血管内皮生长因子基因重组腺病毒载体的构建

目的 :构建携带人血管内皮生长因子基因的重组腺病毒载体。方法 :将人源性的 VEGF1 6 5c DNA正向插入到穿梭质粒 p HCMVSP1A的 CMV启动子之下 ,构建重组质粒 ,通过脂质体与 p JM17共转染 2 93细胞 ,经同源重组获得携带人 VEGF1 6 5基因的重组腺病毒 ,通过 PCR扩增法鉴定所构建的腺病毒 ,扩增、纯化并测定滴度。结果 :人VEGF1 6 5c DNA成功地正向插入到 p HCMVSP1A载体中 ,以重组病毒基因组 DNA为模板 ,同时扩增出 5 76 bp的VEGF1 6 5c DNA基因片段和 86 0 bp的腺病毒骨架基因片段 ,证实了所构建病毒的正确性 ,病毒滴度为 2 .5× 10 9pfu/ m l。结论 :成功构建了表达人 VEGF1 6 5基因重组腺病毒载体 ,使 VEGF基因的高效转染成为可能     

腺病毒载体介导的VEGF基因转染对C17.2神经干细胞凋亡的影响

[目的]探讨重组腺病毒介导血管内皮生长因子(VEGF)165基因对缺氧状态下对神经干细胞凋亡的作用.[方法]体外培养C17.2神经干细胞,建立神经干细胞缺氧模型;将携带人类VEGF基因的重组腺病毒感染C17.2神经干细胞;Western-blot法检测VEGF蛋白的表达;流式细胞术测定细胞凋亡率;Hoechst33342染色荧光显微镜观察凋亡小体.[结果]转染pAdCMV VEGF165的C17.2神经干细胞成功表达VEGF蛋白;缺氧后神经干细胞凋亡率为(19.98%±0.55%),转染pAdCMV VEGF165后的细胞凋亡率为(10.38%±0.48%,P＜0.01),而转染pAdCMV VEGF165 VEGF反义寡核脱氧核酸经干细胞凋亡率为(19.07%±0.64%),与对照组无显著差异(P＞0.05).[结论]腺病毒介导的VEGF165基因能成功表达VEGF;外源性VEGF对C17.2神经干细胞具有抗凋亡作用,能够提高C17.2神经干细胞对缺氧的耐受性,有利于神经干细胞的生存.     

腺病毒载体介导的VEGF基因转染对C17.2神经干细胞凋亡的影响

目的探讨重组腺病毒介导血管内皮生长因子(VEGF)165基因治疗对缺氧状态下对神经干细胞凋亡的作用。方法体外培养C17.2神经干细胞,建立神经干细胞缺氧模型。将携带人类VEGF基因的重组腺病毒感染C17.2神经干细胞,Western-blotting分析VEGF蛋白的表达,并用流式细胞术测定细胞凋亡率的变化。Hoechst33342染色荧光显微镜观察凋亡小体。结果转染pAdCMVVEGF165的C17.2神经干细胞成功表达VEGF蛋白;缺氧后神经干细胞凋亡率为(19.98±0.55)%,而转染pAdCMVVEGF165后的细胞凋亡率为(10.38±0.48)%(P<0.01),转染pAdCMVVEGF165 VEGF反义寡核脱氧核酸经干细胞凋亡率为(19.07±0.64)%,与对照组无显著差异(P>0.05)。结论腺病毒介导的VEGF165基因能高效表达VEGF;外源性VEGF对C17.2神经干细胞具有抗凋亡作用,能够提高C17.2神经干细胞对缺氧的耐受性,有利于神经干细胞的生存。     

重组腺病毒介导血管内皮生长因子基因在骨髓间充质干细胞中的表达及其影响

目的观察重组腺病毒介导血管内皮生长因子基因(AdVEGF165)转染后大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)中血管内皮生长因子的表达情况以及腺病毒载体对大鼠骨髓间充质干细胞的生长影响情况。方法体外培养大鼠骨髓间充质干细胞,用腺病毒载体转染BMSCs。采用ELISA法检测血管内皮生长子因子(VEGF)的表达和分泌。转染后用胰酶消化传代培养,MTT法绘制细胞生长曲线。结果AdVEGF165转染组上清液中VEGF蛋白表达量极显著高于空白对照组(P<0.01)。且AdVEGF165转染BMSCs后,生长曲线与正常培养细胞无显著差异(P>0.05)。结论重组腺病毒载体能够在BMSCs中介导VEGF的表达,且对BMSCs生长无影响。     

