绵羊多核绒毛膜滋养层细胞的分离培养与鉴定

目的探索绵羊多核绒毛膜滋养层细胞的分离和培养方法,并进行鉴定。方法采用胰蛋白酶和胶原酶两步消化法分离培养滋养层细胞,倒置相差显微镜观察滋养层细胞的形态学特点;应用常规HE染色和免疫组织化学染色,透射电镜技术进行绵羊多核绒毛膜滋养层细胞鉴定。结果倒置相差显微镜下,滋养层细胞为双核及多核细胞,细胞形态为上皮样,呈片状铺展生长;绵羊胎盘子叶与培养的滋养层细胞爬片的细胞角蛋白免疫组织化学染色均显示多核滋养层细胞胞质为棕色阳性信号,透射电镜可见滋养层细胞表面微绒毛发达,胞质内有较多膜包小泡及丰富的微丝和脂滴。结论建立了胰蛋白酶和胶原酶两步消化法分离培养绵羊多核绒毛膜滋养层细胞的方法,获得了较高纯度的具有生物学活性的多核绵羊绒毛膜滋养层细胞。     

滋养层发育和机能分化与粘附因子及细胞因子

胚泡着床后侵入蜕膜组织形成强固粘附的同时,迅速分化成绒毛并完成胎盘的组织构成。绒毛上皮由细胞滋养层、合体细胞滋养层和绒毛外细胞滋养层（ｅｘｔｒａｖｉｌｌｏｕｓ ｃｙｔｏｔｒｏｐｈｏｔｌａｓｔ）组成。在洋养层细胞增殖与分化和绒毛膜形成的过程中与性激素、生长因子、癌基因、癌抑制基因、凋亡关联因子、细胞外基质和粘附因子等多种因子的关系密切。本文仅对细胞外基质和粘附因子等多种因子的关系密切。本文仅对细胞粘附因子（ａｄｈｅｒｉｎ）及细胞因子（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）与滋养层细胞的发育与机能分化进行讨论。     

胚胎干细胞与四倍体互补产生转基因小鼠

目的 将四倍体胚胎补偿技术与转基因相结合，构建基因打靶载体转化的胚胎干细胞(ESCs)，获得小概率的同源重组事件，进而直接得到所要的突变品系。 方法 通过电穿孔的方法将增强型绿色荧光蛋白（EGFP）表达质粒转入ESCs，用G418筛选获得EGFP-ESCs。另外，通过电融合获得四倍体囊胚细胞，显微注射法将19～21个EGFP-ESCs注入每个四倍体囊胚腔，分别移植到假孕2.5d雌鼠子宫或假孕0.5d的输卵管内。 结果 获得稳定表达的EGFP-ESCs，染色体数目正常 (2n＝40条)；四倍体细胞融合率为95.07%，囊胚发育率为95%；共获得410个重构囊胚；移植后未得到出生小鼠，但共观察到了151个着床位点，子宫移植的着床率为29.41%，输卵管移植的着床率为64.37%，获得的胚胎中EGFP蛋白有散在的表达。 结论 稳定表达的EGFP-ESCs参与到了转基因胎鼠的发育中；本实验中输卵管移植的着床率高于子宫移植的着床率。     

大鼠神经干细胞的分离培养、鉴定和诱导分化

近年研究发现,哺乳动物无论在胚胎发育期还是在成年,其中枢神经系统内都存在具有自我增殖和多向分化潜能的神经干细胞,这一发现为神经损伤修复的研究提供了一条新思路。分离培养神经干细胞,并在体外稳定的增殖与分化,为研究神经干细胞的增殖、分化特性、干细胞移植以及建立细胞系等,提供了细胞来源和保证。本研究利用胎鼠和乳鼠的大脑皮层和海马,用含EGFP和bFGF的NSC培养基培养、分离了具有自我增殖和多向分化潜能的神经干细胞,并观察其生长、增殖和分化特点,以期为神经干细胞的基础研究奠定基础。     

