低氧复合运动对大鼠骨骼肌线粒体含量的影响

 目的：探讨低氧复合运动对线粒体含量的影响及线粒体生物合成和自噬在其中的作用。方法：雄性SD大鼠随机分为常氧对照（NC）组、常氧运动（NT）组、低氧对照（HC）组和低氧复合运动（HT）组。低氧干预为常压低氧帐篷,11.3%氧浓度持续暴露4周。运动干预为跑台训练（5°,15 m/min）,60 min/d,每周5 d,共4周。JC-1荧光探针检测线粒体膜电位;萤光素酶法检测线粒体ATP合成能力;Western blotting检测骨骼肌过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1（PGC-1α）、线粒体转录因子A（Tfam）、Bcl-2/腺病毒E1B 19kD相互作用蛋白3（Bnip3）、苄氯素1（beclin-1）、细胞色素C氧化酶亚基IV（COXIV）和电压依赖性阴离子通道1（VDAC-1）蛋白表达量。结果：HC组与NC组比较,线粒体膜电位、ATP合成能力及COXIV、VDAC-1、PGC-1α和Tfam蛋白表达显著降低（P<005或P<001）,Bnip3和beclin-1蛋白表达显著升高（P<005）。HT组与HC组比较,线粒体膜电位、ATP合成能力及COXIV、VDAC-1、PGC-1α、Tfam、Bnip3和beclin-1蛋白表达均显著升高（P<005或P<001）。结论：慢性低氧暴露提高了线粒体自噬但抑制了线粒体生物合成,导致线粒体含量减少。低氧复合运动促进低氧状态下骨骼肌线粒体自噬,并促进线粒体生物合成,从而提高线粒体含量及功能。     

MicroRNA-30a调控Beclin-1对缺氧复氧乳鼠心肌细胞的保护效应

目的: 观察microRNA-30a(miR-30a)在原代心肌细胞缺氧复氧中的作用,探讨miR-30a保护缺血再灌注心肌的分子机制。方法: 重组构建慢病毒miR-30a表达载体(LV-GFP-miR-30a)感染原代乳鼠心肌细胞,构建缺氧复氧损伤模型。实验分为正常培养组、单纯缺氧复氧组、LV-GFP加缺氧复氧组、LV-miR-30a-GFP加缺氧复氧组和3-甲基腺嘌呤(3-MA)加缺氧复氧组。Real-time PCR检测缺氧复氧和慢病毒感染对miR-30a的表达影响,Western blotting检测LC3和Beclin-1蛋白表达变化,TUNEL和PI染色检测缺氧复氧后心肌细胞死亡情况。结果: (1)缺氧复氧后心肌miR-30a表达水平下调(P<0.05);(2)慢病毒miR-30a表达载体高效感染后心肌细胞miR-30a表达水平上调(P<0.05),心肌过表达miR-30a下调Beclin-1蛋白表达(P<0.05);(3)心肌过表达miR-30a抑制缺氧复氧后Beclin-1表达(P<0.05);3-MA处理减少缺氧复氧后心肌Beclin-1表达,减少缺氧复氧后LC3-Ⅰ转化为LC3-Ⅱ(P<0.05);(4)过表达miR-30a和3-MA处理减少缺氧复氧后心肌细胞凋亡(P<0.05)。结论: 心肌细胞过表达miR-30a显著下调Beclin-1;抑制自噬可以减少缺氧复氧后心肌细胞死亡。     

白藜芦醇调控miR-34a表达对骨肉瘤MG-63细胞生长、侵袭和自噬的影响

目的:探讨白藜芦醇通过调控微小RNA-34a(miR-34a)表达对骨肉瘤MG-63细胞生长、侵袭和自噬的影响。方法:将骨肉瘤MG-63细胞分为对照组及10、20、40、60和80μmol/L白藜芦醇处理组。采用MTT法、Transwell小室和Western blot实验检测各组骨肉瘤细胞的活力、侵袭能力及自噬蛋白表达;RT-q PCR检测各组骨肉瘤细胞中miR-34a的表达。转染miR-34a模拟物(miR-34a mimic)及阴性对照(miR-34a NC)至骨肉瘤细胞,检测miR-34a mimic和miR-34a NC在白藜芦醇处理后对骨肉瘤细胞活力和侵袭能力的影响,Western blot检测自噬标志蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和beclin-1的蛋白表达。结果:与对照组相比,不同浓度的白藜芦醇可抑制肿瘤细胞的活力和侵袭能力,促进自噬(P0.05)。白藜芦醇可上调肿瘤细胞中miR-34a的表达,并具有剂量依赖性(P0.05),同时促使LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高,beclin-1蛋白表达量上调(P0.05)。miR-34a mimic可增加白藜芦醇对骨肉瘤细胞活力和侵袭能力的抑制,并进一步促进自噬。结论:白藜芦醇可能通过上调miR-34a表达抑制骨肉瘤MG-63细胞生长并促进其自噬。     

