牙髓干细胞的体外分离培养与鉴定

干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞,具有两个基本性质:(1)自我更新能力;(2)分化能力.干细胞包括胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES细胞)和成体干细胞(adult stem cells,AS细胞).牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)存在于牙髓中,是AS细胞的一种,现已成为牙组织工程新的种子细胞.本文综述了DPSCs的提出、分离培养、鉴别、影响因素及研究前景.     

肿瘤坏死因子α刺激下人牙髓干细胞与CD3+T细胞共培养后生物学功能的变化

背景 牙髓干细胞(dental?pulp?stem?cells,DPSCs)作为目前组织工程中优质的种子细胞,具有强大的免疫调节能力.在炎症微环境下,牙髓干细胞的多种生物学功能会有不同程度的改变.目的 研究肿瘤坏死因子α(tumour?necrosis?factor-α,TNF-α)刺激下人牙髓干细胞与CD3+?T细胞...     

人牙髓干细胞和根尖乳头干细胞体外分化能力的对比研究

目的 对比研究人牙髓干细胞(DPSCs)和根尖乳头干细胞(SCAP)的体外生长特性、增殖及矿化能力.方法 采用酶消化法体外培养人DPSCs和SCAP,诱导分化培养基诱导细胞成骨/成牙本质向分化,流式细胞仪检测特异性标记物,茜素红染色检测矿化程度,逆转录PCR(RT-PCR)检测分化标记物表达.结果 人DPSCs和SCAP为成纤维细胞样贴壁生长,SCAP增殖率较高;两种细胞表达特异性间充质干细胞(MSCs)标记物:CD34、CD45(-),CD90、CD105、CD146(+),基质细胞抗原1(STRO-1)、八聚体转录因子4(OCT-4)(+),SCAP特异性标记物CD24(+).成骨诱导3周可形成明显钙化结构,SCAP钙化能力较强.成骨诱导2周2种细胞均可表达分化标记物:骨涎蛋白、骨钙素、牙本质涎磷蛋白,且随诱导时间表达逐渐增加.结论 人DPSCs和SCAP均具有间充质干细胞典型特征,可分化为成牙本质样细胞,是牙源性组织工程的可靠于细胞来源.     

氯化锂通过PI3K/Akt信号通路调控牙髓干细胞成牙本质向分化的研究

目的 探讨Wnt/β-连环素(β-catenin)通路激活剂氯化锂对牙髓干细胞(DPSCs)分化能力的影响及其相关分子机制。方法 体外培养DPSCs,通过茜素红染色评估不同浓度氯化锂(1和10 mmol/L)刺激DPSCs 1、2周后矿化结节的形成情况;采用实时荧光定量逆转录PCR(RT-qPCR)检测1 mmol/L氯化锂对DPSCs成牙本质标志基因[牙本质涎磷蛋白(DSPP)、牙本质基质蛋白1(DMP1)、碱性磷酸酶(ALP)、骨涎蛋白(BSP)、骨钙素(OCN)的mRNA]表达的影响;采用LY294002抑制磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路,通过茜素红染色和RT-qPCR验证其对DPSCs矿化结节形成及成牙本质标志基因表达的影响。进一步通过Western blot分析1 mmol/L氯化锂加或不加LY294002 (25μmol/L)刺激DPSCs对其下游Akt磷酸化表达的影响。结果 与0 mmol/L氯化锂相比,1 mmol/L氯化锂可明显促进DPSCs矿化结节形成和DSPP、DMP1、BSP、ALP mRNA的表达(P<0.05),而10 mm...     

