CTLA-4基因多态性在重症肌无力发病机理中的作用

目的探讨细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(cytotoxicTlymphocyteassociatedantigen-4,CTLA-4)基因第1外显子 49位点、启动区-318、-1661、-1772位点的多态性及其导致的无效转录对重症肌无力(myastheniagravis,MG)遗传易感性的影响。方法酶联免疫吸附实验测定MG患者和健康对照血清中可溶性CTLA-4的水平;限制性片段长度多态性分析检测第1外显子 49位点、启动区-318、-1661、-1772位点的多态性;转录因子核因子(nuclearfactor1,NF-1)和CCAAT/增强子结合蛋白β(CCAAT/enhancerbindingproteinbeta,c/EBPβ)结合位点通过染色质免疫沉淀实验得以验证。结果启动区-1772、-1661位点和第1外显子 49位点的多态性与MG,特别是伴发有胸腺瘤的MG密切相关。启动子-318位点的多态性与MG无关。CTLA-4基因4个多态性位点间有一个明确的正性连锁不平衡关系。MG患者血清可溶性CTLA-4的表达水平与等位基因的突变相关联。-1772、-1661位点的多态性可改变转录因子NF-1和c/EBPβ结合位点,而ConA、PHA则能促进NF-1和c/EBPβ的这种位点特异性转录活性。结论MG患者CTLA-4A/G 49、C/T-1772和A/G-1661多态性可导致无效转录,影响MG的遗传易感性,T→C-1772的突变能影响基因的剪接,从而干扰蛋白的表达和功能。     

HIF-1α基因启动子-1946位点基因多态性与紫绀型先天性心脏病低氧耐受的相关性

目的研究低氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因多态性与紫绀型先天性心脏病(CCHD)低氧耐受能力是否具有相关性。方法用靶向捕获技术,对97例CCHD患儿和108例非紫绀型先天性心脏病(ACHD)患儿HIF-1α基因二代测序;生物信息学分析后找出差异分布的多态位点;用Sanger测序验证。针对HIF-1α启动子区多态位点,构建不同基因型HIF-1α启动子-荧光素酶报告基因载体;转染HEK293T和H9C2细胞;用双荧光素酶报告基因检测系统,分析HIF-1α不同基因型启动子活性。结果 CCHD组HIF-1α启动子区-1 946位点A碱基删除变异频率高于ACHD组(P0.05)。与AA基因型比较,DD基因型HIF-1α启动子转录活性更高(P0.05)。结论 HIF-1α基因-1 946位点与CCHD耐受低氧能力相关,DD基因型HIF-1α转录活性明显增高,可能是耐受低氧的分子遗传学机制之一。     

转录因子MAZ对c1orf109基因转录表达调控的体外研究

目的:本文旨在研究转录因子Myc相关锌指蛋白(MAZ)在体外对人类1号染色体开放阅读框109(c1orf109)基因的转录表达调控。方法:体外条件下,采用凝胶电泳迁移实验筛选c1orf109基因启动子区MAZ的结合位点,并利用本室构建的由c1orf109启动子驱动的增强型绿色荧光蛋白报告载体与MAZ和转录因子特化蛋白1(Sp1)的表达质粒共转染He La细胞,24 h后,用激光共聚焦显微镜和流式细胞术检测c1orf109基因的转录表达情况。结果:c1orf109启动子区可与MAZ结合,且有与Sp1共享的结合位点;MAZ与Sp1皆可抑制c1orf109的转录表达,且Sp1的抑制作用大于MAZ(P0.05)。结论:MAZ与Sp1两个转录因子共同调控c1orf109基因在生理及病理条件的表达,且调控方向一致。这种冗余机制调控方式的存在提示该基因的精确表达调控对于细胞行使其生物学功能可能具有重要意义     

