华支睾吸虫成虫14～33 ku抗原诊断价值的研究

目的探讨纯化华支睾吸虫成虫14~33 ku抗原在华支睾吸虫病免疫诊断中的应用价值。方法使用SDS-PAGE和电洗提法,从可溶性华支睾吸虫成虫抗原中分离纯化14~33 ku抗原,用此抗原经ELISA方法检测华支睾吸虫病、卫氏并殖吸虫病、日本血吸虫病、姜片虫病患者血清及健康人血清特异性IgG抗体,并与粗制可溶性成虫抗原和可溶性成虫脱脂抗原ELISA结果相比较。结果检测63例华支睾吸虫病患者血清,纯化华支睾吸虫成虫14~33 ku抗原ELISA阳性率为76.2%,可溶性成虫抗原和可溶性成虫脱脂抗原ELISA阳性率均为100%;检测25例卫氏并殖吸虫病、85例日本血吸虫病、27例姜片虫病患者血清,14~33 ku抗原的ELISA交叉反应阳性率分别为8.0%、3.5%、0,而可溶性成虫抗原分别为80.0%、62.4%、14.8%,可溶性成虫脱脂抗原分别为64.0%、55.3%、7.4%;检测127例健康人血清,14~33 ku抗原的ELISA假阳性率为0,可溶性成虫抗原和可溶性成虫脱脂抗原的假阳性率分别为5.5%、3.1%。结论纯化华支睾吸虫成虫14~33 ku抗原用于华支睾吸虫病免疫诊断的特异性优于粗抗原,但敏感性较低。     

免疫印渍技术诊断两种类型卫氏并殖吸虫病的初步研究

应用免疫印渍法观察比较了两种类型卫氏并殖吸虫成虫抗原多肽与卫氏并殖吸虫病人(感染3n)、华支睾吸虫病人、日本血吸虫病人和健康人血清反应的结果。3n 肺吸虫病人血清识别3n 成虫抗原中分子量为38、27、23、22、17.5和17kD 的多肽;2n 成虫多肽检测3n 病人血清,仅22kD 多肽为两型所共有。53、34和20kD 多肽为2n 型所独具。表明本法以3n(或2n)成虫蛋白为抗原,可以区别诊断两类型卫氏并殖吸虫感染。华支睾吸虫病人血清和日本血吸虫病人血清分别识别出17和16kD 多肽及22kD 多肽,提示卫氏并殖吸虫与另两种吸虫间有共同抗原成分。     

组分抗原斑点金标免疫渗滤法检测血吸虫短程抗体的研究

目的建立一种可用于检测血吸虫病人短程抗体的斑点金标免疫渗滤法（dot immuno-gold filtration assay,DIG-FA）。方法将血吸虫可溶性虫卵组分抗原（107～121 kDa）包被于混纤膜上,以胶体金标记的抗人IgG为二抗,建立组分抗原-DIGFA。用该法检测慢性血吸虫病人、健康人、卫氏并殖吸虫病人和华支睾吸虫病人血清。同时与血吸虫可溶性虫卵抗原（SEA）-DIGFA比较。结果检测54份慢性血吸虫病人血清,组分抗原-DIGFA敏感性为94.4%,SEA-DIGFA敏感性为96.3%,两种方法检测50份正常人血清的特异性均为100%。检测19份卫氏并殖吸虫病人血清和30份华支睾吸虫病人血清,SEA-DIGFA敏感性分别为26.3%和10.0%,组分抗原-DIGFA均未检出阳性反应。结论应用组分抗原-DIGFA检测血吸虫短程抗体具有较高的敏感性和特异性,且与其他吸虫病几乎无交叉反应,特异性优于SEA-DIGFA。     

旋毛虫、卫氏并殖吸虫及华支睾吸虫之间共同抗原的研究

目的鉴定旋毛虫、卫氏并殖吸虫及华支睾吸虫之间的共同抗原,避免血清学诊断这3种寄生虫病时的交叉反应。方法应用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酸胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印渍(Western blot)对旋毛虫肌幼虫、卫氏并殖吸虫成虫及华支睾吸虫成虫可溶性抗原中的蛋白组分进行研究。结果旋毛虫肌幼虫、卫氏并殖吸虫成虫及华文睾吸虫成虫3者相同蛋白带的分子量为108、65、53、43、42、31、25、16 kDa。免疫印渍结果表明,旋毛虫和卫氏并殖吸虫抗原中分子量为 65、58、53kDa的蛋白带均与旋毛虫感染的大鼠、小鼠及患者血清、肺吸虫感染的大鼠和患者血清发生反应;旋毛虫和华支睾吸虫抗原中分子量为108kDa的蛋白带均与旋毛虫感染的大鼠、小鼠及患者血清、肝吸虫病患者血清发生反应;而3种可溶性抗原中的53kDa与本实验中所有寄生虫感染的动物和患者均有交叉反应。结论 65、58、53 kDa蛋白为旋毛虫和卫氏并殖吸虫的共同抗原,108kDa蛋白为旋毛虫和华支睾吸虫的共同抗原,而53 kDa蛋白为这3种寄生虫的共同抗原。     

