广东地区临床分离结核分枝杆菌KatG、rpoB、rpsL耐药基因变异研究

目的本研究主要针对从广东地区500例疑似结核病患者痰液中分离的结核分枝杆菌对异烟肼(INH)、利福平(RFP)、链霉素(SM)耐药情况与其对应的突变基因katG、rpoB、rpsL 关系研究.方法采用PCR和DNA测序法对结核分枝杆菌临床分离株katG、rpoB 和rpsL 基因进行序列分析.结果分离得到耐INH 35株、耐RFP 27株、耐SM 25株.INH耐药株katG 基因突变率为71.4%(25/35),RFP耐药株rpoB 基因的突变率为81.5%(22/27),SM 耐药株rpsL 基因突变率为76%(19/25);INH以Ser315Thr突变60%(21/35)最常见,RFP以Ser531Leu突变55.6%(15/27)最常见,SM以Lys43Arg位氨基酸突变72%(18/25)常见.结论 katG、rpoB 和rpsL 基因突变被证实是广东地区结核分枝杆菌INH、RFP和SM耐药性产生的主要分子机制,PCR-DNA测序法可快速检测结核分枝杆菌INH、RFP和SM耐药性.     

DNA微陈列芯片法快速检测结核分枝杆菌rpoB、katG和inhA基因突变的临床应用

目的:探讨DNA微陈列芯片法快速检测结核分枝杆菌rpoB、katG和inhA基因突变的临床应用效果。方法:通过数字表法选择2014年5月—2016年5月初步诊断为结核病患者70例的痰样,使用DNA微陈列芯片法快速检测,并同时通过传统药敏试验和DNA测序法进行再次检查以作为对照。结果:70株结核分枝杆菌中药物敏感株芯片杂交共计20株,这一结果完全符合标准株,符合率100%(20/20),30株耐利福平(RIF)临床分离株均检测到rpoB基因突变,基因突变检出率为100%(30/30),50株异烟肼耐药株中有41株检测katG基因突变,检出率82.00%,9株检测到inhA基因突变,检出率18.00%(9/50),这一检测结果和测序结果完全符合。结论:DNA微陈列芯片法快速检测结核分枝杆菌rpoB、katG和inhA基因突变效果良好,虽然暂且不能代替传统的药敏试验方法,但其检测的灵敏度高,特异性和重复性好。     

基因芯片检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼耐药性

目的研究基因芯片在检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼耐药性中的应用。方法根据与利福平和异烟肼耐药相关的4条基因上的11个位点和30种单核苷酸多态性设计制作芯片,用芯片检测结核分枝杆菌的基因突变,从而判断其耐药性。结果用基因芯片在110株异烟肼耐药株中检测出85侏（73．3％）,在30株异烟肼敏感株中检测出22株（73．3％）,在94株利福平耐药株中检测出77株（81．9％）,在46株利福平敏感株中检测出40株（87．0％）。芯片检测结果与部分样本的测序结果完全相符。结论用DNA芯片检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼的耐药性具有较高的特异性和敏感性,该法快速、精确,可以应用于结核分枝杆菌耐药性的检测。     

细胞壁缺陷结核分枝杆菌耐药性的基因研究

目的检测与分析细胞壁缺陷结核分枝杆菌的耐药性相关基因，探讨细胞壁缺陷结核分枝杆菌耐药性的基因基础。方法分别分离16株自发形成和用利福平、异烟肼、乙胺丁醇诱导形成的结核分枝杆菌的染色体DNA，PCR扩增IS986序列以及rpoB、katG和embB基因后进行凝胶电泳和序列分析。结果自发形成及抗结核药物诱导形成的结核分枝杆菌稳定L型可在含利福平（4μg／ml）、异烟肼（0．2μg／ml）、乙胺丁醇（7．5μg／ml）的培养基内生长与传代培养。基因检测与分析显示，结核分枝杆菌稳定L型仍然保留IS986基因，rpoB、katG、embB基因也未见突变。结论结核分枝杆菌稳定L型可自发形成，也可被利福平、异烟肼和乙胺丁醇诱导形成。结核分枝杆菌稳定L型对利福平、异烟肼、乙胺丁醇形成耐药性，但其染色体上耐药相关基因并没有发生突变。除染色体耐药相关基因突变可造成结核分枝杆菌形成耐药性外，细胞壁缺陷也是造成结核分枝杆菌形成耐药性的一个重要机制。     

