细胞24h和48h后即可分别检测到显著的hBMP-2mRNA和蛋白表达,转染效率几乎达100%;Ad-hBMP-2转染可以明显刺激兔骨髓基质细胞Ⅰ型胶原mRNA表达、碱性磷酸酶分泌、细胞内蛋白质合成以及异位骨形成等。结论Ad-hBMP-2具有高效转染能力,并能够诱导骨髓基质细胞向成骨细胞转化,进而促进骨形成。     

重组PcDNA3.1-hBMP-2转染骨髓基质干细胞及复合异种骨支架体外构建组织工程骨

目的：构建人骨形态发生蛋白-2(human bone morphogenetic protein,，hBMP-2)真核表达载体PcDNA3．1-hBMP-2，转染兔骨髓基质干细胞(bane marrow stromal cells，BMSCs)，种植去抗原牛松质骨(bovine cancellous bone，BCB)支架体外构建组织工程骨。方法：蛋白印迹法检测转染后细胞BMP-2的表达，碱性磷酸酶(ALPase)活性检测分析基因转染对细胞分化的影响。然后将转染后细胞接种到BCB支架上，扫描电镜观察细胞贴附、生长状况。结果：转染后，BMSCs表达BMP-2，ALP活性明显增高。扫描电镜见转染细胞分布均匀，伸展良好。结论：在脂质体介导下，BMP-2基因可导入细胞且稳定表达基因产物促进自身增殖分化，转染后细胞在支架材料上贴附生长良好，为进一步应用携带BMP-2基因的人工骨修复骨缺损奠定了实验基础。     

hBMP-7基因转染修复骨缺损的实验研究

目的：探讨利用人骨形态发生蛋白7(hBMP-7)基因转染骨髓基质干细胞(BMSc)构建组织工程化骨组织并修复兔桡骨骨缺损的可行性。方法：制备含hBMP-7真核细胞表达载体的逆转录病毒液PT-PLNCX2-hBMP-7并转染BMSc．使用免疫组织化学的方法检测hBMP-7在BMSc中的表达。兔挠骨1.5cm骨缺损修复实验分为4组：转染组，未转染组，单纯PLLA组和对照组．每组6个样本。分别于术后3周，6周采用大体观察，X线、组织学检测、免疫组织化学检测等方法对骨缺损修复情况进行对比。结果：免疫组织化学检测显示经PT-PLNCX2-hBMP-7病毒液转染的BMSc中有较强的阳性结果出现。定量检测分析结果证实经转染的BMSc修复骨缺损的成骨速度和成骨量均优于未转染组，单纯PLLA组和对照组中均未见骨缺损得到修复。结论：hBMP-7基因转染能够提高BMSc形成组织工程化骨组织和修复骨缺损的能力，可用于BMSc为种子细胞的组织工程化骨组织的构建。     

转基因骨髓间质干细胞在组织工程承载体中生长及成骨转化的研究

[目的]观察经携带人骨形态发生蛋白-2(BMP-2)基因的复制缺陷重组腺病毒(Ad-BMP-2)转染的兔骨髓间质干细胞(MSCs)在以兔脱细胞脱钙骨基质作为组织工程承载体中的生长情况及转基因前后细胞成骨能力的变化。[方法]用携带有人BMP-2基因片段的复制缺陷重组腺病毒(Ad-BMP-2)转染兔骨髓间质干细胞并将其种植在兔脱细胞脱钙骨基质支架中,扫描电镜观察转基因细胞在支架中的黏附生长情况;并通过检测培养上清中的碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(BGP)含量及Ⅰ型胶原(CollagenⅠ)的分泌量来评估转基因对MSCs成骨能力的影响。[结果]转基因骨髓间质干细胞在组织工程支架中黏附生长良好,转基因组细胞的ALP、BGP含量及Ⅰ型胶原的分泌量与对照组比较差异有显著性意义。[结论]转基因骨髓间质干细胞在兔脱细胞脱钙骨基质支架中能很好的黏附并立体生长,转基因细胞在目的基因所表达的BMP-2蛋白作用下成骨能力明显增强。     

