荧光染料CFSE作为细胞标记的特性研究

探讨荧光染料CFSE在作为细胞标记时的特性。方法 :应用激光共聚焦扫描显微术 ,观察CFSE在细胞中的准确定位。利用MTT比色法测定CFSE标记的细胞及未标记细胞的增殖情况 ;通过细胞计数和流式细胞仪 (FCM) ,测定细胞在不加任何刺激及诱导的情况下细胞数及平均荧光强度的变化趋势。结果 :在共聚焦显微镜下 ,可见CFSE标记的细胞的细胞膜、细胞核及细胞质中都带有绿色荧光 ,以胞核荧光最强。利用MTT比色法测定标记及未标记细胞的A值无显著差异。连续 6d记录的细胞数与FCM测定的平均荧光强度呈负相关。结论 :CFSE可作为细胞的标记物 ,用于细胞移植的体内检测、细胞增殖试验及细胞分裂周期的估算等研究     

大鼠骨髓基质细胞在脑内的迁移和分化

目的研究骨髓基质细胞(bMSCs)在大鼠脑内的迁移和分化情况。方法体外分离培养大鼠四肢骨的bMSCs,原代培养8~10 d后,同时用含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的反转录病毒上清转导bMSCs并进行抗性筛选,7~10 d可得到稳定表达EGFP的bMSCs,然后将EGFP标记的bMSCs通过侧脑室和尾静脉2种注射方式分别注入纹状体损伤的大鼠体内,进而观察bMSCs向脑内迁移和分化的情况。结果在移植后的大鼠脑内均观察到2种方式植入大鼠体内的bMSCs,这些EGFP阳性的细胞呈现出一些神经元和神经胶质细胞的形态并能表达一些神经元和神经胶质细胞的特异性标志物。结论骨髓基质细胞中确实含有能够向神经元方向分化的干细胞。     

大鼠体神经-内脏神经吻合再生后脊髓前角异体神经元的分离和凝集素的表达变化及作用

目的 研究大鼠体神经-内脏神经吻合以及体神经-体神经吻合再生后,凝集素(agrin)在脊髓前角运动神经元中的表达及其差异,探讨异体神经再生中参与突触形成和维持的相关因子.方法 建立大鼠体神经-内脏神经吻合动物模型和体神经-体神经吻合动物模型,通过荧光染料逆行追踪、标记L4脊髓前角支配盆神经节的运动神经元(异体神经元).流式细胞仪分选被标记细胞,用实时定量PCR测定分选细胞中agrin的mRNA水平.用荧光染料顺行追踪结合免疫荧光标记盆神经节处的新突触.结果 模型鼠吻合再生4个月后,体神经能够再生并替代内脏神经长入盆神经节,并最终形成新的突触结构.在激光共焦显微镜下观察到了这种结构.应用荧光染料逆行追踪结合流式细胞分选技术能满意分离出L4脊髓前角的运动神经元.实时定量PCR测得agrin在各组分选神经元中均有表达,模型组中agrin表达水平较模型对照组和正常组有少许降低(P＜0.05).结论 异体神经再生长入盆节后能够形成新的突触结构,agrin参与形成和维持这种突触结构,其表达量的少许下调,可能与支配的靶器官改变而引起相应内环境的改变有关.     

神经元逆行荧光标记技术

七十年代后期在神经解剖学研究领域中出现了一种新的追踪神经连系的方法——神经元逆行荧光标记法。此法基于神经元轴浆逆行运输的生理特性。注射到神经元未梢周围的逆行荧光标记物能被末梢非特异性摄入并逆向运送至胞体,从而在荧光显微镜下能观察到这些含荧光标记物的细胞。此法简便,敏感度高,能作双或三标记研究。此外,它又易与酶组化、荧光组化、免疫组化等方法相结合,是目前研究神经核团定位联系、侧支投射和神经元化学通路最为理想工具之一。此技术问世以来,深受神经解剖学工作者的重视并用于神经元发育、侧支投射和化学通路的研究,     