人血管内皮生长因子C基因真核表达载体的构建

目的：构建人血管内皮生长因子C(vascular endothelial growth factor C，VEGF-C)基因的真核表达载体，以便进一步研究VEGF-C基因在淋巴管生成中的作用。方法：根据人VEGF-C的cDNA序列，设计合成一对5′端分别含有EcoR I和BamH I酶切位点的特异性引物，运用RT-PCR方法克隆人乳腺癌细胞MDA-MB-231中的VEGF-C cDNA(1．26Kb；回收PCR产物(1．28Kb），并将其连接至克隆载体pMDl8-T中；重组的pMDl8-T在大肠杆菌DH5α内扩增后，经质粒提取、EcoR I和BamH I酶切，筛选出阳性重组子，并进行基因测序鉴定；琼脂糖凝胶电泳回收含有VEGF-C cDNA全长的酶切片断(1．27Kb)，然后在DNA连接酶作用下将其与真核表达载体pcDNA3．1(-)连接，重组质粒经EcoR I和BamH I酶切予以鉴定。结果：RT-PCR产物合有VEGF-C cDNA，基因测序显示重组的pMDl8-T中含有正确的人VEGF-C cDNA全长序列，重组的pcDNA3．1（-)中含有人VEGF-C cDNA全长序列。结论：成功构建了人类VEGF-C真核表达载体VEGF-C／pcDNA3．1（-)。     

腺病毒介导的反义血管内皮生长因子基因转染治疗胰腺癌的实验研究

目的：构建并鉴定反向插入VEGF165cDNA的重组腺病毒,探讨腺病毒介导的VEGF165反义核酸治疗胰腺癌的可行性。方法：应用基因重组技术，将513bp的人VEGF165cDNA反向克隆入腺病毒粘粒载体pAxCAwt。重组粘粒与腺病毒DNA－TPC混合后以磷酸钙共沉淀法转染293细胞制备重组腺病毒。建立胰腺癌裸鼠皮下种植瘤模型，瘤体内直接注射重组腺病毒，观察肿瘤的生长及血管生长情况。结果：成功构建了反向插入VEGF165cDNA的腺病毒粘粒载体pAxCAwt-αVEGF并制备出高滴度的重组腺病毒。实验第5周时肿瘤生长速度Ad-αVEGF治疗组比PBS和Ad-LacZ对照组均明显减慢（P＜0．01）；肿瘤微血管密度Pd-αVEGF治疗组比两个对照组均明显减少（P＜0．01）。结论：腺病毒介导的VEGF165反义核酸可以抑制胰腺癌的血管生成和肿瘤的生长，为抗血管生成的基因治疗提供了实验依据。     

人血管内皮细胞生长因子165基因真核表达载体构建

目的获得人血管内皮生长因子（hVEGF165）cDNA,构建其真核表达载体。方法采用PCR技术,从HL60细胞中扩增出hVEGF165 cDNA,将其克隆至pcDNA3真核表达载体上,构建成为pCD-hVGEF165重组质粒。结果经酶切鉴定,克隆的基因片段为人hVGEF165 cDNA;建立了pCD-hVGEF165重组质粒。结论成功地克隆和表达出了人VEGF165基因,为大量制备重组质粒的研究奠定了基础。     