miR-337靶向调节p53表达对结肠癌细胞自噬和迁移能力的影响

目的:研究微小RNA-337(miR-337)对结肠癌细胞自噬及迁移能力的影响并从靶向调节p53表达的角度探讨其可能机制。方法:采用免疫组化方法检测结肠癌组织中beclin-1、LC3B和p53蛋白的表达,分析beclin-1和LC3B蛋白的表达与临床病理特征的相关性及p53与beclin-1和LC3B蛋白表达的相关性。小干扰RNA敲减p53基因表达后电镜观察结肠癌细胞株HCT116中自噬小体的形成,Western blot检测beclin-1和LC3B蛋白的表达。生物信息学预测筛选靶向p53的miRNAs并用RT-qPCR方法验证在HCT116细胞中的表达,萤光素酶报告检测miR-337对p53基因的调控作用。过表达miR-337后用Western blot检测p53及beclin-1和LC3B的表达,Transwell实验检测HCT116细胞的迁移能力。结果:与癌旁黏膜组织相比,beclin-1和LC3B蛋白在结肠癌组织中表达降低,与结肠癌的发生发展以及侵袭、转移显著相关。p53在结肠癌组织中表达升高,与beclin-1和LC3B蛋白的表达显著负相关。敲减p53基因的表达使beclin-1和LC3B蛋白表达上调;过表达miR-337和敲减p53蛋白表达可使beclin-1和LC3B的蛋白表达上调,HCT116细胞迁移能力降低(P0.05)。结论:miR-337可促进结肠癌细胞自噬,抑制其迁移能力,其机制可能与靶向抑制p53表达有关。     

中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白对肾小管上皮HK-2细胞缺氧/复氧损伤的保护作用及机制

目的观察中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)在HK-2肾小管上皮细胞缺氧/复氧损伤中的作用以及对自噬的调控作用。方法设计并合成3组NGAL基因的特异性短发夹RNA(shRNA)序列并转入HK-2细胞,实时定量PCR检测HK-2细胞中NGAL mRNA水平、Western blot法检测NGAL蛋白水平,筛选抑制效率最佳的一组用于后续实验。对NGAL敲减的HK-2细胞进行缺氧/复氧处理,检测微管相关蛋白1轻链3(LC-3)Ⅱ和beclin-1表达水平,并用Cell Titer-Blue细胞活性检测系统和CCK-8法检测细胞活力。结果成功构建3组NGAL基因沉默shRNA质粒,转染HK-2细胞后NGAL mRNA和蛋白水平表达均低于空白载体对照;缺氧/复氧处理后,NGAL敲减的HK-2细胞LC-3Ⅱ和beclin-1表达水平低于空白载体对照,而外加400 ng/m L NGAL的HK-2细胞LC-3Ⅱ及beclin-1水平高于缺氧/复氧对照;用Cell Titer-Blue和CCK-8法检测NGAL敲减组的细胞活力均低于空白载体对照组。结论 NGAL在HK-2肾小管上皮细胞缺氧/复氧损伤起一定保护作用,可能与增强自噬相关。     