外周血内皮祖细胞移植对肢体缺血的改善作用

背景：内皮祖细胞移植为肢体缺血的治疗提供了新的选择。 目的：研究人外周血来源内皮祖细胞移植对改善肢体缺血的作用。 方法：采用Ficoll密度梯度离心法获取人外周血单个核细胞,体外诱导扩增6 d后,检测其内皮祖细胞特异性标志的表达,并将荧光染料标记后的贴壁细胞通过缺血局部多点注射移植到后肢缺血的裸鼠动物模型体内,以评价其治疗效果。  结果与结论：从人外周血单个核细胞诱导出的贴壁细胞可表达内皮祖细胞特异性标志物CD133、CD34和血管内皮生长因子受体2,说明从人外周血单个核细胞中可诱导出内皮祖细胞。移植内皮祖细胞后裸鼠缺血后肢的坏死情况和毛细血管密度均明显改善(P < 0.05);在缺血后肢肌肉石蜡切片中可见分散不均的红色和黄绿色荧光标记的内皮祖细胞的掺入。表明移植的内皮祖细胞可以定向整合到缺血局部,改善裸鼠的后肢缺血。     

皮肤源祖细胞体外诱导神经元样细胞的实验研究

目的探讨皮肤源祖细胞的体外培养、鉴定及定向诱导成神经元的方法,为治疗中枢神经系统疾病提供理想的种子细胞。方法取出生1～3d的昆明鼠皮肤,分离培养出皮肤源祖细胞;皮肤源祖细胞以含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和10%胎牛血清(FBS)的培养基中预诱导24h,再以含二甲基亚砜(DMSO)和3-叔丁基-4-羟基茴香醚(BHA)的培养基中诱导7d;观察诱导细胞形态,以及免疫荧光鉴定细胞表达神经丝蛋白(NF)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)和胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)情况;ELISA检测诱导细胞分泌神经生长因子(NGF)和脑源性神经营养因子(BDNF)情况。结果细胞诱导后呈多极性生长;细胞免疫荧光表达NF和NSE,GFAP表达阴性;随诱导时间延长培养液中BDNF和NGF浓度增加。结论皮肤源祖细胞在特定条件下能定向分化为神经元,并且能提高神经生长因子和脑源性神经营养因子的分泌,能为组织工程皮肤和修复神经系统病变提供种子细胞。     

骨髓间充质干细胞诱导分化为神经细胞的表型变化

为了研究大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)诱导分化为神经细胞的表型特征,利用贴壁培养法获得骨髓MSCs。化学诱导剂二甲基亚砜(DMSO)和β-巯基乙醇(BME)联合诱导MSCs。免疫组织化学染色检测神经元特异性标志物MAP2、NSE和NF的表达,以及胶质细胞标志物GFAP的表达。硫堇-伊红染色检测细胞内Nissl体。结果表明,DMSO和BME联合诱导MSCs后48h,80%以上的细胞变为神经元样形态,胞体发出数个突起,有的似轴突,突起交织成网。免疫组化结果表明,诱导后细胞表达神经元特异性标志物MAP2、NSE和NF,其诱导率分别为88.6%,87.1%和85.8%。神经干细胞的特征性生物学标记nestin的诱导率在诱导后2h和10h较高,分别为48%和71.4%,而在诱导后48h仅为0.06%。诱导后细胞不表达GFAP。Nissl染色结果表明,诱导后细胞胞质中含有Nissl体。本研究结果证明DMSO和BME联合诱导MSCs可获得具有神经元表型特征的MSCs源性神经细胞。     

神经示踪定位SD大鼠长下行脊髓固有神经元胞体及其轴突投射的解剖位置

目的 利用神经示踪技术探讨SD大鼠长下行脊髓固有神经元及其轴突投射的解剖位置.方法 将荧光金(FG)注射入第1腰髓(L1)节段逆行标记大鼠下行脊髓固有神经元(DPNs)胞体;将顺行神经示踪剂生物素葡聚糖胺(BDA)注射到脊髓第3和第4颈髓处标记此处的DPNs胞体及其长下行脊髓固有束(LDPT).固定取材与切片染色后,检...     

流式细胞术测定淋巴细胞的分裂

为确立流式细胞仪检测淋巴细胞的分裂的新方法 ,利用CFSE标记新鲜分离外周及胸腺淋巴细胞后 ,加入PMA、ConA、抗TCR抗体等培养 3d ,染色进行FACS分析。结果 ,诱导T细胞活化分裂的 3种刺激剂 ,以PMA刺激作用最强 ,ConA次之 ,抗TCR抗体最弱。表明CFSE标记细胞 ,流式细胞仪分析法不仅可以检测单细胞水平上细胞的分裂 ,还可根据荧光强度判断细胞的分裂次数。     