人骨形态发生蛋白-2基因转染兔骨髓基质干细胞及其表达

目的探讨含有人骨形态发生蛋白-2(hBMP-2)cDNA的真核表达载体在兔骨髓基质干细胞(MSCs)中的转录及表达情况,为进一步进行多基因转染MSCs复合纳米仿生骨治疗骨缺损实验提供材料。方法用电穿孔方法将真核表达载体pIRES2-EGFP-hBMP2转染至兔MSCs中,荧光显微镜及流式细胞学检查观察转染效果、检测转染效率,定量RT-PCR方法观察hBMP-2cDNA在兔MSCs中的转录情况,免疫组织化学及westernblot方法检测hBMP-2蛋白表达情况,ALP活性定量测定检测hBMP-2蛋白功能。结果电穿孔方法将重组质粒转染至兔MSCs中,荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达,流式细胞仪检测转染效率为(42.7±2.1)%,转染24h后定量RT-PCR方法检测到hBMP-2cDNA在兔MSCs中的转录片断,免疫组织化学观察到hBMP-2蛋白呈强阳性表达,westernblot方法可见18KDhBMP-2蛋白条带,转染组细胞ALP活性明显提高(P>0.05)。结论pIRES2-EGFP-hBMP2通过电穿孔方法导入兔MSCs,并在其中有效表达,发挥生物学作用。     

hBMP-2基因转染兔骨髓间充质干细胞的表达及生物学效应的观察

目的:观察人骨形态发生蛋白-2(humanbonemorphogeneticprotein-2,hBMP-2)基因转染兔骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs)后的表达及表达产物对BMSCs增殖和向成骨细胞分化的影响。方法:利用腺病毒表达载体Adeno-XTM将hBMP-2基因转染兔BMSCs,用免疫组化染色。检测细胞内BMP-2的表达。然后通过MTT法分析其对细胞增殖的影响,并分别通过体外检测Ⅰ型胶原合成和表达情况、碱性磷酸酶染色和钙结节VonKossa染色,观察腺病毒介导hBMP-2基因转染兔BMSCs的成骨分化能力。结果:转基因细胞6周时仍能表达外源性基因。基因表达产物hBMP-2能明显促进BMSCs的增殖以及I型胶原的合成,转染后第14天碱性磷酸酶染色多数细胞为阳性,第21天出现钙结节。结论:hBMP-2基因转染BMSCs后可获得稳定表达,且基因表达产物能促进BMSCs增殖,并诱导其向成骨细胞分化。     

慢病毒介导hBMP-2转染BMSCs复合脱钙松质骨修复兔股骨缺损的实验研究

目的研究慢病毒介导人骨形态发生蛋白(Human bone morphogenetic protein,hBMP-2)转染骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells,BMSCs)植入脱钙松质骨后对兔股骨大段缺损的修复作用。方法体外对兔BMSCs分离、培养、传代及表型鉴定后,采用慢病毒介导hBMP-2转染兔BMSCs,然后采用Western Blot法检测hBMP-2基因的表达情况。兔股骨大段缺损模型制造成功后随机分为4组(n=6),A组左侧股骨大段缺损区单纯行钢板螺钉内固定;B、C、D组左侧股骨大段缺损区行钢板螺钉内固定后分别植入脱钙松质骨、BMSCs复合脱钙松质骨、慢病毒介导hBMP-2转染BMSCs复合脱钙松质骨。结果慢病毒介导hBMP2转染后的BMSCs细胞内hBMP-2基因能持续高效表达目的蛋白。术后12周X线片显示,A、B、C组骨缺损修复未完成,D组左股骨缺损区骨痂开始塑形,骨缺损消失,髓腔再通,骨缺损修复完成。内固定取出后进行三维CT检查,A、B、C组左侧股骨缺损处再次发生骨折,D组并未再次发生骨折。结论慢病毒介导hBMP2转染后的兔BMSCs细胞内hBMP2目的基因能高效持续表达目的蛋白,能诱导兔BMSCs分化成骨从而促进兔股骨缺损的修复。     