亲和层析法纯化华支睾吸虫抗原的研究

目的探索华支睾吸虫特异性抗原的纯化方法。方法从华支睾吸虫病流行区的淡水鱼中分离华支睾吸虫囊蚴,接种动物,收集成虫,制备匀浆液(粗抗原),借助偶联华支睾吸虫病人血清抗体的Sepharose4B亲和层析柱,提取特异性抗原,用浓度梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳(CG-PAGE)和免疫印迹方法鉴定纯化抗原的纯度和特异性。结果亲和层析法纯化抗原经CG-PAGE显示5条蛋白带,免疫印迹试验鉴定均有抗原性,强阳性带蛋白分子质量单位为31ku,各区带蛋白与并殖吸虫、血吸虫血清抗体无交叉反应。粗抗原有16条蛋白带。结论经亲和层析法纯化的华支睾吸虫抗原特异性高。亲合层析是获取华支睾吸虫诊断用抗原的较佳方法。     

日本血吸虫成虫抗原等电点聚焦电泳和免疫印斑试验的初步分析

用聚丙烯酰胺凝胶等电点聚焦(PAG-IEF)电泳分离日本血吸虫成虫抗原,出现25个不同等电点(pI)的蛋白带,均在酸性区内。通过酶联免疫印斑试验,发现有6条主带可被血吸虫病人血清和重感染兔血清识别,其中有2条带与布氏姜片吸虫病人血清有交叉(起微弱的结合)反应,其余4条主带与布氏姜片吸虫、华支睾吸虫和卫氏并殖吸虫病人血清均无交叉反应。     

亲和层析法纯化华支睾吸虫抗原的研究

目的 探索华支睾吸虫特异性抗原的纯化方法。方法从华支睾吸虫病流行区的淡水鱼中分离华支睾吸虫囊蚴，接种动物，收集成虫，制备匀浆液（粗抗原），借助偶联华支睾吸虫病人血清抗体的Sepharose4B亲和层析柱，提取特异性抗原，用浓度梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳（CG-PAGE）和免疫印迹方法鉴定纯化抗原的纯度和特异性。结果亲和层析法纯化抗原经CGPAGE显示5条蛋白带，免疫印迹试验鉴定均有抗原性，强阳性带蛋白分子质量单位为31ku，各区带蛋白与并殖吸虫、血吸虫血清抗体无交叉反应。粗抗原有16条蛋白带。结论经亲和层析法纯化的华支睾吸虫抗原特异性高。亲合层析是获取华支睾吸虫诊断用抗原的较佳方法。     

rSj26-Sj32-HRP-IgG-Dot-ELISA用于急性日本血吸虫病患者的诊断价值

目的探讨rSj 26-Sj 32-HRP-IgG-Dot-ELISA用于急性日本血吸虫病患者的诊断价值。方法利用纯化的rSj26-Sj32融合蛋白和日本血吸虫成虫抗原(SjAWA)建立HRP-IgG-Dot-ELISA检测急性日本血吸虫病患者血清,并以华支睾吸虫病、卫氏并殖吸虫病、棘球蚴病、乙型肝炎、肺结核病患者和健康人血清作对照,观察二者的检测结果。结果 rSj 26-Sj 32和SjAWA检测急性日本血吸虫病患者阳性检出率均为100%,特异性分别为95.35%和93.02%;二者均与华支睾吸虫病、卫氏并殖吸虫病和泡型棘球蚴病患者血清存在不同程度的交叉反应。结论纯化的rSj26-Sj32融合蛋白是一种较好的免疫诊断抗原。     

五种吸虫抗原组分析及其免疫反应性的研究

应用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和ＥＬＩＢ技术分析了五种吸虫可溶性抗原的蛋白组分及其与病人血清、动物轿清的免疫印渍反应。根据Ｄｏｒｚｏｋ方法制备卫氏并殖吸虫、斯氏狸殖吸虫、三平正并殖吸虫、华支睾吸虫和姜片虫的成虫可溶性抗原。上述抗原的蛋白区带数分别为１６．１３、１４、２７和２６条。酶联免疫印渍法（ＥＬＩＢ）表明卫氏并殖吸虫抗原中有９条主要蛋白区带能与并殖吸虫病人血清中的特异抗体结合。其中６７ｋＤ和８０ｋＤ成分     