人卵黄囊间质干细胞的分离纯化及诱导成脂的实验研究

目的:分离纯化及体外定向诱导人卵黄囊间质干细胞(YS-MSC)分化为脂肪细胞。方法:显微分离人卵黄囊, 经酶消化得到卵黄囊细胞, 卵黄囊细胞经贴壁培养、传代纯化得到人YS-MSC, 流式细胞仪检测YS-MSC表面抗原表达, 钙钴法测定碱性磷酸酶(AKP)活性;地塞米松、消炎痛、胰岛素定向诱导YS-MSC分化为脂肪细胞。油红O检测中性脂肪。结果:人卵黄囊间质干细胞易于分离、纯化, 体外培养增殖潜能大。卵黄囊间质干细胞CD29、CD44、CD166及CD105表达阳性, CD34、CD45和CD86为阴性;AKP弱阳性。卵黄囊间质干细胞经成脂诱导转化为大小不等的园形或椭圆形细胞, 可见胞浆内有少量微小脂滴形成, 随时间延长, 胞浆中脂滴相互融合, 胞核被挤于细胞的一侧, 经油红O染色脂滴染橘红色, 符合脂肪细胞的生物学特征。结论:人卵黄囊间质干细胞与成体间质干细胞表型一致, 在体外可以分化为脂肪细胞。     

妊娠合并胎儿发育迟缓胎盘滋养层细胞凋亡与p53表达增高的相关性研究

目的　研究先兆子痫或吸烟导致妊娠合并胎儿发育迟缓胎盘滋养层细胞凋亡与促凋亡蛋白 p5 3和 Bax的表达及抗凋亡蛋白 Bcl- 2的表达。方法　选择无妊娠合并症妇女胎盘 4例 (n=4 ) ,先兆子痫或吸烟导致妊娠合并胎儿发育迟缓妇女胎盘 7例 (n=7)。胎盘组织切片用 HE染色和末端脱氧核糖核酸转移酶标记法 (TU NEL)染色 ,及细胞角蛋白 18裂解产物检测滋养层细胞凋亡。 Western蛋白免疫印迹和免疫组化方法检测 p5 3表达 ,免疫印迹方法检测 Bas、Bcl- 2、Bak、Bcl- XL 的表达。结果　妊娠合并胎儿发育迟缓胎盘滋养层细胞凋亡比对照组增多 ,这…     

人绒毛膜滋养层细胞的分离纯化及鉴定

目的建立一种简便易行、经济有效的纯化培养滋养层细胞的方法.方法:取孕6-8w的正常绒毛组织10例,采用胰蛋白酶消化法分离细胞,将细胞随机分为两组(各5例),一组用淋巴细胞分层液进行纯化,另一组未纯化,最后用含15%胎牛血清的培养基培养细胞.用免疫细胞化学法进行细胞纯度鉴定.结果本纯化的细胞阳性率为(68.6 2±2.69)%,纯化后的细胞阳性率为(91.60±1.55)%,两者之间的差异具极显著性意度( P<0.001).结论该法简便易行,经济有效,可获得纯度较高、合乎试验要求的细胞滋养层细胞.     

人肺鳞癌干细胞的体外分离培养和鉴定

背景：研究显示可从肺癌细胞系中分离出肺癌干细胞,但对于从新鲜肺鳞癌标本中原代培养肺癌干细胞的报道较少。 目的：探索从新鲜肺鳞癌组织标本中分离肺鳞癌干细胞的可行方法。 方法：借助胶原酶消化法、密度梯度离心法和Hoechst33342染料外排法初筛SP细胞,将初筛细胞置于条件培养基分离培养,后续应用流式细胞分析及分选技术,进一步分离纯化肺鳞癌干细胞。实验结合CD133和CD44鉴定目标细胞,并计数第4代细胞CD133+、CD44+及CD133/CD44双阳性细胞的阳性率。 结果与结论：接种后0.5 h细胞贴壁生长,培养第4天形成典型的细胞集落,第7天呈铺路石样外观,细胞数量级可达108。传代培养第4代肺癌干细胞的CD133+、CD44+和CD133/CD44双阳性细胞数明显增多。说明实验初步从肺鳞癌患者新鲜肺组织标本中分离培养并快速扩增SP细胞,并从中获取更多更纯的干细胞样肺鳞癌细胞,为进一步研究肺鳞癌干细胞的异质性和耐药性奠定基础。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