SHH体外诱导人牙髓干细胞向成骨细胞分化的研究

目的研究体外使用音猬因子(sonic hedgehog,SHH)体外诱导人牙髓干细胞(dental pulp stemcells,DPSCs)分化为成骨细胞的可行性,以优化DPSCs向成骨细胞分化的诱导条件。方法从因正畸或阻生拔除的第一前磨牙或第三磨牙中进行牙髓的提取,通过酶消化法和过滤法获得单细胞悬液,之后再采用有限稀释法对分离出来的原代DPSCs进行培养,克隆化培养,对基质细胞抗原(stromal cell antigen-1,STRO-1)的表达进行检测。MTT法检测SHH因子对细胞增殖能力的影响,通过RT-PCR实验进行成骨向特异的基因I型胶原(type-I collagen,COL-I)表达的检检,利用透射电镜进行诱导前后的细胞超微结构的观察。结果克隆来源细胞的STRO-1表达阳性。人牙髓干细胞经SHH因子体外诱导表现出成骨细胞特性,碱性磷酸酶和VonKossa染色结果均为阳性,RT-PCR检测成骨分化相关基因I型胶原(COL-I)仅诱导组有阳性表达。结论 SHH可以在体外有效诱导人DPSCs转化为成骨细胞。     

重组质粒rAd-EGF构建并转染hDPSCs对其增殖的影响

目的:重组腺病毒介导的表皮生长因子(recombinant adenovirus mediated epidermal growth factor,r Ad-EGF)质粒的构建,及体外转染人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,h DPSCs)后对其增殖的影响。方法:采用目的载体PYr-adshuttle-1和EGF基因(PCR4-TOPO-EGF)构建PYr-ads-1-EGF,在体外重组到PAd/PL-DEST构建r Ad-EGF,并将其体外转染到h DPSCs。将h DPSCs分为3组:r Ad-EGF转染组(实验组)、r Ad-EGFP阴性对照组和空白对照组。当细胞密度达到70%时,用MOI=100的r Ad-EGF或r Ad-EGFP转染各组细胞,在37℃,5%CO2的条件下,用胰酶消化培养48 h后的各组细胞并收集,采用Western blotting检测转染后各组细胞EGF蛋白的表达,采用MTT比色法检测细胞增殖情况。结果:经PCR鉴定,r AdEGF包装成功。在一定时间内,r Ad-EGF转染入h DPSCs,实验组h DPSCs的EGF蛋白表达水平显著高于其他两组(F=339.795,P<0.001),其细胞增殖能力明显升高(F=23.937,P<0.001)。结论 :r Ad-EGF质粒构建成功,r Ad-EGF转染h DPSCs后,其EGF蛋白明显升高,对其增殖具有促进作用。     

构建siRNA慢病毒载体调控人牙髓干细胞Delta1表达的实验研究

目的构建Notch配体Delta1基因慢病毒干扰载体及建立Delta1基因稳定干扰的人牙髓干细胞系。方法将Delta1基因特异性siRNA靶序列与双酶切慢病毒载体pGCSIL-GFP连接,转化,挑取阳性克隆进行PCR鉴定;利用包装细胞293T获得重组的慢病毒,感染人牙髓干细胞,分为DPSCs/Delta1-RNAi组、DPSCs/vector组和DPSCs/wt组;RT-PCR和Western blot分别检测Delta1 mRNA及蛋白的表达。结果经PCR和DNA测序鉴定,成功构建Delta1特异性siRNA的慢病毒载体,并感染牙髓干细胞;经检测DPSCs/Delta1-RNAi组Delta1 mRNA及蛋白表达较DPSCs/vector组和DPSCs/wt组明显降低,DPSCs/vector组和DPSCs/wt组之间无明显差异。结论通过成功构建的Delta1特异性siRNA慢病毒载体对人牙髓干细胞的转染实现了对其Delta1 mRNA和蛋白的调控。     

牙髓干细胞来源条件培养基促进组织修复与再生的研究进展

间充质干细胞(MSCs)在再生医学中具有很大的应用潜力。目前,以MSCs为基础的治疗方法的研究正在进行,其中,牙髓干细胞(DPSCs)在是组织工程研究的热点,其具有很强的自我更新和修复组织和器官的能力,并可调节免疫系统。DPSCs的获取方法简单、无痛、无创伤,无伦理等顾虑。DPSCs的分泌因子可在其条件培养基(CM)中找到,其介导的旁分泌机制在修复过程中起主要作用,可用于修复牙体组织、血管组织、神经组织、骨组织等。DPSCs-CM具有许多优势,可用于同种异体治疗。     

人牙髓细胞的体外培养及生物学特性研究

目的:从年轻恒牙的牙髓组织中分离培养牙髓细胞,研究其表型及生物学特性.方法:选取因正畸或阻生拔除的年轻健康双尖牙或第三磨牙,取出牙髓,组织块酶消化法分离培养人牙髓细胞,免疫细胞化学检测第3代人牙髓细胞表面标志,并对体外培养的人牙髓细胞的矿化能力进行研究.结果:体外培养的人牙髓细胞表达Ⅰ型胶原及波形丝蛋白,少数细胞增殖可...     