五种吸虫抗原组分分析及其免疫反应性的研究

应用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和ＥＬＩＢ技术分析了五种吸虫可溶性抗原的蛋白组分及其与病人血清、动物血清的免疫印渍反应。根据Ｄｏｒｚｏｋ方法制备卫氏并殖吸虫、斯氏狸殖吸虫、三平正并殖吸虫、华支睾吸虫和姜片虫的成虫可溶性抗原。上述抗原的蛋白区带数分别为１６、１３、１４、２７和２６条。酶联免疫印渍法（ＥＬＩＢ）表明卫氏并殖吸虫抗原中有９条主要蛋白区带能与并殖吸虫病人血清中的特异抗体结合，其中６７ｋＤ和８０ｋＤ成分具有诊断及考核并殖吸虫病防治效果的意义。     

旋毛虫肌幼虫特异性抗原的鉴定

目的 寻找诊断旋毛虫病的特异性抗原。方法 应用SDS—PAGE和Western blot对旋毛虫肌幼虫可溶性抗原中的蛋白组分进行研究。结果 旋毛虫肌幼虫可溶性抗原经SDS—PAGE后显示29条蛋白带，分子量范围在112—12kDa之间，其中65、43、42、31、30、20、17、16kDa为主带。112、110、108、102、97、95、65、63、58、55、53、49、45、43、42kDa蛋白组分与并殖吸虫感染的大鼠及患者血清、华支睾吸虫病、血吸虫病及囊尾蚴病患者血清均具有明显的交叉反应带；24—20kDa蛋白组分只与旋毛虫感染的大鼠、小鼠及患者血清反应，而不与其它寄生虫感染的动物或患者血清、正常大鼠和小鼠及正常人血清发生交叉反应。结论旋毛虫肌幼虫可溶性抗原中24—20kDa蛋白组分为旋毛虫肌幼虫的特异性抗原，可用于旋毛虫病的免疫学诊断及血清流行病学调杏。     

华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶基因克隆表达和血清学诊断效果

目的克隆、表达华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶（CSCP）,并评价其免疫学诊断效果。方法根据已知的CSCP（Gen Bank序列号：AF093242）基因序列设计引物,从华支睾吸虫成虫总cDNA中扩增该目的片段,克隆入真核表达载体pPIC9K,转化至巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115中,甲醇诱导表达、纯化;采用Westernblot技术鉴定该重组蛋白;用纯化的重组CSCP（rCSCP）免疫小鼠,ELISA法检测抗体效价;应用DotELISA法和Western blot法评估该重组蛋白的诊断效果。结果从华支睾吸虫成虫cDNA中扩增获得长度为927bp的CSCP基因,并成功进行了真核表达、纯化,纯化的rCSCP免疫小鼠后的血清能被华支睾吸虫成虫可溶性抗原识别,其血清抗体效价达1∶64000;采用该重组蛋白建立的DotELISA法检测华支睾吸虫病人的敏感性为91.7%（55/60）,检测正常人的特异性为97.6%（82/84）;Western blot分析显示,rCSCP与日本血吸虫病人血清无交叉反应,与卫氏并殖吸虫病人交叉反应率为20.0%（2/10）。结论 rCSCP具有较好的诊断效果,是华支睾吸虫重组蛋白中一个有潜在诊断价值的抗原。     

斯氏狸殖吸虫成虫可溶性抗原蛋白质分析

目的分析和检测斯氏狸殖吸虫成虫可溶性抗原的特异抗原组分,为建立特异、敏感的免疫学诊断方法、研制抗斯氏狸殖吸虫药物和疫苗提供理论基础。方法用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、双向电泳(Two-dimension-al gel electrophoresis,2-DE)和免疫印迹(Western blot)等方法,对斯氏狸殖吸虫成虫可溶性抗原进行分析。结果SDS-PAGE分离出22条蛋白带,其中主带8条,分子质量单位为13~64 ku,未见65 ku以上条带。Western blot显示20条显色带,主带6条,分子质量单位分别为13、18、22、28、35和64 ku。2-DE电泳分离出斯氏狸殖吸虫成虫可溶性抗原48个多肽斑点,分子质量单位为14~70 ku,绝大部分分布于pI 3.10~7.14,少数分布于pI 8.78~9.85,在pI 7.14~8.78之间几乎未见多肽斑点。Western blot分析出其中的10个主要多肽斑点能被斯氏狸殖吸虫病患者血清识别,大部分为集中在酸性区域的小分子多肽。结论斯氏狸殖吸虫成虫可溶性抗原经SDS-PAGE电泳分离出的22条蛋白带中,有6条蛋白含量较高,能被斯氏狸殖吸虫病患者血清识别。2-DE电泳分离出的48个多肽斑点中,有10个含量较高,能被斯氏狸殖吸虫病患者血清识别,大部分为偏酸性的小分子多肽。     