大鼠肾乳头组织干细胞的分离与鉴定**

背景：迄今为止尚未见到从活体肾乳头部位提取肾组织干细胞及对其细胞性状特点进行分析的研究。 目的：在体外分离培养和鉴定大鼠肾乳头部组织干细胞,并将其生物学特性与骨髓间充质干细胞进行比较。 方法：从SD雄性大鼠肾脏分离提取肾乳头尖部细胞,从股骨胫骨的骨髓腔提取骨髓细胞分别接种于培养瓶,加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基进行体外培养并传代,取对数生长期的第3代细胞行成脂、成骨诱导分化。 结果与结论：①大鼠肾乳头部组织干细胞呈玫瑰花形旋涡状生长,多呈短梭形和多边形。②细胞的生长曲线呈“S”型。③细胞经成脂诱导后油红O染色阳性;成骨诱导茜素红染色后可见橘红色钙盐沉积。④流式细胞术检测显示肾乳头部组织干细胞表达CD29,CD44,CD90阳性,CD45阴性。结果证实肾乳头部位存在具有间充质干细胞特性的组织干细胞。关键词：肾脏;乳头部;组织干细胞;诱导分化;间充质干细胞 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.19.017     

大鼠胚胎脑组织神经干细胞的培养和鉴定

目的探讨从不同胎龄的大鼠脑组织中分离,培养神经干细胞(NSC)并对其鉴定,了解生物特性。方法通过采用机械分离和消化分离相结合的方法分离不同胎龄大鼠脑NSC。在无血清DMEM/F12(含20ng/m lbFGF,20ng/m lEGF及B27辅助培养液)中培养、传代和鉴定。诱导分化后采用SABC法对分化的细胞进行神经元特异烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)检测作细胞鉴定。结果从不同胎龄的胎鼠脑组织中成功培养出神经干细胞,胎龄为12.5天的胎鼠提取的神经干细胞集落最多,在上述条件下培养及传代的细胞不断分裂增殖,形成悬浮生长的呈巢素蛋白(nestin)阳性的神经球;用血清诱导分化为大量表达NSE阳性的神经元和GFAP阳性的星形胶质细胞。结论胎龄为12.5天胎鼠大脑皮质培养出的神经干细胞数量最多,可分化为神经元、神经胶质细胞及少突胶质细胞。     

大鼠脑室下区神经干细胞的分离培养与分化

目的从新生SD大鼠脑室下区分离并培养神经干细胞,观察其生长、增殖及分化。方法采取无血清培养和单细胞克隆技术,采用原代贴壁及传代悬浮方法,培养获得细胞克隆。利用免疫细胞化学方法鉴定神经干细胞。结果从新生SD大鼠脑室下区分离的组织,经原代和传代培养均可形成细胞克隆,且具有增殖能力。原代和传代细胞巢蛋白(Nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)抗原呈阳性。神经干细胞可分化为神经元。结论用上述方法分离的细胞具有自我更新能力和分化潜能以及很强的增殖能力,属于中枢神经系统的干细胞。     

脂肪源性干细胞的体外分离培养与鉴定

背景：脂肪间充质干细胞来源丰富、取材方便、体外有较强增殖能力并具有多向分化的潜能,有望成为组织工程的种子细胞。 目的：体外分离培养SD大鼠脂肪干细胞并进行鉴定。 方法：取SD大鼠腹股沟区皮下脂肪组织,0.075%I型胶原酶消化分离、培养脂肪源性干细胞,倒置相差显微镜下观察脂肪源性干细胞的细胞形态和增殖特征。取第3代细胞用MTT比色法描绘生长曲线,免疫荧光法鉴定干细胞标志物CD44,含有体积分数10%胎牛血清、地塞米松和胰岛素的DMEM/F12定向诱导成脂分化,油红“O”染色成脂分化鉴定。免疫组化法鉴定向神经细胞诱导分化的结果。 结果与结论：分离出的大鼠脂肪源性干细胞生长曲线呈“S”形,强烈表达干细胞标志物CD44。成脂诱导分化经油红“O”染色呈橘红色。向神经细胞诱导分化后表达神经元标志物神经元特异性烯醇化酶。说明SD大鼠脂肪源性干细胞在体外具有易于分离培养和扩增,表达间充质干细胞相关表型,特定条件下可诱导分化的特点。     