人骨形态发生蛋白-2基因转染人脂肪源性基质细胞的异位成骨作用

目的探讨腺病毒介导的人骨形态发生蛋白-2(Adv-hBMP-2)基因转染人脂肪源性基质细胞(ADSCs)的可行性及其成骨作用。方法从人脂肪组织中提取间充质细胞，分别转染β-半乳糖苷酶(β-gal)基因和hBMP-2基因，通过X-gal染色明确转染效率．-免疫沉淀 Western blot法和ELISA法检测BMP-2表达，确定BMP-2表达量、表达时间及其相互关系，流式细胞仪观察基因转染对细胞凋亡的影响，并将转基因细胞注入裸鼠股部肌内行X线及组织学检查。结果X-gal染色显示转染效率达91％。免疫沉淀 Western blot法和ELISA法显示转染hBMP-2的ADSC具有较高且稳定的BMP-2的表达，20d内表达量无明显减退。流式细胞表明腺病毒转染后细胞凋亡率上升，但上升幅度不大。裸鼠肌内注射转基因细胞后2周即显示有异位骨形成，4周明显增多，对照组无骨组织形成。结论ADSC是较好的基因治疗载体细胞，转染hBMP-2后可以诱导裸鼠体内骨形成。．     

pcDNA3.1-BMP-2真核表达载体构建及转染兔骨髓基质细胞的实验研究

目的 构建人骨形态发生蛋白2(BMP-2)真核表达载体，鉴定并转染兔骨髓基质细胞，为转基因治疗骨缺失疾病提供实验基础。方法 双酶切克隆载体将BMP-2目的基因与真核表达载体pcDNA3．1连接，免疫组化及Western blotting检测转染BMP-2基因骨髓基质细胞的表达效果。结果 成功构建BMP-2真核表达载体，转染骨髓基质细胞后，有BMP-2表达。结论 骨髓基质细胞经基因转染后可以表达BMP-2。为进一步实验研究提供基础。     

脱钙骨基质复合牛骨形态发生蛋白与单纯脱钙骨基质修复兔桡骨缺损比较

目的比较脱钙骨基质(DBM)复合牛骨形态发生蛋白(bBMP)和单纯DBM修复节段性骨缺损的能力.方法32只新西兰大白兔采用桡骨15 mm节段性骨缺损模型,随机分为2组:A组植入异体DBM与bBMP(10 mg)复合材料;B组植入异体DBM.术后4、8、12、16周,进行放射学检查、病理组织学检查和计算机图象分析新生骨面积.结果X线和组织学检查显示异体DBM与bBMP复合材料组的新骨生成、修复骨缺损能力优于异体DBM组,组织切片的计算机图象分析提示DBM bBMP组修复新骨面积大于DBM组,两者之间差异有显著性(4、8、12周P＜0.05,16周P＜0.01).结论异体DBM复合bBMP材料通过骨诱导和骨传导两种方式修复骨缺损,其修复骨缺损的能力要优于单纯DBM材料,是一种较为理想,具有高效成骨活性的植骨材料.     

hBMP-2基因转染兔骨髓间充质干细胞体内移植后hBMP-2的活性检测

目的 探究人骨形态发生蛋白-2(human bone morphogenetic protein-2 ,hBMP-2)基因植人兔股骨头坏死模型体内后的活性，为后续实验奠定理论基础。方法 1.采用髓芯减压联合液氮冰冻法制备兔股骨头坏死模型;2.将造模成功的兔子随机分为A、B、C3组（n = 12) ,A组不植人材料，为对照组，B、C组分别植人DBM/BMSCs、hBMP-2/BMSCs/DBM；3.术后第1、第2、第3 周各组分别处死4只兔子，分别运用PCR、RTFQ-PCR、Western Blot检测股骨头内hBMP-2基因和蛋白的表达量，评估hBMP-2 基因在兔体内的活性。结果 植人后，在第1、第2、第3周，PCR结果示：A、B两组KBMP-2基因呈阴性表达，C组hBMP-2基因呈阳性表达；RTFQ-PCR 示：C 组相对表达量分别为 1，0.947 ±0.025,0.895 ±0.059, P = 0. 081； Western blot 示：A、B 两组 hBMP-2蛋白在兔体内呈阴性表达,C组hBMP-2蛋白呈阳性表达；凝胶成像系统分析显示：C组hBMP-2蛋白表达灰度值（目的/内参）分别为：0. 530 ± 0. 056、0. 507 ± 0. 066、0. 475 ±0. 086，且两两之间比较P> 0. 05。结论 hBMP-2基因转染BMSCs植人兔股骨头坏死模型体内后能够稳定表达，进而能够持续诱导BMSCs向骨细胞分化,达到修复股骨头坏死的目的。     