华支睾吸虫富甘氨酸2a类抗原Cs4重组蛋白的免疫学特性与定位

目的 对华支睾吸虫富甘氨酸2a(glycine rich antigen 2a,GRA2a)类抗原Cs4重组蛋白(rCs4)进行免疫学特性分析,并对GKA2a类抗原进行组织定位.方法 使用蛋白质印迹(Western印迹)分析rCs4与华支睾吸虫病患者混合血清的免疫反应性,并分析GRA2a类抗原的分泌性.应用ELISA法检测rCs4免疫小鼠血清中抗rCs4特异性IgG水平,并动态检测华支睾吸虫感染兔0～44周的血清中抗rCs4特异性IgG水平.通过免疫荧光实验(immunofluorescence assay,IFA)对华支睾吸虫GRA2a类抗原进行组织定位.结果 纯化的rCsd可被华支睾吸虫病患者混合血清识别.rCs4单抗(mAb Cs4-31)与华支睾吸虫排泄分泌抗原和可溶性抗原在相对分子质量(Mr)26 000与55 000之间分别有13、15个反应条带,均呈阶梯状分布.ELISA检测rCs4免疫小鼠抗rCs4和ESA的IgG效价均达1:64 000,感染兔的抗rCs4特异性抗体平均水平自感染第4周开始上升,于第6周达到高峰,此后逐步递减,至第20周已呈较低水平.IFA检测发现GRA2a类抗原定位于华支睾吸虫成虫的表皮.结论 Cs4蛋白是华支睾吸虫在感染早期的分泌型蛋白,具较好的抗原性.GRA2a类抗原定位于华支睾吸虫成虫表皮.

Abstract：

Objective To study immunological characteristics of Cs4 recombinant protein(rCs4)of Clonorchis sinensis,one of the glycine rich antigen 2a(GRA2a)gene family member,and the histolocalization of GRA2a antigens. Methods The immunological reactivity of Clonorcihs sinensis Cs4 protein to pooled sera from clonorchiasis patients was investigated by using purified rCs4 in Western blotting.The secretory property of GRA2a antigens was also analyzed by Western blotting.The level of specific antibodies against rCs4 in the sera from mice immunized with rCs4,and the dynamic change of antibodies against rCs4 in the sera of C. sinensisinfected New Zealand rabbits(O-44 w post infection)were examined by ELISA.Immunofluorescence assay (IFA)was performed using the anti-rCs4 monoclonal antibody Cs4-31(mAb Cs4-31)to determine the localization of GRA2a antigens in C. sinensis adult worm.Results The purified rCs4 was recognized by pooled sera from clonorchiasis patients.13 and 15 bands appeared at the sites between M,26 000 and 55 000 after mAb Cs4-31 reacting with excretory-secretory antigen(ESA)and soluble adult worm antigen(AWA),respectively.The anti-rCs4 and anti-ESA serum antibody titers in mice immunized with rCs4 were 1:64 000.In C. sinensis infected rabbits,antibody level began to elevate at 4 w after infection,peaked at 6 w,and declined rapidly to a lower level at 20 w.IFA revealed that GRA2a antigens were localized in the tegument of C.sinensis adult worm.Conclusion The Cs4 protein was a secretory antigen appeared in the early stage of infection,and exhibited high antigenieity.GRA2a antigens were localized in tIle tegument of C. sinensis adult worm.     

日本血吸虫31/32kDa分子抗原快速诊断试剂盒的研制与现场应用

目的基于纯化的日本血吸虫31／32kDa分子抗原,建立一种敏感、特异、简便、快速诊断血吸虫病的试剂盒。方法采用Chappell方法分离纯化Sj31／32kDa抗原并建立快速ELISA,检测急、慢性血吸虫病人,并以肺吸虫病人、肝吸虫病人及正常人血清作为平行对照。结果血吸虫病人457例,阳性检出率为94．3％,67例肺吸虫病人及76例肝吸虫病人血清均未出现明显交叉反应,正常人群假阳性率为1％。结论提示采用纯化的优势诊断抗原分子建立的快速诊断试剂盒有较好的现场应用潜能,且具有简便、快速、无需特殊设备等优点,值得推广应用。     

三种抗原用于斑点免疫金银染色试验(Dot-IGSS)诊断华支睾吸虫病的研究

应用斑点免疫金银染色技术(Dot-IGSS),以华支睾吸虫成虫抗原(AWA)、尿素溶解性成虫抗原(CWU)和硫酸铵沉淀成虫抗原(AW)诊断华支睾吸虫病,60例血清抗体检出率均达100.0％,与正常人血清反应(60例)阴性符合率为93.3～96.6％,与日本血吸虫病人(60例)的交叉反应为0～5.0％,与囊虫病人(30例)和肝炎病人(15例)的交叉反应分别为3.3～6.7％和0。各抗原间未见显著性差异(P>0.05)。但与混合阳性血清反应,AW活性似较AWA和CWU强。