两种人牙源性iPSCs的重编程效应及生物学特性比较

目的 比较两种人牙源性iPSCs的重编程效应及其生物学特性.方法 原代培养人牙髓干细胞(DPSCs)和根尖乳头干细胞(SCAP),仙台病毒重编程系统将两种细胞诱导为诱导性多潜能干细胞(iPSCs),比较两种iPSCs的形态、重编程效率及时间,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测SeV及外源性转录基因的表达.结果 人DPSCs、SCAP均重编程为iPSCs,具有典型ES样克隆形态,重编程效率分别为(0.68 ± 0.02)%、(0.7 ± 0.01)%,差异无统计学意义(P> 0.05);重编程时间分别为(26.0 ± 2.1)、(27.0 ± 1.4)d,差异无统计学意义(P>0.05).RT-PCR结果显示,两种iPSCs无外源性病毒或转录基因序列的表达.结论 人DPSCs和SCAP可重编程为无病毒、无转录基因iPSCs,是iPSCs的理想来源.     

神经生长因子联合牙髓干细胞可促进大鼠种植体周围骨结合

目的 研究神经生长因子（NGF）联合牙髓干细胞（DPSCs）调节种植体周围骨结合的作用及机制。方法 培养SD大鼠的DPSCs并随机分3组,每组实验重复4次。对照组：不含药物的培养基处理;NFG组：含有NGF的培养基处理;NFG+K252a组：含有NGF及TrkA拮抗剂+K252a的培养基处理。成骨诱导后检测钙结节,Western blot检测RUNT相关转录因子2（RUNX2）、骨钙素（OCN）的表达量。SD大鼠建立股骨种植模型并分为对照组、DPSCs组、DPSCs+NGF组、DPSCs+K252a组、DPSCs+NGF+K252a组,8只/组。干预4周后进行种植体周围骨组织的micro-CT检查及HE染色并采用Western blot检测RUNX2、OCN表达量。结果 NGF组DPSCs的钙结节数目及RUNX2、OCN的表达水平均高于对照组（P<0.05）;NGF+K252a组DPSCs的钙结节数目及RUNX2、OCN的表达水平均低于NGF组（P<0.05）。DPSCs组及DPSCs+NGF组大鼠种植体周围骨组织的骨矿密度（BMD）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁数量（Tb.N）及RUNX2、OCN的表达水平均明显高于对照组（P<0.05）且DPSCs+NGF组种植体周围骨组织的BMD、Tb.Th、Tb.N及RUNX2、OCN的表达水平高于DPSCs组（P<0.05）;DPSCs+K252a组种植体周围骨组织的BMD、Tb.Th、Tb.N及RUNX2、OCN的表达水平与DPSCs组无显著差异（P>0.05）;DPSCs+NGF+K252a组种植体周围骨组织的BMD、Tb.Th、Tb.N及RUNX2、OCN的表达水平均明显低于DPSCs+NGF组（P<0.05）。结论 NGF联合DPSCs能够促进大鼠种植体周围骨结合,NGF通过TrkA促进DPSCs成骨分化是可能的分子机制。     