新生大鼠神经干细胞的分离培养与分化

目的　从新生SD大鼠脑室下区分离并培养神经干细胞 ,观察神经干细胞的生长、增殖及分化的特点。方法　利用无血清培养和单细胞克隆技术 ,采用原代贴壁及传代悬浮的方法 ,培养获得细胞克隆。应用免疫细胞化学方法及透射电镜检测技术 ,鉴定神经干细胞和分化的神经细胞。结果　从新生SD大鼠脑室下区分离的组织 ,经原代和传代培养均可形成细胞克隆 ,并具有增殖的能力。原代和传代细胞Nestin抗原呈阳性 ,分化后的细胞可表达NSE、GFAP、GC特异性抗原。结论　本法从新生SD大鼠脑室下区分离的细胞具有自我更新和分化潜能 ,有很强的增殖能力 ,属于中枢神经系统的干细胞     

体外分离培养胎盘多分化潜能细胞的实验研究

目的 探索一种新的获取间充质干细胞（mesemchymal stem cells，MSCs）的来源及方法。MSCs在成人骨髓内含量极低．数量随着年龄的增长而减少。MSCs同时少量出现于外周血以及脐带血、胎儿组织器官内，然而，胎儿组织样本难以获取，脐带血中含量太低。这样，如何获得合适的MSCs来源以建立稳定的培养体系．同时避免伦理道德问题的约束是一个值得探索的课题。方法 消化胎盘实体组织，贴壁培养细胞，观测形态并检测其细胞表面抗原表达以及分化潜能。结果 胎盘组织中分离出的贴壁细胞与骨髓间充质干细胞有相似形态和细胞表面标志，具有分化为成骨细胞以及神经细胞的能力。结论 胎盘组织中含有的多分化潜能细胞（placenta．derived muhipotent cells，PDMCs）与骨髓MSCs形态功能相似．胎盘可以作为获取MSCs的一种有效来源。     

5—羟色胺受体和P物质受体在培养的人胎盘滋养层细胞的定位研究

目的：探讨培养的人胎盘绒毛滋养层细胞是否存在5－羟色胺受体（5－HTR）和P物质受体（SPR），方法：采用细胞培养法和免疫细胞化学技术。结果：培养的滋养层细胞为5－HTR与SPR免疫阳性反应，免疫阳性物质位于胞浆内，胞核为阴性。结论：人胎盘滋养层细胞自身含有5－HTR和SPR，为在离体培养条件下研究5－HT和SP对胎盘激素的合成与分泌的调控作用提供了形态学依据。     

人骨髓基质干细胞的单细胞克隆培养与鉴定***☆

背景：骨髓基质干细胞缺乏特异的表面识别分子,其鉴定一直是研究中的难题。 目的：探索人骨髓基质干细胞培养条件,获得体外克隆化培养的成人骨髓基质干细胞,并对其进行表型分析及分化潜能鉴定。 方法：外科手术取髂骨术中抽取骨髓,采用密度梯度离心法初步分离骨髓基质干细胞,用极限稀释法进行克隆化培养;流式细胞仪对克隆化培养的骨髓基质干细胞进行细胞表面标志检测,并进行体外成软骨、成骨及心肌细胞诱导,免疫组织化学及RT-PCR检测成软骨、成骨及心肌细胞表达,确定其表型及分化潜能。 结果与结论：单个细胞来源骨髓基质干细胞在体外1∶3传代一般可以传28代左右,24代以前生长状态良好;经流式细胞仪检测,骨髓基质干细胞表达CD29,CD44,CD106,不表达CD14,CD34,CD45,HLA-DR;骨髓基质干细胞体外可向成骨、成软骨及心肌细胞分化,提示体外克隆化培养的骨髓基质干细胞能维持良好的成体干细胞生物学特性。 关键词：单克隆培养;骨髓基质干细胞;多能成体干细胞;鉴定;分化 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.10.008     