miR-103在妊娠糖尿病患者胎盘组织中的表达及其对滋养细胞自噬的影响

目的 探讨妊娠糖尿病（GDM）患者胎盘组织miR-103表达水平及其对滋养细胞自噬的影响。方法 收集2019年1月至2019年12月40例GDM患者及40例正常孕妇胎盘组织。对HTR-8/SVneo细胞进行不同转染,分为Model组（高糖培养基培养）,miR-NC组（转染miR-NC）,miR-103组（转染miR-103 mimics）,Si-miR-103组（转染miR-103 inhibitor）。流式细胞术检测细胞凋亡;透射电镜观察细胞超微结构;溶酶体红色荧光探针（lyso-tracker red）观察细胞自噬;反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测胎盘组织、细胞miR-103表达;Western blot检测胎盘组织、细胞自噬相关蛋白3Ⅰ（LC3Ⅰ）、自噬相关蛋白3Ⅱ（LC3Ⅱ）、Beclin1、p62表达。结果 与正常孕妇胎盘组织比较,GDM孕妇胎盘组织miR-103表达降低,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin1表达升高,p62表达降低（P<0.05）。与NC组比较,Model组miR-103表达降低,细胞凋亡率、自噬小体/细胞浆总面积比值升高,LC3-Ⅱ/LC3...     

黄芪甲苷与人参皂苷Rg1配伍对PC12细胞氧糖剥夺复糖复氧后细胞自噬和PI3K信号通路的影响

目的:探讨黄芪甲苷和人参皂苷Rg1配伍对PC12细胞氧糖剥夺后再复糖复氧(oxygen glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)诱导的细胞自噬的影响及作用机制。方法:以PC12细胞建立OGD/R自噬性损伤模型,观察黄芪甲苷与人参皂苷Rg1配伍对细胞自噬的影响,并通过PI3KⅠ/Akt/m TOR和PI3KⅢ/beclin-1/Bcl-2信号通路研究黄芪甲苷与人参皂苷Rg1配伍的作用机制。结果:氧糖剥夺2 h复糖复氧24 h后,PC12细胞内LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白比值增加。黄芪甲苷、人参皂苷Rg1及黄芪甲苷与人参皂苷Rg1配伍均能下调OGD/R后PC12细胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白比值,且配伍组的效应强于药物单用组。机制研究表明,人参皂苷Rg1单用及黄芪甲苷和人参皂苷Rg1配伍能升高PI3KⅠ、Akt、m TOR蛋白磷酸化水平,配伍的效应强于药物单用;黄芪甲苷单用及黄芪甲苷和人参皂苷Rg1配伍均能抑制PI3KⅢ、beclin-1蛋白表达,而配伍还能上调Bcl-2蛋白表达,且配伍的效应强于药物单用组。结论:PC12细胞在缺糖缺氧2 h再复糖复氧24 h后,细胞出现自噬;黄芪甲苷和人参皂苷Rg1均能减轻OGD/R诱导的PC12细胞自噬,且2者配伍对细胞自噬具有协同抑制作用,其机制可能与调节PI3KⅠ/Akt/m TOR和PI3KⅢ/beclin-1/Bcl-2信号通路有关。     

miR-142-3p通过调控Hmgb1抑制雨蛙素诱导的大鼠胰腺外分泌细胞系AR42J凋亡

目的 探讨miR-142-3p调控Hmgb1对大鼠胰腺外分泌细胞系AR42J凋亡的影响。方法 将AR42J细胞分为空白组(blank)、急性胰腺炎模型组(AP,100 nmol/L雨蛙素作用24 h),再分别用miR-142-3p mimics、 mimics NC、miR-142-3p inhibitor和inhibitor NC转染模型组细胞,记为miR-142-3p mimics组、 mimics NC组、miR-142-3p inhibitor组和inhibitor NC组。用RT-qPCR检测细胞中miR-142-3p表达;Western blot检测HMGB1、caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表达;Hoechst染色测定细胞凋亡;流式细胞测量术检测细胞凋亡率;双荧光素酶报告基因实验明确miR-142-3p和Hmgb1的靶向关系。结果 与空白组相比,AP组中miR-142-3p表达水平显著下调(P<0.01),HMGB1、caspase-3蛋白表达量上调(P<0.05),Bax蛋白表达量显著上调(P<0.01),Bcl-2蛋白表达量显著降低(P&l...     