人血管内皮细胞生长因子165基因真核表达载体的构建及其在大肠杆菌的表达

目的　获得人血管内皮生长因子 (hVEGF165)cDNA ,构建真核表达载体 ,并研究其在大肠杆菌中的表达情况。方法　采用PCR方法 ,从HL6 0细胞中扩增出hVEGF165cDNA ,将其克隆至 pcDNA3 真核表达载体上 ,构建成为 pCD hVEGF165重组质粒。将重组质粒转染感受态的大肠杆菌BL2 1(DE3)中进行表达 ,用Westernblot检测表达产物。结果　经酶切鉴定及基因测序证实hVEGF165cDNA基因克隆成功 ,并建立了高效表达的 pCD hVEGF165重组质粒。Westernblot检测表明 ,组建了具有高效表达hVEGF165的大肠杆菌菌株。结论　成功地克隆和表达出了hVEGF165基因 ,为进一步建立VEGF转基因动物模型 ,研究其在视网膜新生血管性疾病中的应用奠定了基础     

腺病毒介导血管内皮细胞生长因子基因体外转染骨髓间充质干细胞

【目的】探讨腺病毒介导血管内皮细胞生长因子（VEGF165）基因转染大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）后目的基因表达情况及对MSCs增殖分化的影响。【方法】构建含VEGF基因的腺病毒表达载体，利用贴壁法分离培养MSCs后，用荧光显微镜和流式细胞仪检测转染效果和转染率，用免疫组化、Western—Blot和ELISA方法分别检测VEGF基因转染MSCs后VEGF的表达情况。【结果】腺病毒介导的VEGF基因对于MSCs具有很高的转染效率，转染效率与病毒感染复制数（multipcyties of infection，MOI）具有量效关系。MOI为150倍时，转染效率〉95％，转染VEGF后，MSCs可有效表达VEGF，9d时达到表达高峰（1125pg／mL），13d后仍可检测到VEGF的表达。转染VEGF对MSCs的增殖分化没有明显影响。【结论】腺病毒介导的VEGF基因可以有效的转染MSCs，MSCs是一种理想的基因载体细胞，其携带的VEGF基因可获得较高的表达水平。     

人碱性成纤维细胞生长因子腺病毒表达载体的构建及其在人脐静脉内皮细胞中的表达

目的:构建人碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast cell growth factor,bFGF)腺病毒载体,并观察其在体外血管内皮细胞中的表达.方法:采用同源重组的方法,构建重组腺病毒Ad5-bFGF.携有绿色荧光蛋白(green fluorescence protein, GFP)的Ad5腺病毒转染人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC),检测最佳转染复数.Ad5-bFGF体外转染HUVEC,免疫细胞化学法、Western印迹法检测bFGF蛋白的表达.结果:Ad5转染HUVEC的最佳转染复数为200,转染率为90%.免疫细胞化学法和Western印迹结果显示bFGF基因以Ad5为载体可以在HUVEC的胞质和胞核表达,并且表达量较未转染的HUVEC明显增加.结论:成功构建了携带bFGF基因的腺病毒载体,体外可以成功表达,为bFGF基因治疗及肿瘤发病机制的研究奠定了基础.     

腺病毒介导血管内皮细胞生长因子基因体外转染骨髓间充质干细胞

 【目的】探讨腺病毒介导血管内皮细胞生长因子(VEGF165)基因转染大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)后目的基因表达情况及对MSCs增殖分化的影响。【方法】构建含VEGF基因的腺病毒表达载体,利用贴壁法分离培养MSCs后,用荧光显微镜和流式细胞仪检测转染效果和转染率,用免疫组化、Western-Blot和ELISA方法分别检测VEGF基因转染MSCs后VEGF的表达情况。【结果】腺病毒介导的VEGF基因对于MSCs具有很高的转染效率,转染效率与病毒感染复制数(multiplicyties of infection,MOI)具有量效关系。MOI为150倍时,转染效率>95%,转染VEGF后,MSCs可有效表达VEGF,9d时达到表达高峰(1125pg/mL),13d后仍可检测到VEGF的表达。转染VEGF对MSCs的增殖分化没有明显影响。【结论】腺病毒介导的VEGF基因可以有效的转染MSCs,MSCs是一种理想的基因载体细胞,其携带的VEGF基因可获得较高的表达水平。     