种植神经干细胞-许旺细胞的共聚物支架移植修复大鼠损伤脊髓

背景：前期实验显示,在体外乙交酯-丙交酯共聚物支架与神经干细胞和许旺细胞有良好的相容性。 目的：观察与许旺细胞共移植,神经干细胞是否能在乙交酯-丙交酯共聚物取向支架内存活、分化,乙交酯-丙交酯共聚物组织工程复合物是否能促进轴突再生及其髓鞘化。 方法：制作成年Wistar大鼠T8段半横断脊髓损伤模型,随机分为3组：支架组植入乙交酯-丙交酯共聚物支架,神经干细胞组植入接种神经干细胞(标记绿色荧光蛋白)的乙交酯-丙交酯共聚物取向支架,联合组植入接种神经干细胞(标记绿色荧光蛋白)和许旺细胞的乙交酯-丙交酯共聚物取向支架。 结果与结论：移植的神经干细胞可在大鼠脊髓内存活,并迁移至邻近脊髓,联合组标记绿色荧光蛋白阳性细胞存活率显著高于神经干细胞组(P < 0.001)。联合组胶质纤维酸性蛋白/标记绿色荧光蛋白双阳性细胞多于神经元特异性烯醇化酶/标记绿色荧光蛋白双阳性细胞,神经干细胞组未发现神经元特异性烯醇化酶/标记绿色荧光蛋白双阳性细胞。联合组有少部分绿色荧光蛋白阳性细胞表达突触素,再生轴突和有髓轴突数量高于其他两组,但差异无显著性意义(P=0.058)。表明与许旺细胞共移植,可促进神经干细胞向神经元样细胞分化,少部分神经元样细胞还可能形成了突触连接;种植了神经干细胞和许旺细胞的乙交酯-丙交酯共聚物支架可促进轴突再生及其髓鞘化。     

鉴定干细胞及描述已分化细胞类型特征时的常用标志(二)

神经系统CD1 33神经干细胞、HSC 识别神经干细胞的一种细胞表面蛋白 ,神经干细胞可形成神经元和神经胶质细胞。胶质纤维酸性蛋白 (glialfibrillaryacidicprotein ,GFAP) 星形胶质细胞星形胶质细胞特异性产生的一种蛋白。微管相关蛋白 2 (microtubule associatedprotein 2 ,MAP 2 ) 神经元 树突特异性的MAP ,是神经元树突上发现的一种特异性蛋白。髓鞘碱性蛋白 (myelinbasicprotein ,MPB) 少突胶质细胞 由成熟少突胶质细胞产生的一种蛋白 ,位于包绕神经元结构的髓鞘中。巢蛋白 (nestin)神经祖细胞原始神经组织表达的一种中间丝结构…     

脂多糖对大鼠中脑和桥脑内Fos、GFAP、OX42表达的影响

目的 探讨单次腹腔注射脂多糖(LPS),中脑和桥脑神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞的可塑性变化。方法 抗Fos蛋白、抗胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)、抗特异性标记小胶质细胞(OX42)和抗Fos／GFAP双重免疫组织化学标记法。结果 Fos阳性神经元分布于上丘、中脑导水管周围灰质、臂旁核和蓝斑。Fos蛋白在注射后30min。表达,1～3h为高峰。GFAP阳性星形胶质细胞胞体变大,突起增粗,细胞密度增加,30min出现表达,1h为高峰,3h后减少。OX42阳性小胶质细胞首先于脑室周围灰质表达,注射后6h达到高峰,胞体变大,全脑分布。相应于Fos阳性神经元分布区域,GFAP阳性星形胶质细胞和OX42阳性小胶质细胞深染和密集。结论 上丘、臂旁核、蓝斑内神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞可能参与神经免疫调节,臂旁核可能为此调节通路的中继站之一。     

交叉性多巴胺能黑质—纹状体通路——逆行荧光标记和荧光组化联合法研究

实验用神经元逆行荧光标记和儿茶酚胺荧光组化联合法研究大白鼠交叉性黑质一纹状体通路。一侧尾壳核注射标记物后,对侧黑质和其邻近部位均能见到少最逆行标记细胞。这种细胞在一侧脑内约有80个。上述对侧性标记细胞主要见于黑质后部脚间核平面,分散在黑质致密部内侧份、被盖腹侧区外侧份和附近部位。双侧尾壳核注射不同标记物后,没有看到双标记细胞,提示交叉性和同侧性黑质一纹状体投射通路分别由不同细胞的轴突所组成,灌注能诱发儿茶酚胺神经元产生荧光的Eaglu后,表明这些对侧性标记细胞绝大部分为多巴胺能神经元。     