沉默信息调节因子1对缺氧心肌细胞凋亡和自噬的影响

目的:分析沉默信息调节因子1(Sirt1)对缺氧条件下心肌细胞凋亡和自噬的影响。方法:将心肌H9c2细胞分为Control组、Hypoxia组(缺氧处理24h)、NC+Hypoxia组(转染阴性对照并缺氧处理24h)和Sirt1+Hypoxia组(转染Sirt1过表达载体并缺氧处理24h)。以qRT-PCR和Western blot测定心肌细胞中Sirt1mRNA和蛋白表达水平,MTT方法评估细胞存活率,流式细胞术测定细胞总凋亡水平,Western blot检测凋亡蛋白Bax、Cleaved Caspase-3水平和自噬蛋白LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1水平。结果:与Control组比较,Hypoxia组细胞中Sirt1mRNA和蛋白表达水平降低,细胞存活率降低,细胞凋亡率和Bax、Cleaved Caspase-3蛋白水平升高,LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1蛋白水平降低(P0.05)。与NC+Hypoxia组比较,Sirt1+Hypoxia组细胞中Sirt1mRNA和蛋白表达水平升高,细胞存活率升高,细胞凋亡率和Bax、Cleaved Caspase-3蛋白水平降低,LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1蛋白水平升高(P0.05)。结论:Sirt1可抑制缺氧心肌细胞凋亡并诱导细胞自噬。     

LncRNA TUG1/miR-525-5p/NLRC5在缺氧复氧大鼠心肌细胞中的作用机制研究

目的探讨长链非编码RNA牛磺酸上调基因1(TUG1)对缺氧复氧心肌细胞焦亡、自噬的影响及调控机制。方法建立缺氧复氧大鼠心肌细胞H9c2损伤模型;实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RTqPCR)法检测TUG1、miR-525-5p、NOD样受体家族CARD结构域包含分子5(NLRC5)在细胞中的表达;用脂质体分别转染pcDNA-TUG1、si-TUG1、miR-525-5p mimics、anti-miR-525-5p、pcDNA-NLRC5、si-NLRC5至H/RH9c2细胞;或共转染pcDNA-TUG1和miR-525-5pmimics、 miR-525-5pmimics和pcDNA-NLRC5至H/R H9c2细胞;双荧光素酶报告基因检测细胞的荧光活性。流式细胞术检测细胞焦亡率;Western blot检测细胞自噬标志基因自噬相关基因(Beclin1)、微管相关蛋白轻链3(LC3),焦亡相关基因核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)、半胱氨酸天冬氨酸酶(caspase-1)的蛋白表达。结果与H9c2细胞相比,H/R H9c2细胞中TUG1、NLRC5表达显著升高,miR-525-5p表达显著降低(P0.05)。TUG1能够靶向miR-525-5p,miR-525-5p又可靶向NLRC5。过表达TUG1可明显增强H/R对H9c2细胞的焦亡诱导和自噬抑制作用,并上调NLRP3、caspase-1,下调Beclin1、LC3。回复miR-525-5p能够部分逆转TUG1对H/R H9c2细胞的调控,回复NLRC5也可部分逆转miR-525-5p对H/R H9c2细胞的调控作用。结论 LncRNA TUG1促进缺氧复氧心肌细胞焦亡,抑制自噬的机制与靶向miR-525-5p/NLRC5通路相关。     

缺氧复氧致心肌AC16细胞损伤途径的研究

目的:探讨缺氧复氧条件下不同复氧时间致心肌细胞损伤的途径。方法:培养人心肌AC16细胞,先置入1%O_2、无糖无血清条件下培养24 h,再更换含10%胎牛血清的低糖DMEM联合21%O_2进行不同时间的复氧培养,采用CCK-8法检测细胞活力,并通过Western blot法检测不同细胞损伤途径标记分子的蛋白水平,如细胞自噬相关蛋白LC3-II/-I、细胞焦亡相关蛋白caspase-1和gasdermin D及凋亡相关蛋白caspase-3、Bax和Bcl2。结果:与空白对照组相比,各缺氧复氧组细胞活力降低,且随复氧时间延长,细胞活力相应持续降低(P0.05),同时缺氧组LC3-II/-I上调(P0.05),而复氧后LC3-II/-I较缺氧组下降,但仍高于对照组;此外,cleaved caspase-1和cleaved gasdermin D蛋白在复氧6 h组和复氧12 h组表达水平上调(P0.05); cleaved caspase-3水平和Bax/Bcl2在复氧12 h组上调(P0.05)。结论:缺氧致心肌AC16细胞的自噬上调,并随复氧时间增加自噬水平减弱,且在复氧过程中细胞焦亡的激活早于细胞凋亡。     