携hVEGF165基因的重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的　构建携带人血管内皮生长因子 16 5 (hVEGF165)基因的重组腺病毒载体。方法　将hVEGF165cDNA亚克隆到腺病毒中间载体pACCMV·pLpA ,再与pJM17共转染人胚肾 2 93细胞 ,获得载hVEGF165基因的复制缺陷型重组腺病毒 ,感染体外培养的兔主动脉血管平滑肌细胞 (VSMC) ,通过RT PCR和Westernblot检测VEGF表达情况 ,并观察表达产物VEGF对人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)增殖的影响。结果　重组腺病毒感染VSMC 4 8h后有VEGFmRNA转录及蛋白质的表达 ,并呈剂量依赖性地促进HUVEC增殖。结论　构建的重组腺病毒载体在VSMC中能够有效表达目的基因 ,且能有效促进HUVEC增殖 ,为hVEGF165基因的实际应用奠定了基础。     

腺病毒载体介导的VEGF基因转染对C17．2神经干细胞凋亡的影响

OBJECTIVE: To study the effects of vascular endothelial growth factor (VEGF) gene transfer on hypoxia-induced apoptosis of neural stem cells in vitro. METHODS: C17.2 neural stem cells cultured in vitro were infected by recombinant adenovirus containing VEGF gene and cultured under hypoxic condition. VEGF expression in these cells was detected by Western blotting, and the apoptotic index was calculated from results of triphosphate-biotin nick end-labeling (TUNEL) assay. Flow cytometry was employed to examine the changes in the cell apoptotic rate after VEGF gene transfer, and the apoptotic bodies were observed under fluorescence microscope with Hoechst33342 staining. RESULTS: The expression of VEGF was significantly increased in pAdCMV VEGF(165)-infected cells, resulting in inhibition of the apoptosis of C17.2 neural stem cells induced by hypoxia manifested by a significantly lower apoptotic rate of the stem cells transfected by pAdCMV VEGF(165) than that of the untransfected cells (10.38%;+/-0.48%; vs 19.98 %;+/-0.55%;, P<0.01) and of the cells transfected with pAdCMV VEGF(165) along with VEGF anti-sense oligodeoxynucleotide (19.07%;+/-0.64%;, <0.01) after hypoxia. CONCLUSIONS: Recombinant adenovirus can efficiently mediate VEGF gene transfer into C17.2 neural stem cells, resulting in high expression of the exogenous VEGF in vitro, which effectively reduces C17.2 neural stem cell apoptosis induced by hypoxia.     

hVEGF121基因真核表达载体的构建及其在神经干细胞中的表达

目的 构建真核表达载体pEGFP-N1/hVEGF121,并转染神经干细胞(neural stem cells,NSCs),以探究人血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,hVEGF121)基因导入NSCs的表达变化.方法 分离培养胎鼠NSCs,并行nestin、GFAP...     

人VEGF基因腺病毒表达载体修饰大鼠骨髓间充质干细胞

目的 探讨含人血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因腺病毒表达载体Ad-VEGF转染大鼠骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)的可行性.方法 采用贴壁培养筛选法富集大鼠BM-MSCs.将HEK293细胞中扩增并经效价分析后的Ad-VEGF转染大鼠BM-MSCs,通过对细胞转染效率、生长和活力的观察分析,以确定理想的感染复数(MOI)值.结果 本实验经HEK293细胞扩增制备的Ad-VEGF的病毒效价达8×108 pfu/ml;当MOI值为50时,Ad-VEGF转染大鼠BM-MSCs效率可达最高值53％;而MOI值高于50时,Ad-VEGF转染对BM-MSCs活性抑制明显.结论 成功实现Ad-VEGF转染大鼠BM-MSCs,其最适MOI值为50.     