人乳腺肿瘤干细胞分离培养及鉴定

目的:体外分离、培养乳腺肿瘤干细胞,并鉴定其生物学特性.方法:收集临床术后乳腺癌患者的肿瘤组织,经机械剪切联合酶消化法获得肿瘤细胞并培养,流式细胞仪鉴定细胞表面抗原,MTT比色法检测细胞生长曲线,实时定量PCR(qPCR)鉴定细胞Sox2、Nanog等基因表达,免疫荧光检测细胞特异性蛋白Bcl-2、孕激素受体(PR)的表达.结果:所获得的细胞呈克隆球样形态生长,鉴定结果发现其具有CD44+/CD24-表型,该细胞高表达Sox2、Nanog基因,且Bcl-2、PR蛋白均阳性表达.结论:人乳腺肿瘤组织中存在具有自我更新和增殖能力、表达CD44 +/CD24-的乳腺肿瘤干细胞,并能在体外长期培养.     

大鼠腹股沟脂肪间充质干细胞的分离、培养、鉴定及活体标记

背景：脂肪间充质干细胞具有来源丰富、取材方便、体外有较强增殖能力并具有多向分化的特点,有望成为骨组织工程、细胞治疗等的种子细胞。 目的：培养扩增大鼠脂肪源间充质干细胞,以活体标记并鉴定其分化潜能。 方法：无菌条件下取大鼠双侧腹股沟脂肪,Ⅰ胶原酶消化法分离培养脂肪源性干细胞,胰蛋白酶消化法传代扩增。取第3代脂肪干细胞进行流式检测HCAM、CD106、CD29、CD49D和CD34,生长曲线测定,吉姆萨染色,菲立磁标记,成脂诱导后油红O染色及成骨诱导后茜素红染色钙结节。 结果与结论：细胞呈长梭形漩涡样生长,第3代细胞流式鉴定CD29阳性,CD34、HCAM、CD49d、CD106低表达,生长曲线测定有对数生长期,平台期,菲立磁标记阳性率达80%,并且在一些诱导剂下分化为脂肪细胞及成骨细胞。提示,来源于大鼠腹股沟脂肪分离获得的脂肪源干细胞易于培养和传代扩增,并可活体标记且在特殊条件下可分化为成骨细胞和脂肪细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定

背景：骨髓间充质干细胞在骨髓中含量极低,体外培养难度较大。体外分离培养纯度高、活力强、生物特性均一的间充质干细胞,对组织工程及细胞的体内、体外实验显得至关重要。 目的：建立大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化方法,并进行细胞形态学观察、表面标志物鉴定及多向分化能力检测。 方法：通过全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,进行形态学观察,绘制生长曲线,细胞周期分析,流式细胞仪检测细胞表面标记物,分别向成骨、成脂方向诱导分化。 结果与结论：大鼠骨髓间充质干细胞生长以梭形细胞为主,呈放射状排列的细胞集落,细胞生长旺盛,可连续稳定传代10代以上。生长曲线及细胞周期显示骨髓间充质干细胞符合正常细胞生长特征且生长活跃。第3代骨髓间充质干细胞CD44,CD90,CD105均呈阳性表达,而CD34,CD45呈阴性表达。成脂、成骨诱导后,油红O染色、碱性磷酸酶染色、von Kossa法染色和茜素红染色均呈阳性。全骨髓贴壁培养法操作简单,可大量分离、纯化、扩增骨髓间充质干细胞,所获细胞具有间充质干细胞的一般生物学特性,经诱导培养后具有多向分化潜能。实验所用的全骨髓贴壁法法为组织工程提供充足的种子细胞来源具有重要的现实意义。