造血干细胞移植中HLA—A、B、C基因分型影响因素的探讨

目的：为提高造血干细胞移植供—受体HLA-I类配型的准确度、特异性和分辨率，对HLA—A、B、C位点基因分型的影响因素进行探讨。方法：分别采用2％EDTA钠盐、钾盐和肝素抗凝血标本，提取200例造血干细胞移植供—受体的外周血DNA，采用美国PEL—FREEZ微量SSP^TM HLA—1类分型试剂盒对该200例标本进行基因分型，并对其影响因素进行分析。结果：2％EDTA钠盐抗凝血标本扩增效果好于2?TA钾盐抗凝和肝素抗凝。DNA浓度范围为25-200ng／μl，最佳浓度为100ng／μ1，A260／A280比例在1．65—1．80之间。溴化己锭(EtBr)浓度为0．2—0．5μg／ml，EtBr量不足将导致无反应带或反应带变弱，EtBr量过多使凝胶本底偏高，影响阳性带的判定。DNA Tag酶的最终反应浓度为0．05U／μl，其活性的高低将直接影响反应结果。结论：确立了HLA——A、B、C位点基出分型PCR—SSP的最佳实验条件，必将提高临床造血干细胞移植供—受体HLA—1类配型的准确度、特异性和分辨率。     

PCR—RSSO基础上HLA—I、Ⅱ基因分型的研究

目的：通过对PCR－DNA技术的分析，探讨人类白细胞抗原（HLA）基因分型方法。方法：采用PCR反向序列特异性寡核苷酸（polymerase chain reaction-reverse sequence specific oligonucleotide,PCR-RSSO)杂交技术，建立改良半量扩增体系全自动HLA－I、Ⅱ等位基因分型方法，进行了635份血液标本HLA－A、B、C、DR、DQ等位基因分型，其中166份DNA同时采用序列特异性引物技术（PCR－SSP）和手工全量扩增体系PCR－RSSO技术。对全自动半量PCR－RSSO、PCR－SSP、手工PCR－RSSO 3种方法做两两比较。结果；全自动半量PCR－RSSO的分型成功率为98．4％（3124／3175），PCR－SSP为98．8％（656／664），手工PCR－RSSO为88．3％（733／830）。经χ^2检验，全自动半量PCR－RSSO与PCR－SSP的分型成功率无统计学差异，与手工PCR－RSSO有显著差异（P＜0．05）。结论：PCR－RSSO可识别HLA－I、Ⅱ共706个等位基因，覆盖WHO命名委员会2000年公布的36个等位基因的75．43％；对706个HLA等位基因的分型均为中－高分辨率，有分辨纯合子等位基因的能力；易长期保存书面的实验原始资料，即杂交条；具有成本低、劳动强度低、省时和DNA消耗量少等优点。PCR－RSSO适合于造血干细胞移植和建立造血干细胞及脐带血干细胞库的组织配型。     

人胚胎嗅鞘细胞移植供、受者HLA配型方法介绍

目的探讨人胚胎嗅鞘细胞移植供、受者HLA配型方法。方法建立嗅鞘细胞库，使用单克隆抗体法和基因分型法分别对供受体进行HLA配型。结果用脐带血行单克隆抗体法分型时，出现假阳性，导致结果无法判读。取胎脑组织与分离纯化培养后得到嗅鞘细胞进行裂解提取的DNA再行基因分型法（PCR—SSP）的结果完全一致，即胚脑组织中提取的HLA分型完全可替代嗅鞘细胞的HLA分型。结论基因分型法（PCR—SSP）能为人胚胎嗅鞘细胞移植供受者提供可靠的HLA分型方法。     

脐血HLA—I类抗原PCR—SSP分型的研究

目的 探讨PCR－SSP（聚合酶链反应－序列特异性引物）分型方法在脐血HLA－I类抗原分型中的应用价值。方法 53例脐血用免疫磁珠分离T淋巴细胞，单克隆抗体配型板作血清学分型，其中38例脐血用DNA快速抽提技术提取DNA后进行PCR－SSP基因分型，对两种方法分型结果进行对比研究。结果 38例脐血中，HLA－A位点PCR－SSP方法与血清学分型方法结果符合率100％，HLA－B位点血清学方法分型误差率为13．2％，其中1个抗原错误（占1．3％），9个抗原漏检（占11．8％）。脐血采集后24小时内作血清学分型较理想，超过24小时则半数以上不能进行血清学分型。抽提脐血DNA一次成功率100％，不受时间限制。结论 在脐血HLA－I类抗原分型中，PCR－SSP方法准确、省血、标本限制少，明显优于血清学方法，适用于脐血库。     