腺病毒介导的血管内皮生长因子165对兔外周血管生成作用的研究

目的：检验以腺病毒为载体的 血管内皮生长因子165（Ad-VEGF165)基因的表达规律及能否促进缺血骨骼肌血管生成。方法：将兔右股动脉离断后,在缺血肌肉组织中直接注入Ad-VEGF165或磷酸盐缓冲液（PBS）,5周后,以血管造影、免疫组化检查及单光子发射计算机断层（SPECT）显像检测局部缺血组织血管新生情况。用酶联免疫分析法（ELISA）检测血浆和肌肉组织中Ad-VEGF165的表达。结果：Ad-VEGF165注入缺血肌肉组织后24h达到表达高峰,1周时降至基线水平,血浆及对侧健康的肌肉组织中无目的基因表达,治疗缺血肢体侧枝血管（P＜0．01）、血管密度（P＜0．05）及相对血流（P＜0．01）均明显高于对照组。结论：缺血肌肉组织中直接注入Ad-VEGF165可诱导局部VEGF蛋白表达,促进缺血部位的血管生成,增加血流量。     

腺病毒介导RNA干扰抑制血管内皮生长因子的表达治疗人肺腺癌的实验研究

目的:构建针对人血管内皮生长因子(VEGF)的腺病毒载体pAd-Easy/VEGF,应用RNA干扰的方法,观察其在体内和体外对人肺腺癌细胞株A549生长的抑制作用.方法:应用PCR构建RNA干扰pAd-Easy/VEGF腺病毒载体,并利用该线性化质粒用Lipofectamine 2000转染293细胞,制备携带人VEGF的腺病毒转染A549细胞.荧光显微镜和流式细胞仪观察增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的转染效率,RT-PCR和蛋白质印迹法检测VEGF mRNA的表达,MTT比色法测定活细胞数并绘制细胞生长曲线.同时制备裸鼠A549细胞移植瘤模型,观察肿瘤生长情况.结果:pAd-Easy/VEGF重组质粒经测序证实已把预设人VEGF基因RNA干扰的siRNA模板序列插入载体.转染重组腺病毒及空病毒24 h后流式细胞术测得转染效率分别为100%、99.7%.pAd-Easy/VEGF组VEGF表达水平较生理盐水对照组明显降低.pAd-Easy/VEGF组细胞生长明显减缓.pAd-Easy/VEGF治疗组肿瘤体积和质量明显小于对照组(P＜0.01).结论: pAd-Easy/VEGF介导的VEGF shRNA能有效抑制A549细胞中VEGF的表达,并在体内抑制肿瘤生长.     

hHGF腺病毒载体的构建及其在人脐带间质干细胞中的表达

目的:构建人重组肝细胞生长因子(human hepatocyte growth factor,hHGF)基因腺病毒载体(Ad-HGF),转染人脐带间质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells, hucMSCs),为转基因治疗提供实验基础.方法:设计含有SalⅠ及XbaⅠ酶切位点的引物,PCR扩增hHGF,将扩增产物克隆到带有绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)标记的pAdTrack-CMV穿梭质粒上.重组穿梭质粒经PmeⅠ线性化后,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183中同源重组,筛选获得含有hHGF的重组腺病毒质粒,PCR、酶切鉴定并测序.重组病毒质粒用PacⅠ酶切线性化,脂质体转染293A细胞,经3轮扩增,制备高效表达的AdGFP/HGF,并转染hucMSCs.结果:重组腺病毒质粒经PCR和SalⅠ,XbaⅠ酶切鉴定,证实含有HGF基因,测序结果和设计片段的序列一致.荧光显微镜下发现293A细胞发光率几乎为100%,感染的hucMSCs亦可表达绿色荧光蛋白.结论:成功构建了hHGF腺病毒表达载体,并获得高滴度的病毒, 能高效感染hucMSCs,为后续研究奠定了基础.     

人血管内皮生长因子165的克隆和大肠杆菌中的表达

目的 克隆和在大肠杆菌中表达人血管内皮生长因子１６５（ＶＥＧＦ１６５）。方法 利用ＰＣＲ的方法众胎脑ＣＤＮＡ库扩增得到人ＶＥＧＦ１６５的全长ＣＤＮＡ并测定其核酸序列。利用基因重组技术构建ＶＥＧＦ１６５的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达,用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测表达产物。结果 经测序表明,克隆的ＶＥＧＦ１６与文献报道相符。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ结果表明经用ＩＰＴＧ诱导后,ＶＥＧＦ１６５在大