miR-142-5p 靶向 MCL-1 对胆管癌细胞上皮-间质转化及吉西他滨 化疗敏感性的影响

目的 探讨 miR-142-5p 靶向髓细胞白血病因子 1 (myeloid cell leukemin-1, MCL-1) 对人胆管癌 细胞 QBC939 上皮间质化 (epithelial-mesenchymal transition, EMT) 及吉西他滨 (Gemcitabine, GEM) 化疗 敏感性的影响。 方法 体外培养胆管癌细胞 QBC939 及人正常胆管上皮细胞 HIBEC, 随机分为对照组、 miR-142-5p 阴性对照 (NC) 组和 miR-142-5p 模拟物 (mimics) 组。 实时荧光定量 PCR (RT-qPCR) 法检 测各组 QBC939 细胞和 HIBEC 细胞中 miR-142-5p 和 MCL-1 mRNA 表达情况; 划痕实验和 Transwell 实验分别 检测各组 QBC939 细胞迁移和侵袭变化情况; 蛋白印迹分析法检测各组 QBC939 细胞上皮型钙黏蛋白 (E-cadherin)、 神经性钙黏附蛋白 (N-cadherin) 和波形蛋白 (Vimentin) 表达变化; 双荧光素酶报告实验验证 miR-142-5p 与 MCL-1 的靶向关系; 使用浓度为 0. 625 μg / mL GEM 处理转染 miR-142-5p 后的 QBC939 细胞, 同时设置对照组, MTT 检测细胞增殖, Annexin V-FITC/ PI 试剂盒检测细胞凋亡。 结果 与人正常胆管细胞 HIBEC 相比, 胆管癌细胞 QBC939 中 miR-142-5p 呈低表达, MCL-1 mRNA 呈高表达。 经 Targetscan Human 数据库预测显示, miR-142-5p 与 MCL-1 mRNA 3′UTR 区有结合位点。 与 MCL-1-3′UTR-WT + miR-142-5p NC 组比较, MCL-1-3′UTR-WT + miR-142-5p mimics 组荧光素酶活性降低 (P< 0. 05)。 与对照组和 miR-142-5p NC 组相比, miR-142-5p mimics 组 QBC939 细胞 miR-142-5p 表达水平、 E-cadherin 蛋白表达水平显著升高 (P< 0. 05), MCL-1 mRNA 和蛋白表达、 N-cadherin、 Vimentin 蛋白表达水平显著降低 (P< 0. 05), 细胞迁 移、 侵袭能力显著减弱 (P< 0. 05); 与 miR-142-5p NC + GEM 组相比, miR-142-5p mimics + GEM 组 QBC939 细胞存活率显著降低, 凋亡率增加 (P< 0. 05)。 结论 过表达 miR-142-5p 可通过靶向抑制 MCL-1 表达从而 抑制人胆管癌细胞的 EMT、 增加胆管癌细胞对 GEM 的化疗敏感性。     

低氧环境运动对营养性肥胖大鼠心肌细胞自噬相关蛋白表达的影响

目的:研究低氧环境运动对营养性肥胖大鼠心肌细胞自噬相关蛋白LC3、beclin-1、p62和AMPKα2表达的影响,为低氧环境运动改善机体形态和促进心肌组织自噬的保护功能提供实验依据。方法:7周高脂膳食诱导SD大鼠营养性肥胖模型,建模成功后随机分为常氧对照(NC)组、常氧运动(NE)组、16.3%低氧环境安静(HC1)组、16.3%低氧环境运动(HE1)组、13.3%低氧环境安静(HC2)组和13.3%低氧环境运动组(HE2),每组10只,各组均维持高脂饲料喂养。运动组大鼠进行1周适应性跑台训练,正式训练跑速为20 m/min,运动时间40 min/d,每周5 d,跑台坡度0°,持续8周。末次训练24 h后,处死大鼠并采样,采用Western blot技术检测大鼠心肌beclin-1、LC3、p62和AMPKα2的表达水平。结果:8周低氧环境耐力运动后,与NC和HC1组相比,NE、HE1和HE2组大鼠体重和Lee指数显著降低(P0.05),心脏重量指数显著升高(P0.05);HE1和HE2组体重显著低于NE组(P0.05)。Western blot结果显示,NE和HE1组大鼠心肌AMPKα2蛋白表达显著低于NC组(P0.05),而HE2组AMPKα2蛋白表达显著高于NC组(P0.05),且显著高于其他组(P0.05);HC2、HE1和HE2组beclin-1蛋白表达显著高于NC组(P0.05),HE1和HE2组beclin-1蛋白表达显著高于NE组(P0.05);其他各组LC3-II/LC3-I比值显著高于NC组(P0.05),而p62蛋白表达显著低于NC组(P0.05);HE1和HE2组LC3-II/LC3-I比值显著高于HC1组(P0.05),HE2组LC3-II/LC3-I比值显著高于NE组(P0.05)。结论:低氧环境运动可改善营养性肥胖大鼠形态,升高心脏重量指数。低氧环境或(和)运动均可上调beclin-1和LC3蛋白表达,下调p62蛋白表达,增强心肌细胞自噬水平,可能有利于提高对心肌细胞的保护功能。     