人TSLC1基因核心启动子的克隆和鉴定

目的克隆和鉴定人TSLC1基因的核心启动子区,用于开展其转录调控机制的研究。方法用PCR方法从人基因组DNA中扩增出TSLC1基因翻译起始位点上游一系列大小不等的片段,连入pGL3-Basic荧光素酶报告基因载体中。通过瞬时转染A549及NCI-H446细胞,检测细胞裂解液中的双荧光素酶活性,确定TSLC1基因的核心启动子区。结果在人TSLC1基因启动子区的分段克隆中,ATG上游-68～-329 bp片段在A549及NCI-H446细胞中均具有很强的启动活性,对TSLC1的转录起重要作用。结论人TSLC1基因翻译起始位点ATG上游-68～-329 bp区域可能为基因的核心启动子区。     

转录因子GATA-1与人巨细胞病毒UL111A基因5'上游序列结合的实验研究

 目的：利用人巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）潜伏及再激活感染THP-1细胞模型，研究细胞核内转录因子GATA-1与HCMV UL111A基因5'上游DNA序列的相互作用。方法：采用免疫印迹（Western blotting）技术定量分析HCMV潜伏及再激活感染时细胞核内转录因子GATA-1的表达；通过MATCH工具软件分析UL111A基因5'上游DNA序列，发现存在着11个GATA-1的结合位点，针对这11个GATA-1结合位点DNA序列设计9对引物，采用染色质免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation, ChIP）及实时荧光定量PCR技术分析转录因子GATA-1与UL111A基因5'上游DNA序列的结合情况。结果：HCMV潜伏感染时UL111A基因未表达cmvIL-10，激活感染时表达cmvIL-10，潜伏感染时转录因子GATA-1的相对表达量高于激活感染；以GATA-1抗体特异性结合的DNA片段为模板，9对引物中共有5对扩增出目的条带；HCMV潜伏感染组和激活感染组5个位点转录因子GATA-1结合率分别为：-4.00±0.26、-4.50±0.33、-4.41±0.21、-3.61±0.20、-3.47±0.11和-1.13±0.07、-0.63±0.05、-1.10±0.07、-0.24±0.03和-0.14±0.01，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论：HCMV感染时转录因子GATA-1可能通过与UL111A基因 5’上游序列1119（-3760）位点、107（-4772）位点、609（-4270）位点、849（-4030）位点和2047（-2832）位点结合，调节UL111A基因的转录，参与HCMV潜伏与再激活感染的过程。     

COL1A1基因PCOL2和Sp1结合位点多态与先天性髋脱位的关联分析

目的 研究Ⅰ型胶原a1链(collagen type Ⅰ alpha 1，COL1A1)基因PCOL2和Sp1结合位点多态性在中国北方人群中的分布，并探讨其与先天性髋脱位(congenital dislocation of the hip，CDH)的关系。方法 在81个CDH核心家系的243名成员中，采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析方法，对位于COLIAI基因启动子内的PCOL2多态(-1997G／T)和转录调控区第1内含子内的Sp1多态(1546G／T)进行基因分型，并进行传递不平衡检验。结果COL1A1，基因PCOL2结合位点G／T多态与CDH不存在明显关联(P=0．537)，中国人PCOL2多态位点的基因型和等位基因频率分布与西班牙白人群和美国白人群差异存在统计学意义；Sp1结合位点只检测到SS基因型，未检测到Ss或ss基因型。结论 COL1A1基因PCOL2和Sp1结合位点多态存在种族差异，PCOL2和Sp1结合位点多态可能与中国人CDH的发病风险无关。     