重庆地区人群HLA-A、B、DRB1基因多态性研究

目的了解重庆分库HLA—A、B、DRB1基因多态性，分析重庆地区人群HLA—A、B、DRB1基因频率分布特征，为重庆地区建立造血干细胞捐献者资料库提供依据。方法采用PCR—SSP方法对来自中国造血干细胞捐献者资料库重庆分库的3957名无血缘关系的捐献者．进行基因分型，计算HLA—A、B、DRB1基因频率，并与其他人群进行比较。结果在重庆地区人群中检出了75种HLA基因特异型。其中HLA—A位点19个，HLA—B位点41个，HLA—DR位点15个。A＊02（29．37％），A＊11（29．1％）和A＊24（17．3％）为重庆分库捐献者HLA—A座位的主要等位基因；HLA—B座位中，B＊46（14．98％），B＊4001（13．19％）和B＊13（9．39％）为主；HLA—DRB1座位以DRB1＊09，DRB1＊15，DRB1＊12，DRB1＊04出现频率高。结论重庆地区人群的HLA基因多态性与南方汉族接近，并有其特点。HLA基因分布具有民族和地域特征，为了能最大限度地募集到带有不同HLA分型的造血干细胞供者，有必要在我国多个地区筛选造血干细胞捐献者。     

拟肾移植透析患者PCR-SSP HLA分型影响因素分析

目的分析拟肾移植透析患者HLA分型的某些影响因素。方法对487例拟肾移植的透析患者采用PCR—SSP的方法进行HLA分型,对HLA分型位点不明确的血标本用生理盐水洗涤1次后,再用上述方法进行HLA分型。结果487份样本中,28．34％(138例／487例)HLA分型位点不明确,存在部分特异性带模糊不清或假阴性带。对HLA分型位点不明确的血标本用生理盐水洗涤1次后再进行HLA分型,得出满意结果。结论可能是肝素影响了TaqDNA聚合酶的活性,导致扩增带弱或出现假阴性带。     

HLA-A、B血清学分型与DNA分型的比较研究

目的　采用PCR SSP技术对四川汉族人进行HLA A、B基因分型 ,并与血清学分型比较 ,以探索四川汉族人HLA A、Β血清学分型误定规律。方法　对 13 6例四川汉族健康献血者及移植配型供受者进行PCR SSP分型并与血清学方法比较。结果　 13 6例样本中有 60例血清学分型与PCR SSP分型不符 ( 4 4 1% )。HLA A、B纯合子血清学分型错误率是杂合子的 2倍多。HLA B血清学分型错误率是HLA A的 2倍 ( 2 0 6%VS11.2 % ,P <0 0 0 5 ) :在纯合子、杂合子分别为47 4%VS2 3 .3 %、18 4%VS9.4%。结论　HLA A、B血清学分型较PCR SSP存在很高错误率 ,其中纯合子比杂合子高 ,HLA B比HLA A高。     

器官移植前HLA-A-B-DR DNA样本的制备

随着分子生物学技术的飞速发展，HLA基因分型在临床上及许许多多学科有着重要地位。DNA的提纯与纯化一直是耗时繁锁的过程，DNA质量与数量直接影响HIA分型，从微量血中制备高质量的DNA样品是器官移植前HLA—A—B—DR—PCR—SSP的分型关键。这在移植、诊断、法医学及科学研究中起到重要作用。     

天水地区HLA—B27基因高分辨分型与强直性脊柱炎相关性分析研究

目的：研究天水地区HLA—B27基因高分辨分型与强直性脊柱炎（Ankylosing Spondylits,AS）相关性的分析研究。方法：采用序列特异性引物聚合酶链反应（PCR～SSP）技术对天水地区As患者进行HIA—B27基因高分辨分型。结果：采用PCR—SSP法对天水地区疑似AS进行HLA—B27检测,共发现87例阳性。对阳性者用PCR—SSP法进行HLA-B2701—43基因高分辨分型;其中HIA—B270430例,占阳性总人数的34．48％;HLA—B270555例,占阳性总人数的63．22％;HLA—B27072例,占阳性总人数的2．30％,该基因型是国内首次在AS患者中发现。结论：初步发现天水地区AS患者与HLA—B2704、HLA—B2705有强相关性,偶见HLA—B2707阳性的AS患者,符合亚洲人特点。     