人脱落乳牙牙髓干细胞与人恒牙牙髓干细胞成骨分化及破骨能力的差异

目的比较处于生理性根吸收时期的自然脱落乳牙牙髓干细胞（SHED）和恒牙牙髓干细胞（DPSCs）的成骨分化及破骨能
力,探讨两者在成骨和破骨相关分子的表达情况。方法体外分离、培养和纯化处于生理性根吸收时期的自然脱落乳牙牙髓干
细胞与恒牙牙髓干细胞;两种干细胞在成骨诱导14 d 和21 d,分别进行ALP染色、茜素红染色,并通过Real-time PCR检测
SHED和DPSCs矿化诱导后的成骨与破骨相关基因表达。结果倒置显微镜下观察,SHED和DPSCs形态均为长梭形;两种干
细胞经矿化诱导后,茜素红染色可见SHED的矿化结节计数多于DPSCs（P<0.05）,SHED的ALP活性亦强于DPSCs（P<0.05）。
RT-PCR检测结果显示,经矿化诱导后两种干细胞均表达成骨与破骨相关基因Runx2、OCN、ALP、OPG和RANKL,但DPSCs的
Runx2、OCN 和ALP的表达水平均低于SHED（P<0.05）,且SHED反应细胞破骨/成骨能力的RANKL/OPG 的比值显著高于
DPSCs（P<0.05）。结论与DPSCs相比,SHED不仅具有较强的成骨分化能力,还兼有较强的破骨能力,为SHED参与生理性根
吸收骨改建的调控机制提供实验依据。
     

淫羊藿苷对成牙骨质细胞体外增殖及成骨分化能力的影响

目的:探讨淫羊藿苷(icariin, ICA)对成牙骨质细胞(OCCM-30)体外增殖及成骨分化能力的影响。方法:通过体外培养OCCM-30细胞,加入不同浓度(10、20、40μmol/L) ICA,倒置显微镜下观察细胞形态。设置10μmol/L ICA实验组与空白对照组处理,MTT法连续7 d检测OCCM-30细胞增殖率。通过Real-time PCR研究10μmol/L ICA作用于OCCM-30细胞后(1、4、7 d)成骨相关因子OCN和Runx-2的表达。结果:与对照组相比,加入ICA后OCCM-30细胞形态无显著变化,MTT结果显示10μmol/L ICA明显促进OCCM-30细胞增殖(P<0.05)。Real-time PCR结果显示实验组中成骨相关因子OCN和Runx-2的表达显著增高,与对照组相比较差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:适宜浓度的ICA可有效促进OCCM-30的体外增殖及向成骨分化。     

miR-130b-3p促进人牙源性iPSCs重编程的作用

  目的  研究hsa-miR-130b-3p对人DPSCs重编程为iPSCs的影响。  方法  设计合成LV3（H1/GFP&Puro）-hsa-miR-130b-3p-mimics质粒,Lipofectamine 3000将质粒转染到人DPSCs,荧光显微镜观察细胞,RT-qPCR验证转染效率。Sendai reprogramming kit将2组DPSCs重编程为iPSCs（实验组为miR-130b-3p-DPSCs,对照组为DPSCs）,对比2组iPSCs克隆形态和重编程效率,RT-PCR检测Oct4、Nanog、KOS、Klf4、c-Myc的表达。  结果  hsa-miR-130b-3p过表达质粒转染48 h后在DPSCs内有明显表达,证实高效的转染效率（P < 0.01）。Sev重编程得到的2组iPSCs均呈现为扁平致密的圆形克隆,边缘清晰平滑,集落内细胞形态均一、核质比较大,RT-PCR结果表明2组细胞均可表达干细胞特异标志物Oct4和Nanog,同时外源性病毒SeV或转录因子KOS/Klf4/c-Myc不再表达。实验组的重编程效率高于对照组（分别为0.037%和0.018%,P < 0.05）。  结论  hsa-miR-130b-3p可明显促进人DPSCs重编程的效率,为iPSCs应用于牙髓再生治疗提供研究基础。     