WT1基因增强子构建位点对WT1基因启动子转录活性的影响

目的：以WT1基因启动子和增强子的功能片段为研究对象，探讨增强子构建在质粒的不同位点对基因启动子转录活性的影响。方法: 利用基因重组技术将WT1基因增强子的功能片段分别插入在已含有WT1基因启动子的质粒，pEWP的不同位点（MCS中的BamH I、EGFP 终止密码后的Not I和SV40polyA位点后的AflⅡ）中，将重组质粒转染慢粒白血病红白急变细胞株K562细胞、乳腺癌细胞株MCF-7细胞和人类胚胎肾转化细胞株293细胞，通过检测转基因细胞中EGFP的平均荧光强度来评估增强子对启动子的转录促进作用。结果: 通过基因重组技术分别构建了含有WT1基因启动子的载体，即pEWP，和含有WT1基因启动子和增强子的载体，即pEWPE、pEWPD和pEWPA。流式细胞仪检测EGFP的平均荧光强度，发现pEWPA在293细胞和K562细胞中能够增强WT1启动子的转录活性，而pEWPE和pEWPD则无增强作用。3者均不能在MCF7细胞中增强WT1启动子的转录活性。结论: SV40polyA位点后插入增强子能够有效地增强启动子的转录活性，且具有细胞特异性。     

白细胞介素-1基因多态性与高血压易感性的研究

目的　观察白细胞介素 - 1(interleukin- 1,IL- 1)基因多态性在中国汉族人群中的分布及其与原发性高血压 (essential hypertension,EH)的关系 ,初步分析其基因型与 EH易感性的相关性。方法　应用聚合酶链反应和限制性片段长度多态性的方法 ,检测湖北省汉族 15 2例 EH患者和 16 8名正常对照者的IL- 1基因多态性 ,包括 IL- 1α(- 889C/ T)位点、IL- 1β(- 5 11C/ T)位点、IL- 1β( 395 3C/ T)位点、IL- 1Ra( 80 0 6 T/ C)位点多态性以及 IL- 1Ra第 2内含子可变数串联重复序列多态性。结果　IL- 1α(- 889C/ T)位点、IL- 1β( 395 3C/ T)位点、IL- 1Ra( 80 0 6 T/ C)位点多态性和 IL- 1Ra可变重复序列多态性在 EH组和正常人群中的分布差异无显著性 (P>0 .0 5 ) ,而 IL- 1β(- 5 11C/ T)位点多态性在两组人群中的分布差异存在显著性 (P<0 .0 5 ) ,携带 CT基因型罹患 EH的危险性可增加 2 .5 4倍。结论　 IL- 1β基因启动子区 - 5 11位点 C/ T多态性可能与 EH易感性存在相关关系。     

ATF6调控生殖相关基因HSPA1L表达的分子机制

目的 探究内质网应激活化转录因子6(ATF6)对生殖相关基因热休克蛋白A1样蛋白(HSPA1L)表达的影响并初步阐明其调控分子机制。方法 在人胚肾细胞系HEK-293T中转染ATF6过表达质粒,RT-qPCR和Western blot验证过表达效率;利用雄性ATF6敲除小鼠睾丸组织转录物组测序信息,筛选ATF6下游5个生殖相关基因;双荧光素酶报告基因实验选择启动子活性较高的下游基因并检测过表达ATF6对其启动子活性的影响;通过gene-regulation预测ATF6和下游基因启动子可能的结合位点;RT-qPCR和Western blot检测在HEK-293T细胞中过表达ATF6对于下游基因表达的影响;利用凝胶迁移实验(EMSA)确定ATF6与下游基因启动子是否结合。结果 转染后HEK-293T细胞中ATF6的mRNA(P<0.001)和蛋白(P<0.05)表达水平明显升高。转录物组测序及双荧光素酶报告基因实验筛选出ATF6下游的生殖相关基因HSPA1L。ATF6能够促进HSPA1L的截短启动子活性(P<0.001)。过表达ATF6后,HSPA1L的表达量明显升高(P...     

Cyclin H基因启动子区-1 SNP对转录活性的影响

目的 探讨CCNH基因启动子区-1SNP位点碱基变异对CCNH基因转录活性的影响.方法 通过PCR和定点突变技术,构建了含CCNH基因基础启动子及-1G突变启动子,用双荧光素酶报告系统观察此SNP对CCNH基因启动子转录活性的影响.结果 在AD293细胞中,-1G突变启动子活性比CCNH基础启动子活性低26%(P<0.05).结论 -1T→G碱基变异可显著降低CCNH基因启动子转录活性.     