DJ-1拮抗ROS介导Beclin-1上调在缺氧复氧HL-1心肌细胞中的作用

 目的 探讨DJ-1拮抗氧化应激诱导过度自噬在缺血再灌注心肌损伤中的保护机制。方法 以慢病毒为shRNA DJ-1载体感染心肌HL-1细胞系构建缺氧复氧损伤模型。Western blot检测shRNA DJ-1沉默效率和LC3、Beclin-1和DJ-1蛋白表达,流式细胞术AnnexinⅤ和PI染色分别检测凋亡和坏死,MDC和DCFH-DA染色分别检测细胞内自噬体和氧自由基（ROS）水平,激光共聚焦显微镜观察细胞内自噬体数量变化。结果 1）慢病毒为shRNA DJ-1载体感染心肌HL-1细胞后DJ-1表达水平下调;2）缺氧复氧显著上调ROS,而shDJ-1加剧缺氧复氧ROS水平上调,NAC可以有效下调细胞内ROS水平;3）Western blot检测LC3、Beclin-1自噬标志蛋白和MDC染色细胞内自噬体结果均认为缺氧复氧促进自噬,而shDJ-1加剧缺氧复氧导致的自噬上调,NAC抑制自噬上调;4）流式细胞术检测显示shDJ-1增加缺氧复氧凋亡,NAC可以减少心肌细胞凋亡。 结论 DJ-1拮抗ROS介导beclin-1上调参与保护缺血再灌注心肌。     

NOD8抑制人胰腺癌细胞自噬及凋亡对其自噬作用的影响

目的:探讨NOD8(也称NLRP10或PYNOD)是否能抑制胰腺癌细胞发生自噬及其可能机制,并研究凋亡对NOD8调控自噬的影响。方法:用JetPRIME阳离子聚合物将空质粒pEGFP-C2和重组质粒pEGFP-NOD8分别转染入胰腺癌Panc-1细胞,并设立空白对照组,48 h后应用Western blot检测NOD8蛋白、自噬相关蛋白(beclin-1和LC3-Ⅱ)以及磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路相关蛋白(Akt、p-Akt、mTOR和p-mTOR)的表达;并采用免疫荧光染色法观察细胞LC3斑点的数量。此外,用caspase抑制剂Z-VAD-FMK作用于过表达NOD8的Panc-1细胞后,Western blot检测beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白的表达水平;免疫荧光染色法观察细胞LC3斑点数量。结果:pEGFP-NOD8组细胞NOD8蛋白表达明显高于对照组和pEGFP-C2组(P0.01)。与对照组和pEGFP-C2组相比,pEGFP-NOD8组细胞beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表达及细胞LC3斑点数量显著降低;并且pEGFP-NOD8组细胞p-Akt及p-mTOR蛋白表达量显著上升(P0.01),而AKT和mTOR蛋白表达无明显差异。与pEGFP-NOD8组相比,pEGFP-NOD8+Z-VAD-FMK组细胞beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表达水平及LC3斑点数量显著高于pEGFP-NOD8组。结论:NOD8可抑制Panc-1细胞自噬,其机制可能与激活PI3K/Akt/mTOR通路有关;凋亡可增强NOD8对自噬的抑制作用。     