人重组转化生长因子β1促进牙髓干细胞的增殖和矿化

目的：研究人重组转化生长因子β1（recombinant human transforming growth factor β1, rhTGF-β1）对牙髓干细胞生物学性能的影响,包括确定促进牙髓干细胞增殖的最佳作用浓度和该浓度下对牙髓干细胞分化的作用。方法： 分离培养人健康第三磨牙牙髓干细胞,分别加入1 μg/L、6 μg/L、10 μg/L的rhTGF-β1,CCK 8（cell counting kit-8）法检测对牙髓干细胞增殖的影响,选择出最佳浓度在成骨/成牙本质诱导条件下连续培养,酶标仪检测碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）光密度值,二喹啉甲酸（bicinchoninic acid, BCA）蛋白质定量试剂盒计算总蛋白含量,两者比值作为ALP相对活性的指标。茜素红染色观察矿化结节形成能力,染色液洗脱后检测光密度值,比较rhTGF-β1对牙髓干细胞增殖和分化的作用。结果：牙髓干细胞具有体外形成矿化结节的能力,6 μg/L rhTGF-β1可促进牙髓干细胞增殖;连续培养7 d后,6 μg/L rhTGF-β1组细胞ALP的光密度值为0.31±0.03,显著高于对照组0.02±0.01(P<0.05);6 μg/L rhTGF-β1组总蛋白含量为（2 775.46±83.54） mg/L,对照组为（1 432.20±110.83） mg/L (P<0.05);ALP相对光密度值,6 μg/L rhTGF-β1组较对照组提高了6倍。茜素红染色下显示矿化结节形成增加,洗脱液光密度值6 μg/L rhTGF-β1组和对照组分别为0.83±0.02和0.55±0.05, P<0.05。结论： 6 μg/L rhTGF-β1具有促进牙髓干细胞增殖和促进体外成牙本质分化的作用。     

经微弧氧化/碱处理并加载RGD肽涂层多孔钛合金支架的制备及其生物学特性

目的 通过3D打印技术打印多孔钛合金支架,研究其表面微弧氧化（MAO）/碱处理并加载精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）肽涂层对前成骨细胞生物学行为的影响。 方法 设计并打印3D多孔钛合金支架,对其进行不同表面处理后分为MAO组、MAO/碱处理（MN）组、MAO/碱处理加载RGD肽（MNR）组,另设空白对照组。检测各组多孔钛合金支架的弹性模量,扫描电子显微镜（SEM）观察各组多孔钛合金支架表面微观结构,能谱分析仪（EDS）检测各组多孔钛合金支架表面元素构成,接触角测量仪检测各组多孔钛合金支架表面水滴接触角大小。将小鼠胚胎成骨细胞前体细胞（MC3T3-E1细胞）与各组支架共培养,CCK-8法检测各组多孔钛合金支架表面细胞增殖活性,Live/Dead细胞染色法检测各组多孔钛合金支架的生物相容性,细胞黏附实验观察各组细胞在多孔钛合金支架表面黏附情况,采用碱性磷酸酶（ALP）试剂盒检测各组细胞ALP活性,实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测各组细胞中Runt相关转录因子2（Runx2）、骨桥素（OPN）和骨钙素（OCN）mRNA表达水平。 结果 3D打印多孔钛合金支架的弹性模量为（1.17±0.62） GPa。SEM观察,MAO处理后的多孔钛合金支架表面呈现火山口样形貌,碱处理后出现细小裂纹并呈现纳米级鱼鳞结构,加载RGD肽涂层的多孔钛合金支架表面观察到散在的RGD颗粒。EDS检测,MNR组支架表面RGD涂层成功加载。接触角测量仪检测,多孔钛合金支架表面接触角MAO组>MN组>MNR组。CCK-8法,培养第1、3和5 天时3组细胞增殖活性均呈增长趋势,培养第3和5 天时各组细胞增殖活性组间比较差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。Live/Dead细胞染色,3组支架均具备良好的体外相容性。细胞黏附实验,共培养48 h后,MNR组细胞数量和形态伸展均优于MAO组和MN组。培养第7天时,与MAO组比较,MNR组细胞ALP活性明显升高（P<0.01）,培养第14天时3组细胞ALP活性组间两两比较差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。RT-qPCR法检测,培养第7天时,与空白对照组和MAO组比较,MN组和MNR组细胞中Runx2和OPN mRNA表达水平均明显升高（P<0.01）,MNR组细胞中OCN mRNA表达水平明显升高（P<0.05）;培养第14天时,MAO组、MN组和MNR组细胞中Runx2和OPN mRNA表达水平组间两两比较差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01）,与空白对照组比较,MAO组、MN组和MNR组细胞中OCN mRNA表达水平均明显升高（P<0.01）。 结论 3D打印多孔钛合金支架具有与人体骨组织匹配的弹性模量,支架表面MAO/碱处理并加载RGD肽涂层对MC3T3-E1细胞无毒性且对其成骨分化有促进作用。     