EDN1基因5''上游AP-1顺式调控元件在同型半胱氨酸诱导HUVECs EDN1基因转录中的作用

目的:探讨EDN1基因5'上游AP-1顺式调控元件在同型半胱氨酸(Hcy)诱导HUVECs EDN1基因转录中的作用.方法:用荧光探针DCF检测HUVECs内活性氧的含量;用RT-PCR法检测EDN1mRNA的表达,用Western blotting法测定c-jun/AP-1蛋白的表达;同时用双抗夹心法测定HUVECs上清液中EDN1的分泌;利用重组质粒的瞬时转染技术观察了HUVECs的AP-1报告基因的活性.结果:Hcy能明显增加HUVECs ROS的生成,促进 EDN1的分泌和提高EDN1mRNA的表达;瞬时转染分析实验结果显示Hcy能明显诱导质粒pGL3-EDN1-AP-1(-115/+135)荧光素酶的表达,但对质粒pGL3-EDN1-AP-1(-115/+135)的突变体pGL3-EDN1-AP-1 MU(-115/+135) 荧光素酶的基础表达及Hcy的诱导作用均明显降低.结论:推测Hcy可能改变HUVECs内的氧化还原状态,促进ROS的释放,激活核转录因子AP-1,通过EDN1基因中AP-1顺式作用元件调控该基因转录.     

胰高血糖素样肽-1对胰岛素分泌传导通路中胰十二指肠同源盒-1基因的调控作用

胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是一种肠促胰岛素,它通过多种复杂的机制使血糖降低的同时,促进胰岛β细胞增殖与再生;胰十二指肠同源盒-1( PDX-1)是β细胞内重要的转录因子,参与β细胞胰岛素基因的转录调控,GLP-1通过上调PDX-1基因蛋白的表达而影响胰岛β细胞增殖与再生.     

转录因子Sp1和Sp3对食管癌细胞ezrin基因的表达调控作用

目的:明确转录因子Sp1和Sp3对食管癌细胞ezrin基因的表达调控作用.方法:将转录因子表达载体CMV-Sp1和CMV-Sp3分别转染食管癌EC109细胞,采用定量RT-PCR和Western blot技术检测过表达转录因子Sp1和Sp3对ezrin mRNA和蛋白表达的影响;将ezrin基因启动子驱动的报告基因表达载体与内参照质粒pRL-TK和转录因子表达载体共转染EC109细胞,采用双荧光素酶报告基因分析系统检测转录因子Sp1和Sp3对ezrin基因启动子的激活作用以及这种激活作用是否依赖于ezrin基因的Sp1结合位点-75/-69.结果:过表达转录因子Sp1和Sp3显著提高EC109细胞ezrin mRNA和蛋白表达水平以及启动子活性.Sp1和Sp3增强ezrin基因启动子活性的作用位点不同,只有Sp1通过-75/-69位点调控ezrin基因启动子活性.结论:转录因子Sp1和Sp3可调控EC109细胞ezrin基因的表达.     