重组pcDNA3.1-hBMP-7真核表达载体的构建及转染兔骨髓基质干细胞的实验研究

[目的]构建人骨形态发生蛋白-7（human bone morphogenetic protein-7，hBMP-7）基因真核表达载体，评价其转染兔骨髓基质干细胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）的诱导成骨能力。[方法]从人类胎盘组织中克隆出hBMP-7基因，与真核表达载体pcDNA3．1连接，成功构建了重组pcDNA3．1-hBMP-7真核表达载体；从兔骨髓中分离培养BMSCs，分为3组：ApcDNA3，1-hBMP-7转染组；B空载体pcDNA3．1转染组；C未转染组。使用RT-PCR、免疫组织化学等方法检测hBMP-7在BMSCs中的表达。检测各组细胞碱性磷酸酶，胶原，骨钙蛋白合成情况。[结果]RT．PCR、免疫组织化学检测显示经hBMP-7转染的BMSCs中有BMP-7表达。经hBMP-7转染BMSCs的碱性磷酸酶于转染后第2d显著增高，到第8d达到最高；经hBMP-7转染的BMSCs合成胶原、骨钙蛋白能力也显著提高，与转染空载体、未转染的BMSCs相比有显著性差异（P〈0.05）。[结论]成功构建了pcDNA3，1-hBMP-7真核表达载体；外源的hBMP-7基因可在兔BMSCs中充分、高效的表达，并且这种外源性hBMP-7基因具备了促进兔骨髓基质干细胞向成骨细胞转化的能力，这为hBMP-7的基因治疗提供了坚实的理论基础。     

骨形成蛋白-2基因在人骨髓基质细胞中的表达及对其成骨分化的作用

目的利用构建的人骨形成蛋白-2(BMP2)真核表达载体pcDNA3／BMP2，检测其转染人骨髓基质细胞后的表达及对其成骨分化的影响。方法酶切鉴定构建的真核表达载体pcDNA3／BMP2，利用脂质体介导的转染技术，将所构建的载体导入骨髓基质细胞中，体外单层培养。分别于转染后48h和4周采用原位杂交、免疫组化和碱性磷酸酶、钙化学染色方法检测BMP2的基因蛋白表达以及对骨髓基质细胞成骨分化的影响。结果pcDNA3／BMP2酶切片段的大小与理论相符。转染后细胞能检测到BMP2基因和BMP2蛋白表达，并促进成骨转化。结论pcDNA3／BMP2转染骨髓基质干细胞中可获得短暂和长期表达，并加强骨髓基质细胞的成骨分化能力。     

转染人骨形态发生蛋白在兔骨髓间充质干细胞的表达

目的：采用基因转移技术将人骨形态发生蛋白7（hBMP-7)基因转染兔骨髓间充质干细胞（BMSc ),检测外源基因的表达。方法：常规分子生物学技术构建hBMP-7逆转录病毒载体,制备含目的基因的重组逆转录病毒液,感染兔骨髓间充质干细胞,使用原位杂交以及免疫组织化学的方法检测hBMP-7在BMSc中的表达。结果：原位杂交和组化检测经hBMP-7基因转染的BMSc中出现阳性结果,未转染的BMSc中未见阳性结果出现。结论：采用逆转录病毒介导的方法可以将hBMP-7转染至BMSc中,并有外源性基因的表达。     

人骨形态发生蛋白2腺病毒表达载体转染人骨髓基质干细胞和对其增殖及分化的影响

目的：研究人骨形态发生蛋白-2腺病毒表达载体(Ad-BMP-2)转染人骨髓基质干细胞(hBMSC)对其增殖及分化的影响。方法：利用免疫组化、原位杂交染色和蛋白印迹法检测转染后细胞。BMP-2的表达。流式细胞仪和ALP活性测定分析BMP-2基因转染对细胞增殖、分化的影响。结果：转染后，hBMP-2基因在mRNA水平和蛋白水平均有表达。蛋白印迹法检测到培养液中有BMP-2蛋白阳性表达，S期细胞比例和ALP活性明显增高。结论：Ad-BMP-2可高效转染hBMSC，且促进细胞增殖和成骨转化。     