HLA—Ⅱ血清学分型与微量SSP法基因分型的比较分析

目的 验证微量序列特异性引物（SSP）技术进行HLA－Ⅱ类移植配型的准确性并探讨血清学分型错误发生的原因。方法 采用聚合酶链反应结合微量SSP技术（简称微量PCR－SSP法）以及单克隆抗体血清学分型技术对血清样品进行HLA分型并比较其结果。结果 （1）微量PCR－SSP法检测的110例样本中，99例检出HLA－DR的396个等位基因、11例检出HLA－DQ的22个等位基因，检出10％的单倍型个体；（2）两种方法对比研究发现单克隆抗体血清学分型检出错误和漏检率较高，其误差在DR和DQ分别为38．81％和50．75％；（3）错误发生和易混淆的抗原为：DR15／16、11／12、13／14、8、12和DQ5／6、8／9。结论 微量SSP法可以准确检定血清学易漏检和发生错误的抗原等位基因。     

血清学业民DNA方法用于人类白细胞抗原—Ⅰ类分型的比较研究

双盲比较血清学和聚合酶链反应－单链构象多态性分析方法用于汉族人群人类白细胞抗原１（ＨＬＡ－Ⅰ）类分型的结果。方法临床样本５２５份,采用微量淋巴细胞毒技术血清学方法和ＰＣＲ－ＳＳＰ技术ＤＮＡ方法行ＨＬＡ－Ａ、Ｂ抗原分型,比较其准确性、重复性和临床实用性。     

人类白细胞抗原—I类抗原的DNA分型与临床应用

目的 采用顺序特异引物聚合酶链反应技术（ＰＣＲ－ＳＳＰ）建立汉族人群白细胞抗原－Ｉ（ＨＬＡ－Ｉ）类抗原Ａ、Ｂ位点ＤＮＡ分型方法。方法 设计合成８１个特异性引物和１对阳性对照引物,组成２０个ＰＣＲ反应用于Ａ位点分型、４１个ＰＣＲ反应用于Ｂ位点分型。结果 所有样本ＰＣＲ－ＳＳＰ基因分型均获得成功,无假阳性和假阴性出现,４０份样本的重复率１００％,总耗时５小时。分型结果经双盲验证完全符合。可准确分辨出Ａ     

用顺序特异引物聚合酶链反应技术行HLA—A抗原DNA分型

作者采用顺序特异引物聚合酶链反应技术（ＰＣＲ－ＳＳＰ）建立了汉族人群ＨＬＡ－Ａ,位点ＤＮＡ分型方法。研究采用ＰＣＲ－ＳＳＰ对３４５例肾移植供受者样本ＤＮＡ行ＨＬＡ－Ａ位点基因分型均获得成功,共检出Ａ位点等位基因总数６３５个,其中纯合子５５例,杂合子２９０例,可准确分辨ＨＬＡ－Ａ位点等基因２０个,无假阳性和假阴性出现,重复率１００％,总耗时５小时分型结果经标准ＤＮＡ验证和美国加州大学配型中心双盲验证     

PCR-SSP法HLA-A、B基因分型与血清学分型的比较

目的 比较聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)进行HLA-Ⅰ类A、B抗原位点分型的准确性，并探讨血清学分型错误发生的原因。方法 用PCR-SSP以及单克隆抗体血清学分型技术对HLA-A、B分型并比较。结果 34例样本PCR-SSP基因分型无假阳性和假阴性出现。PCR-SSP法与血清学比较，血清学检出错误或漏检率分别为HLA-A位点23.5％，B位点26．5％。血清学发生错误或易混淆的抗原有：A2和A68、A32和A33，B5、B60和61。结论 PCR-SSP法进行HLA-A、B抗原等位基因分型具有分辨率高、特异性强、重复性好、实验过程简捷快速、分型结果较血清学更加准确可靠的优点。     

中华骨髓库河南省捐献者HLA-A、B、DRB1基因频率及单倍型检测

目的:调查分析河南省造血干细胞捐献者人类白细胞抗原(HLA)基因A、B、DRB1多态性和单倍型频率.方法:采用国际通用的4种DNA基因分型技术(聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)、SSO 杂交条技术、SSO荧光微珠流式分行法、SSO正向杂交DNA基因芯片)对24 930名干细胞捐献者的血样进行HLA基因频率及单倍型分析.结果与结论:共检出等位基因:A位点20个, B位点 35个,DRB1位点13个;较常见单倍型及频率为:A*30B*13DRB1*07(0.064 070)、A*02B46*DRB1*09(0.021 900)、A*33B*58DRB1*03(17)(0.012 767)、A*33B*44DRB1*13(0.011 318)、A*02B*13DRB1*12(0.011 021).     