TGF-β1和ADAM33基因交互作用与儿童哮喘易感性及严重程度相关性

目的:探讨转化生长因子β1(TGF-β1)和解整合素金属蛋白酶33(ADAM33)基因单核苷酸多态性与儿童哮喘易感性及严重程度相关性。方法:采用以医院为基础的病例对照研究(110例哮喘患儿和144例对照)方法,三个多态性位点(V4、T2、T869C)用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)技术进行基因分型,应用MDR软件分析基因各位点之间交互作用。结果:TGF-β1基因的T869C位点基因型及等位基因频率分布在哮喘组和对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。哮喘组ADAM33基因V4位点C和T2位点A等位基因频率显著高于对照组(P<0.01),而V4位点的CC基因型及T2位点的GA基因型分布在轻中度哮喘组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),T2位点的AA基因型分布在重度哮喘与对照组比较无显著性差异(P>0.05)。MDR交互作用分析显示,ADAM33基因V4和T2位点构成的2个位点最佳模型;ADAM33基因位点V4、T2和TGF-β1位点T869C构成的3个位点最佳模型两组比较均有统计学差异(P<0.05)。结论:ADAM33基因V4和T2位点与儿童哮喘发生及其严重程度相关,同时TGF-β1基因T869C位点与ADAM33基因V4和T2位点均具有明显交互作用     

hNaDC1基因5''''侧翼区转录调控序列系列载体构建与鉴定

目的构建hNaDC1基因5’侧翼区转录调控序列系列萤火虫荧光素酶报告基因表达载体。方法PCR扩增获得hNaDC1基因5’侧翼转录调控区不同长度片段:hNaDC1A(-2232/ 136,2368bp)、hNaDC1B(-1640/ 136,1776bp)、hNaDC1C(-1084/ 136,1221bp)、hNaDC1D(-253/ 136,389bp)、hNaDC1E(-2232/-12,2244bp),以pGL3-Basic为载体构建hNaDC1基因5’侧翼序列系列缺失质粒。重组体通过特异限制性内切酶酶切鉴定,并送样测序鉴定。结果成功构建hNaDC1基因5’侧翼区转录调控元件萤火虫荧光素酶报告基因表达载体5个:pGL3-hNaDC1A～E。结论为进一步研究NaDC1基因5’侧翼区转录调控元件的分布特点及转录调控元件与转录因子间的相互作用提供了基本实验条件。     

广东新型甲型H1N1病毒血凝素基因分子进化与变异

目的 揭示广东地区2009-2011年新型H1N1病毒血凝素基因(HA)进化特征及抗原表位变异特征.方法 采用时空抽样方法抽样,检测2009-2011年广东分离的24株新型H1N1病毒HA基因核苷酸序列,与GenBank中44株国外相应序列比较;比对HA基因核苷酸序列,分析基因分子变异,构建分子遗传动力学MCMC进化树;同时分析2009-2011年广东毒株HA基因的抗原表位变异情况.结果 68株HA基因进化树显示,广东毒株进化树主干至少分为6大分支;其中2011年毒株聚类为2个(Ⅴ和Ⅵ)主要分支,各具基因特征.变异频率较高的位点包括391、467、202和214位,正向选择位点包括8、145和391;广东毒株抗原表位区发生S145L/P、L208I、Q240R、S160G和G187R位点变异.2009年广东毒株HA基因分支Ⅰ毒株可能于2010年传播到亚洲、欧洲和澳洲地区.结论 广东新型H1N1病毒HA基因变异具有传播特征(Ⅰ)和地区特征(Ⅵ),位于抗原表位Ca、Sa和Sb的氨基酸发生变异,其中位点145等变异频率较高,承受着正向选择压力.     

人LAIR-1/CD305基因启动子的生物信息学分析

目的:研究人LAIR-1/CD305启动子及其5′上游调控序列。方法:通过检索NCBI中的人类基因组数据库,获得LAIR-1的转录本序列及翻译起始位点上游2500bp的序列。利用Promoter2.0等软件预测LAIR-1的启动子序列,然后利用MatInspector等软件对启动子序列的转录因子结合位点和启动子功能模块进行预测。结果:LAIR-1基因的核心启动子区位于翻译起始密码子上游的600～200bp区域内。在转录调控区发现了一些重要的转录因子结合位点,并预测到13种启动子功能模块。结论:LAIR-1基因的表达可能受到多种转录因子和5′端上游调控序列的调控。     

上游转录因子1基因多态性与代谢综合征研究进展

上游转录因子基因位于染色体上代谢综合征和2型糖尿病连锁分析重现率最高的区域(1q21-q25)内.该基因编码的蛋白属于碱性螺旋-环-螺旋-亮氨酸拉链家族的成员,可参与控制和调节糖、脂代谢相关基因的表达,因而可作为代谢综合征和2型糖尿病的重要候选基因.本文就上游转录因子1基因的结构、生物学特性以及与代谢综合征相关性状关系的研究进展进行了综述.     