寡核苷酸YW002对人牙周膜干细胞增殖、周期、凋亡和早期成骨分化的影响

目的：探讨免疫刺激型寡核苷酸（ODN） YW002对人牙周膜干细胞（hPDLSCs）增殖、周期、凋亡和成骨分化的影响,阐明ODN YW002对hPDLSCs生物学性能的调控作用。方法：原代培养hPDLSCs至3~5代,将细胞分为空白对照组、免疫抑制型ODN MT01组和ODN YW002组,共培养1、2、3和5d后采用MTT法检测各组hPDLSCs的增殖活性,采用流式细胞术检测各组hPDLSCs的细胞周期和凋亡情况,采用磷酸苯二钠微板法检测各组hPDLSCs中碱性磷酸酶（ALP）活性。结果：与空白对照组比较,ODN YW002组在培养1和3d时hPDLSCs增殖活性升高（P<0.01）;培养5d时hPDLSCs细胞增殖活性升高,但差异无统计学意义（P>0.05）。与ODN MT01组比较,ODN YW002组培养1d时hPDLSCs增殖活性下降（P<0.05）;培养3和5d时细胞增殖活性升高,但差异无统计学意义（P>0.05）。与空白对照组和ODN MT01组比较,ODN YW002组培养1 d时G₀/G₁期hPDLSCs百分比降低,但差异无统计学意义（P>0.05）;S期hPDLSCs百分比升高,但差异无统计学意义（P>0.05）。与空白对照组比较,ODN YW002组培养1 d时hPDLSCs早期和晚期细胞凋亡率降低（P<0.05）;培养2 d时早期和晚期细胞凋亡率降低,但差异无统计学意义（P>0.05）。与ODN MT01组比较,ODN YW002组培养2d时hPDLSCs早期和晚期细胞凋亡率降低（P<0.05）。与空白对照组比较,培养1、3和5d时ODN YW002组hPDLSCs中ALP活性升高（P<0.01）;与ODN MT01组比较,ODN YW002组培养1和5d时hPDLSCs中ALP活性升高（P<0.05）,培养3d时ALP活性降低（P<0.05）。结论：ODN YW002可通过抑制细胞凋亡以促进hPDLSCs增殖,且诱导ALP活性升高,提示其有潜在的促hPDLSCs成骨分化功能。     

Mage-D1与活化后的p75神经营养因子受体结合可正向调节大鼠外胚间充质干细胞的矿化

目的 检测Mage-D1与活化后p75NTR的结合及对外胚间充质干细胞（EMSCs）矿化的调控。方法 取孕19.5 d SD大鼠牙胚,组织贴壁法获取EMSCs,流式细胞术检测细胞表面抗原。设置实验分组：空白对照组（NC）,100 ng/mL NGF刺激组（100 ng/mL NGF）、慢病毒干扰Mage-D1组（SH-Mage-D1）。邻位连接技术检测Mage-D1与经NGF活化后p75NTR结合的变化,并比较不同分组间的结合强度差异。茜素红与ALP染色观察染色,RT-PCR与Western blot检测ALP、Runx2、OCN、BSP、OPN、Col1、Msx1及Dlx1的表达水平。结果 组织块贴壁法获得孕19.5 dEMSCs,流式细胞术检测细胞表面抗原结果为CD44、CD90、CD29、CD146,CD105高表达,CD45低表达;邻位连接法检测Mage-D1与经NGF活化后p75NTR的结合随着时间的延长而增多,且实验组与对照组相比结合强度差异具有统计学意义（P<0.05）;茜素红与ALP染色结果显示矿化结节与碱性磷酸酶与强度变化一致;RT-PCR与Western blot检测ALP、Runx2、OCN、BSP、OPN、Col1、Msx1及Dlx1在100 ng/mL NGF组最高（P<0.05）。结论 Mage-D1在外胚层间充质细胞中可与经NGF活化后的p75NTR直接结合,且二者的结合对EMSCs的矿化有正向调节作用。