应用血管内皮生长因子基因治疗股骨头缺血性坏死的实验研究

目的：通过建立犬股骨头缺血坏死模型，探讨应用脱蛋白骨复合转染血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）基因骨髓基质细胞植入治疗股骨头缺血坏死的可行性。方法：实验选取36只成年犬，随机分为3组，每组12只。A组为脱蛋白异体骨复合转染VEGF基因的自体骨髓基质细胞；B组为脱蛋白异体骨复合未转染基因的自体骨髓基质细胞；C组单纯植入脱蛋白骨材料。采用液氮冷冻法制作狗股骨头缺血坏死模型，将细胞骨材料复合物植入缺血坏死股骨头内。应用微循环灌注方法了解股骨头内的血运情况，组织形态学观察坏死股骨头的修复情况，免疫组化方法检测VEGF的表达，骨密度仪测定股骨头的骨密度。结果：A组4周后股骨头内有VEGF表达，12周后股骨头内有大量的树枝状血管生成，大量新骨形成，骨密度增高；B、C组均无VEGF基因表达，B组有部分新骨及血管生成，C组仅见少量类骨质形成，血管再生不明显。结论：利用脱蛋白骨复合转染VEGF基因的骨髓基质细胞可促进新骨形成与血管再生，有利于促进坏死骨的修复。     

转染人骨形态发生蛋白-2基因的羊骨髓间充质干细胞的异位成骨研究

目的评价腺病毒介导的人骨形态发生蛋白-2(hBMP-2)基因转染羊骨髓间充质干细胞(MSCs)后的成骨活性。方法实验分为3组:(1)hBMP-2转染细胞组,(2)半乳糖苷酶基因(βgal)转染细胞组,(3)未转染细胞组。从羊骨髓中分离培养MSCs,基因转染后利用免疫沉淀和Westernblot方法检测BMP-2的表达,并在体外进行碱性磷酸酶(ALP)和VonKossa染色、ALP定量测定、透射电镜观察。分别将细胞悬液注入裸鼠股后部肌内,分期进行X线和组织学检查。结果Westernblot检测发现只有hBMP-2转染细胞组的MSCs表达并分泌hBMP-2。该组于转染后第12d,ALP活性达高峰,与其它两组比较,差异有显著性意义;于16d后出现钙结节,而其它两组未见。透射电镜观察见hBMP-2转染细胞组的细胞内粗面内质网、线粒体和溶酶体增多。裸鼠肌内注射细胞悬液后3周,hBMP-2转染细胞组即有异位成骨,6周时明显增多,其它两组仅见纤维组织形成或微量成骨。结论hBMP-2基因转染能诱导羊MSCs分化为成骨细胞,并在裸鼠体内诱导成骨。     

BMP2重组慢病毒转染兔BMSCs黏附DBM支架的生物矿化研究

目的 探究BMP2重组慢病毒转染兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)黏附脱钙骨(DBM)支架体外构建转基因组织工程骨的生物矿化能力。方法 密度梯度离心及贴壁培养法获取第5代兔BMSCs,用BMP2重组慢病毒转染细胞，通过RT-PCR检测目的基因的表达，利用倒置荧光显微镜观察细胞在DBM支架上的生长情况，借助扫描电镜和能谱分析观测细胞在DBM支架上的表面微观形貌及生物矿化能力。结果 BMP2重组慢病毒成功转染兔BMSCs, RT-PCR显示转染后细胞能高效表达BMP2目的基因，在倒置荧光显微镜下观察见转染后细胞黏附在DBM支架上呈满天星样，并沿DBM支架孔隙内壁贴壁叠加生长、分裂增殖，扫描电镜下见细胞填满整个DBM支架孔隙，分泌大量细胞外基质，并在DBM支架表面形成凹凸不平的光泽结晶矿化物，能谱分析显示其钙磷比(Ca/P)为1.89±0.31,与正常骨组织成分相近(P>0.05)。结论 BMP2重组慢病毒转染兔BMSCs黏附DBM支架构建的转基因组织工程骨成功完成了生物矿化过程，体现出较好的生物矿化能力。