敲低Stau1后小鼠前脂肪细胞系3T3-L1中FOXP1的表达增加

目的 在小鼠前脂肪细胞系3T3-L1分化过程中敲低双链RNA结合蛋白Staufen1(Stau1)后筛选差异表达的基因，分析其生物学功能，并用qPCR验证测序结果。方法 用RNA-seq分析Stau1敲低后基因的转录调控。构建STAU1 shRNA并转染3T3-L1细胞，鸡尾酒方法诱导其分化为成熟脂肪细胞，收取0、4 d的细胞设立对照组和STAU1敲低组(各3组生物重复样本)收取12组样品的细胞基因芯片信息，以变化倍数log2(Fold change)>1且校正后的P<0.05作为条件筛选Stau1敲低的细胞与对照组样本间的差异表达基因，进行基因本体论(GO)及代谢通路分析(KEGG通路数据库),qPCR验证差异表达的基因。荧光素酶报告基因实验验证SATU1与叉头盒蛋白P1 FOXP1 mRNA 3′UTR上Staufen1结合位点(SBS)存在结合。结果 较对照组STAU1敲低细胞组中共筛选出差异表达基因588个，其中上调406个、下调182个。差异表达基因主要参与的生物学过程中脂代谢、炎性反应因子，主要富集的信号通路有糖代谢和能量代谢相关通路。敲低Stau1后FOXP1...     

白细胞介素1α基因单核苷酸多态性与甲型H1N1流感易感性的关系

目的 探讨白细胞介素1d(IL-1α)基因单核苷酸多态性(SNP)与甲型H1N1流感易感性的关系.方法 从IL-1α基因启动子区域中选取4个SNP位点rs1800587、rs2856836、rs2856838、rs3783525,针对以上位点建立基于飞行时间质谱分析技术(TOF-MS)鉴定SNP的方法,对167例H1N1流感患者(H1N1组)和192例健康对照人群(对照组)进行检测.确定各SNP位点的等位基因和基因分型;对比两组等位基因和各基因型的频率.结果 rs1800587、rs2856836、rs2856838位点具有T和C两种等位基因,包括TT、TC、CC 3种基因型.rs3783525具有A和T两种等位基因,包括AA、AT和TT3种基因型.H1N1组和对照组rs 1800587位点的等位基因频率差异有统计学意义(x2=12.69,P=0.000,OR=2.424,95％CI=1.472 ～ 3.993),rs2856836,rs2856838,rs3783525等位基因频率在H1N1组和对照组中差异则无统计学意义.H1N1组rs1800587位点CC纯合子频率低于对照组[72.5％(121/167)比87.0％(167/192),P＜0.05],杂合子(TC)频率高于对照组[25.1％(42/167)比12.5％(24/192),P＜0.05],而两组TT纯合子频率差异则不具有统计学意义.H1N1组rs2856836位点杂合子(TC)频率高于对照组[25.7％(43/167)比17.2％(33/192),P＜0.05],TT基因型与CC基因型频率在两组间差异均没有统计学意义.rs2856838位点对照组TT纯合子频率低于H1N1组[4.2％(8/192)比10.8％(18/167),P＜0.05],其余2种基因型TC与CC在两组间差异没有统计学意义.H1N1组rs3783525位点TTT纯合子频率高于对照组[21.0％ (35/167)比13.0％(25/192),P＜0.05],两组间的另两种基因型TC与CC差异也没有统计学意义.结论 IL-1α基因多态性位点rs1800587、rs2856836、rs2856838、rs3783525与甲型H1N1流感易感性相关.