超顺磁性氧化铁标记人Flk-1+CD31-CD34-间充质干细胞对细胞增殖及向神经细胞分化的影响

目的 探讨磁共振增强剂超顺磁性氧化铁(SHO)标记人Flk-1 CD31-CD34-间充质干细胞(hMSCs)对细胞增殖及向神经细胞分化的影响.方法 实验组hMSCs与含SPIO 50 mg/L及多聚赖氨酸(PLL)1.5 mg/L的培养基孵育过夜(12～18 h).通过生长曲线测定、台盼蓝染色及流式细胞仪检测评价SPIO对hMSCs增殖能力、细胞活性及细胞表面标志物的影响.经神经诱导后,通过免疫荧光法测定神经细胞特异性标志物的表达.结果 连续测定7 d细胞活性,活细胞率均超过90%,对照组及实验组生长曲线符合对数生长模式.两组细胞均表达CD44、CD105及Flk-1,而CD31、CD34为阴性.神经诱导后,神经特异性标志物的荧光A值在两组间无统计学差异.结论 SPIO作为磁共振活体示踪剂是安全、有效的.     

Fluoro-Jade C染色方法显示神经毒物MPTP和红藻氨酸致小鼠中脑黑质神经元的变性死亡

为探讨Fluoro-JadeC荧光染色检测神经毒物MPTP和红藻氨酸(KA)损伤致中脑黑质神经元变性死亡的方法,本研究采用小鼠腹腔注射MPTP或黑质定位注射KA制备黑质损伤模型,然后进行Fluoro-JadeC染色标记和计数分析黑质内变性死亡神经元。结果显示:Fluoro-JadeC(FJC)染色可清晰地显示MPTP或KA致小鼠黑质损伤后出现的变性神经元,包括变性神经元的细胞胞体和突起。在中脑组织切片上,MPTP模型与KA模型黑质致密部内有许多FJC染色阳性的变性神经元,而对照组动物黑质内未见FJC染色阳性的变性神经元分布。本研究结果表明:FJC方法能够很好地显示MPTP和KA动物模型黑质内神经元的变性死亡,具备很高的对比度和分辨率,是一种特异性标记黑质变性神经元树突、轴突和胞体的优良染色方法。     

大白鼠上丘传入性联系的HRP法研究

将HRP溶液(33％)注射到21只成体大白鼠的一侧上丘,存活1～2天后,脑切片作DAB或TMB反应,在另一侧上丘及其它脑区观察标记的神经元,结果如下: 1.当注射的深度达到上丘中间灰层或其以下各层时,无论注射点位于上丘的吻、尾端或其之间,标记神经元在另一侧上丘的区域分布与注射的HRP位置大体对应;当注射的深度较浅,即在视觉层及其以上各层时,在对侧上丘未观察到标记的神经元。 2.在上丘的带状层和表面灰层未发现标记的细胞。标记细胞在中间灰层(SGI)最多(53.6％),视觉层为16.5％,深部各层(SGI及其以下各层)标记细胞占标记细胞总数的83.5％。 3.根据标记神经元的形态分为:垂直的梭形神经元,水平的梭形神经元和多极神经元。它们的分布无明显规律。 4.除在同侧的视皮层观察到大量的标记神经元外,在两侧的下丘、外侧丘系背核和丘系旁核、黑质及外侧被盖核、同侧的外膝体腹核、对侧的前顶盖区及网状结构中都发现了标记的神经元。     

系统性红斑狼疮患者巨噬细胞表型和功能初步研究

为了比较健康者与SLE患者巨噬细胞表型和吞噬功能的不同,收集性别、年龄匹配的健康对照者及SLE患者外周血,密度梯度离心法分离单个核细胞,磁珠分选CD14+单核细胞,巨噬细胞集落刺激因子诱导7d,分化为成熟巨噬细胞。FACS检测巨噬细胞表面CD163表达。取健康人CD4+T细胞标记CFSE,在抗CD3、CD28抗体刺激下,以5∶1比例分别与SLE和HC巨噬细胞共培养4d,FACS检测CD4+T细胞增殖比例。紫外辐照Jurkat T细胞株诱导人来源凋亡细胞,将pHrodo Green标记的凋亡细胞(5∶1)与SLE和HC巨噬细胞共培养2h,FACS检测pHrodo+CD14+巨噬细胞的百分率。结果显示,与HC相比,SLE巨噬细胞CD163表达量显著下降;SLE巨噬细胞对CD4+T细胞增殖抑制能力显著降低;SLE巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬功能显著下降。这些结果提示SLE患者巨噬细胞表型、免疫调节能力和吞噬功能存在异常,可能参与其发病。     