人类白细胞抗原A、B和DRB1测序分型模棱两可结果的分布及解决

目的 调查广西人群HLA-A、B、DRB1基因测序分型中模棱两可结果的分布状况,提出解决方案.方法 采用聚合酶链反应-直接测序分型方法对1 000名中华骨髓库广西分库供者的HLA-A、B、DRB1基因进行测序分型,分析3个基因座模棱两可分型结果的分布情况,并分别采用高分辨聚合酶链反应-序列特异性引物法和组特异性测序引物法进行解决.结果 1 000份标本中,96.7％的标本HLA-A、B、DRB1基因至少有1个位点出现模棱两可结果,其中HLA-A、B、DRB1各位点出现模棱两可结果的比例分别为65.7％、58.8％、77.2％％.对于检出的模棱两可结果标本,单独采用组特异性测序引物法可以解决87.37％HLA-A、93.54％ HLA-B和60.49％的HLA-DRB1基因模棱两可分型结果,使用高分辨聚合酶链反应-序列特异性引物法解决12.63％ HLA-A、4.76％ HLA-B和15.29％ HLA-DRB1基因模棱两可分型结果,剩余1.70％ HLA-B和24.22％的HLA-DRB1基因模棱两可分型结果联合使用组特异性测序引物法和高分辨聚合酶链反应-序列特异性引物法解决.结论 组特异性测序引物法和高分辨聚合酶链反应-序列特异性引物法分别对位于HLA-A、B和HLA-DRB1基因检测区内、外的模棱两可分型结果具有较高的解决能力,二者互为补充,可有效解决HLA高分辨基因分型结果模棱两可问题.     

基因芯片在中国南方汉族人白细胞抗原-DRB分型中的应用

目的 建立一种用于HLA-DRB分型的基因芯片。并通过与PCR-SSP比较。评价芯片的性能。方法 根据中国汉族南方人常见的HLA-DRB位点基因及其多态性的独特序列。在第二外显子区域设计特异性的寡核苷酸分型探针。将其点在玻片上,制成芯片。基因组DNA通过组间特异引物扩增。扩增中同时用荧光素Ｃy5标记,扩增标记后的产物与结合在芯片上的探针进行杂交,通过荧光扫描仪对杂交产生的荧光信号值进行分析。确定样品的HLA-DRB基因亚型,将这一方法应用于110份样本的HLA-DRB基因分型并与PCR-SS究型的结果进行比较。结果 110份淋巴细胞样本,除1份PCR无产物致芯片不能分型外,其余样本芯片分型全部成功。不吻合样本10份;其中SSP定型纯合子6份,芯片分型全部为杂合子,SSP定型为杂合子1份,芯片结果为纯合。经第三方用PCR-SO验证,证实芯片分型正确。另外3份不吻合的样本经测序,证实SSP分型错误2分。芯片分型错误1份。芯片的重复率为95%。结论 基因芯片是一种理想的分型方法,具有特异性高,重复性好。操作简便,所需样本量少。结果判读容易,一次可作多份样本的优点。     

使用PCR-SSP方法检测HLA-DR4抗原

目的：采用顺序特异引物聚合酶链反应(PCR-SSP)建立人类白细胞抗原DR4位点的DNA分型方法。方法：合成特异性引物，组成PCR反应用于DR4位点，建立一步法PCR-SSP。结果：所有样本PCR-SSP基因分型获得成功，分型结果经标准DNA，限制性核酸内切酶分析证实符合，特异性和重复性100％。结论：PCR-SSP检测HLA-DR4的方法具有快速，准确，特异性高等优点，适合临床应用。     

106例广东汉族群体HLA基因频率的分析及其意义

目的 探讨广东汉族群体HLA抗原多态性分布的情况。方法 随机选择了106例广东籍汉族人进行HLA分型。分别采用微量淋巴细胞毒试验及PCR－SSP方法检测了HLAⅠ类,A,B位点及HLAⅡ类DR位点。结果 共检出了HLA－A位点抗原10种,HLA－B位点抗原21种,HLA－DR位点抗原13种,并与北方人群抗原分布进行对比。结论 A11,B46和B60抗原频率比北方人群有显著增高,而A1,A3、B7等抗原则相对减少,显示广东地区汉族人群与北方人群间在HLA多态性分布上有较显著的差异。