程序化细胞死亡因子5对缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡和自噬的影响及机制

目的:探讨程序化细胞死亡因子5(PDCD5)对缺氧/复氧(H/R)诱导的心肌细胞凋亡和自噬的影响及其作用机制。方法:以H9c2心肌细胞系为研究对象,建立H/R损伤模型,采用RNA干扰方法抑制PDCD5的表达,MTT法检测心肌细胞的存活率,TUNEL显色法检测细胞凋亡率,RT-qPCR和Western blot法分别检测mRNA和蛋白的表达水平。结果:H/R损伤的H9c2心肌细胞中,PDCD5表达水平升高,同时细胞的存活率降低,细胞凋亡率和自噬水平增加,而PDCD5沉默能够增加细胞存活率,同时减少细胞凋亡率,促进Bax表达且抑制抑Bcl-2、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及自噬相关蛋白beclin-1的表达。此外,沉默PDCD5可通过降低p-P65的蛋白水平抑制NF-κB通路。结论:沉默PDCD5通过阻断NF-κB信号通路而抑制H/R损伤诱导的心肌细胞凋亡和自噬,从而保护心肌细胞。     

京尼平对缺氧/复氧损伤后大鼠心肌细胞凋亡及自噬的影响

目的 探讨京尼平对缺氧/复氧(H/R)损伤后大鼠心肌细胞凋亡及自噬的影响。方法 建立H/R损伤模型,体外培养的大鼠H9c2心肌细胞行缺氧12 h、复氧4 h。实验分为对照组（Con）、京尼平组(GE)、缺氧/复氧组(H/R)、缺氧/复氧+京尼平组(H/R+GE)。细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测细胞存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡,透射电子显微镜观察自噬体,Western blotting检测Bax、Bcl-2、P62、Beclin1、LC3-Ⅱ、蛋白激酶B(Akt)、p-Akt、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）和p-mTOR蛋白的表达。结果 京尼平预处理增强了H/R损伤后的H9c2心肌细胞活力,抑制细胞凋亡及自噬体累积,降低自噬结构断面积与细胞质断面积的比值。Western blotting结果显示,京尼平预处理减少了H/R损伤后Bax、LC3-Ⅱ和Beclin1蛋白表达,增加Bcl-2、P62、p-Akt和p-mTOR蛋白表达。结论 京尼平可以抑制H/R损伤后心肌细胞凋亡及自噬,其机制可能与上调Akt/mTOR信号通路有关。     

鞣花酸通过降低自噬作用减轻缺氧缺血性脑损伤

目的:探究鞣花酸(EA)能否通过降低自噬减轻缺氧缺血性脑损伤。方法:将17只Sprague-Daw-ley(SD)大鼠的7日龄乳鼠随机分组为假手术组(n=5)、缺氧缺血性脑病(HIE)组(n=6)和HIE+鞣花酸预给药组(n=6)。将鞣花酸(10 mg/kg)混悬于玉米油(10 m L/kg)中,对预给药组的乳鼠进行灌胃。各组动物手术24 h后取大脑组织切片进行TTC染色和HE染色,以判断鞣花酸在体内的脑保护作用。利用Western blot技术检测损伤侧脑部皮质区的蛋白及PC12细胞中自噬相关指标(beclin-1、P62、LC3-II/-I和Atg5)的表达水平。利用氯化钴(800μmol/L)制作PC12细胞缺氧处理的模型,观察预给药组中鞣花酸(8μmol/L)对氯化钴处理后的细胞保护作用,利用CCK-8法检测细胞活力,流式细胞术检测氧化应激水平,单丹磺酰戊二胺(MDC)免疫荧光染色观察胞内的自噬情况,四甲基罗丹明乙酯(TMRE)荧光染色检测线粒体膜电位水平,以明确鞣花酸是否通过调节自噬机制达到减轻体外神经元缺氧损伤的目的。结果:7日龄乳鼠造模后HIE组脑部梗死面积较大,HE染色显示脑组织水肿及结构完整性破坏,神经元少见;鞣花酸预给药组脑部梗死面积减少,HE染色显示脑组织仅部分损伤,神经元分布较HIE组数量多且结构完整。提取HIE组乳鼠的脑组织皮质蛋白,发现Atg5、beclin-1和LC3-II/-I的蛋白表达水平显著高于正常组(P 0.01),而P62蛋白的表达水平降低(P 0.01);鞣花酸预处理后Atg5、beclin-1和LC3-II/-I蛋白表达水平均低于HIE组(P 0.01),而P62蛋白的表达呈现较高趋势(P 0.01)。氯化钴处理组的PC12细胞具有高氧化应激水平(P 0.01),鞣花酸有降低氧化应激的趋势(P 0.05)。另外,鞣花酸预处理组线粒体膜电位水平升高(P 0.05)。MDC荧光染色发现,相较于氯化钴处理组的MDC高荧光定量与自噬小体数量增多的趋势(P 0.01),鞣花酸确能减少PC12细胞内自噬小体的数量,减轻自噬强度,从而发挥细胞保护作用(P 0.01)。PC12细胞经氯化钴处理后,与正常组相比,其Atg5、beclin-1和LC3-II/-I的蛋白呈现高水平表达(P 0.01),而P62蛋白表达水平降低(P 0.01);鞣花酸预处理后的PC12细胞中,Atg5、beclin-1和LC3-II/-I蛋白表达水平均降低(P 0.01),而P62蛋白表达水平呈现显著升高(P 0.01)。结论:体内外初步实验表明,对缺氧缺血性脑损伤预给予鞣花酸可通过降低体内外神经元内过度自噬起到神经保护作用。     