巢蛋白和阶段特异性胚胎抗原-1在大鼠2型星形胶质细胞中的表达

目的 观察1型和2型星形胶质细胞(T1A、T2A)是否表达神经干细胞的标志物、是否具有神经干细胞的特性.方法 取新生大鼠脑皮质,体外培养纯化的O-2A祖细胞、T1A和T2A,应用激光共焦双重免疫荧光标记技术检测巢蛋白和阶段特异性胚胎抗原-1(SSEA-1)的表达;观察O-2A祖细胞、 T1A和T2A在碱性成纤维生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)的培养液中生长方式的改变.结果 巢蛋白在O-2A祖细胞和T2A中表达,T1A不表达;SSEA-1仅在T2A中表达.在干细胞培养基中培养10d,T2A形成能增殖和连续传代的细胞球,细胞球巢蛋白标记阳性,贴壁后分化细胞具有神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞样形态;但相同培养条件下的O-2A祖细胞和T1A生长方式无改变.结论 巢蛋白和SSEA-1在两型星形胶质细胞中的表达存在差异,T2A具有神经干细胞的某些生物学特性.     

大鼠中脑导水管周围灰质向下丘脑orexin神经元的纤维投射

目的:明确中脑导水管周围灰质(PAG)神经元调节下丘脑orexin神经元的解剖学基础。方法:首先采用逆行示踪技术,将霍乱毒素B亚单位(CTb)作为逆行示踪剂注射到下丘脑orexin神经元胞体分布的区域,免疫组织化学方法染色观察PAG内CTb逆行标记细胞的分布特点;接着采用顺行示踪技术和免疫组化相结合的方法,将生物素化葡聚糖胺(BDA)作为顺行示踪剂注射到PAG,观察下丘脑内BDA标记的神经纤维与orexin神经元的重叠分布特点;最后运用免疫电镜技术观察BDA标记轴突终末与orexin神经元之间的突触联系。结果:CTb注射到单侧下丘脑orexin神经元区域后,在PAG观察到大量CTb标记神经元,注射点同侧标记细胞数明显占优,其中PAG外侧区(lPAG)和腹外侧区(vlPAG)可见大量CTb逆标神经元,背外侧区(dlPAG)和背内侧区(dm PAG)可见少量标记神经元;注射点对侧lPAG及vlPAG区域也观察到少量CTb标记神经元。BDA注射到单侧lPAG后,下丘脑内双侧均可观察到BDA标记的神经纤维,但注射点同侧标记神经纤维数量明显占优。BDA标记纤维与orexin神经元胞体在穹窿背侧接近不定带(ZI)的区域(本文中将此区域称作"穹窿上区")形成显著的重叠分布。透射电镜下观察到BDA标记的轴突终末与orexin神经元之间形成突触联系,且多为非对称性类型。结论:lPAG投射到下丘脑的神经纤维在穹窿上区与orexin神经元形成优势重叠分布、并与orexin神经元的胞体或树突形成以非对称性为主的突触联系,提示orexin神经元可能在lPAG的直接支配下发挥其调节觉醒状态、摄食行为等功能。     

多巴胺能中脑——杏仁核通路

本实验用神经元逆行荧光标记和单胺荧光组化联合法研究了大白鼠杏仁核内多巴胺能神经纤维的起源及投射特点。一侧杏仁核注射荧光标记物后,同侧黑质致密部背内份和被盖腹侧区背外份有较多的多巴胺神经元被标记。黑质外侧部、A_8群所在部位及对侧黑质致密部和被盖腹侧区亦有少数多巴胺细胞被标记。同侧黑质致密部和被盖腹侧区内还观察到少数非多巴胺能逆行标记细胞。杏仁核与同侧尾壳核、伏隔核或额前皮质配对注射不同荧光标记物后,同侧被盖腹侧区与黑质致密部的背侧区与腹侧区之间有不少多巴胺神经元被逆行荧光双标记。