远程缺血后处理抑制心肺复苏后大鼠海马神经细胞自噬

目的:观察远程缺血后处理(RIPostC)对心肺复苏后(CPR)大鼠海马神经细胞自噬水平的影响。方法:45只雄性SD大鼠随机分为假手术组(sham组)、心脏停搏(CA)/CPR组和RIPostC组,每组15只。通过夹闭气管导管建立窒息性CA/CPR模型。在自主循环恢复(ROSC)后不同时点进行神经功能缺损评分(NDS),ROSC后24 h处死大鼠并取出海马组织,Western blot法检测海马神经细胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和beclin-1蛋白的表达,TUNEL法检测细胞凋亡,免疫荧光观察LC3颗粒形成,透射电镜观察细胞自噬小体和线粒体的超微结构形态学变化。结果:与sham组相比,CA/CPR组NDS评分降低,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和beclin-1蛋白表达均升高(P0.05),神经细胞凋亡增多(P0.05);与CA/CPR组相比,RIPostC组的NDS评分升高,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和beclin-1表达下降(P0.05),神经细胞凋亡减少(P0.05),LC3颗粒形成减少,细胞内自噬小体减少,线粒体结构损伤减轻。结论:远程缺血后处理可改善心肺复苏后大鼠神经功能,这可能与抑制海马神经细胞过度自噬有关。     

雷帕霉素减轻氧糖剥夺对SH-SY5Y细胞的损伤

目的:观察雷帕霉素(Rapa)对氧糖剥夺(OGD)的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的影响,并探讨自噬在其中的作用。方法:SH-SY5Y细胞随机分为4组:正常对照组(常规培养,不进行OGD处理)、Rapa组、OGD组(无糖培养基、1%O_2的三气培养箱内孵育细胞12 h)和Rapa+OGD组。进行形态学观察;MTT法检测细胞活力;乳酸脱氢酶(LDH)漏出率判断细胞损伤的程度;caspase-3活性检测试剂盒检测酶活性;原位末端标记(TUNEL)法检测凋亡水平;Western blot法检测凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2、自噬标志蛋白LC3B-Ⅱ及自噬调控蛋白beclin-1的表达。结果:与OGD组相比,Rapa+OGD组的细胞存活率明显升高(P0.05),LDH漏出率及caspase-3酶活性明显降低(P0.05)。TUNEL染色观察结果显示,与OGD组相比,Rapa+OGD组的细胞凋亡明显减少(P0.05);Western blot实验结果显示Rapa+OGD组的Bcl-2、beclin-1及LC3B-Ⅱ蛋白的表达水平显著高于OGD组(P0.05),而Bax蛋白水平明显低于OGD组(P0.05)。结论:Rapa对OGD损伤的SH-SY5Y细胞具有保护作用,其机制可能与上调beclin-1蛋白、激活自噬有关。