耐异烟肼结核分枝杆菌及其katG与inhA基因突变的研究

目的 探讨耐异烟肼临床分离结核分枝杆菌与其katG及inhA基因突变的相关性.方法 对87例临床肺结核患者痰标本进行培养、鉴定及药物敏感性试验,提取菌落DNA、PCR扩增katG和inhA基因片段,并对所有扩增片段进行序列分析.结果 87例菌株经鉴定均为结核分枝杆菌,30(34.5%)例为耐异烟肼菌株,57(65.5%)例异烟肼敏感菌株.30例耐异烟肼株中,18(60%)株出现katG和(或)inhA基因突变.在突变株中,9(50%)株为katG单基因突变,5(27.8%)株为inhA单基因突变,4(22.2%)株为妇心和inhA双基凶联合突变.两个新突变位点(Va1230Met和Pro232Gln)为首次发现,已被美国,欧洲和日本的基因库收录.结论 该研究证实结核分枝杆菌katG和inhA基因突变与耐异烟肼相关,为进一步研究异烟肼的抗菌机制奠定了基础.     

PCR-SSCP技术直接快速检测痰标本中结核分支杆菌rpoB,katG,ahpC基因突变的研究

目的：应用PCR－SSCP技术直接快速检测痰标本中结核分支杆菌rpoB,katG及ahpC基因突变,评价此方法用于结核分杆菌利福平（RFP）及异烟肼（INH）耐药性试验的意义。方法：以结核分支杆菌H37Rv为对照,30例耐RFP（单耐或多耐）、21例耐INH（单耐和多耐）的结核分枝杆菌临床分离株及10例敏感菌株;39例菌阳肺结核患者及30例非结核 性肺部疾病患者痰标本,采用PCR－SS－CP技术检测痰标本和菌株中的结核杆菌rpoB,katG,ahpC基因突变,并与药敏试验对照。结果：PCR－SSCP检测痰标本中结核分支杆菌rpoB,katG及ahpC基因突变的阳性率分别为79％（31／39）、46％（18／39）及5％（2／39）.结论：PCR－SSCP可望成为直接检测临床痰标本中结核分枝杆菌耐利福平及耐异烟肼的快速方法。     

用DNA芯片检测结核分枝杆菌耐乙胺丁醇基因突变的研究

目的利用DNA芯片快速检测结核分枝杆菌耐乙胺丁醇embB基因突变。方法根据结核分枝杆菌embB基因序列设计探针并制作DNA芯片。根据结核从分枝杆菌embB基因突变的热点片段设计引物，该片段用TAMRA荧光标记PCR扩增增后与DNA芯片杂交，同时以PCR-SSCP和DNA测序法为对照。结果120株结核分枝杆菌临床分离株中，35株敏感株DNA芯片杂交结果与标准株完全相同；85株耐乙胺丁醇临床分离株中有50株检测到embB基因突变[58．8％（50／85）]，均为306位密码子突变，该突变与PCR．SSCP和测序结果完全一致；85株耐药株中后有35株未检测到突变，占41．2％（35／85）。结论用DNA芯片可快速、特异地检测出大多数结核分枝杆菌耐乙胺丁醇分离株的embB基因突变，可协助临床医生制定合理的治疗方案，特别是复治患者，可帮助选择有效药物。     

结核分枝杆菌及其稳定L型的katG基因研究

目的探讨细胞壁缺陷对结核分枝杆菌异烟肼敏感性的影响以及结核分枝杆菌细胞壁缺陷形成异烟肼耐药性的分子基础。方法采用非高渗培养基体外药敏试验,检测自发形成及诱导形成的结核分枝杆菌稳定L型的异烟肼敏感性;用异烟肼耐药性相关结构基因katG的特异性引物,对自发形成及诱导形成的结核分枝杆菌稳定L型及其亲代细菌型的染色体DNA进行PCR扩增与序列分析。结果不论对异烟肼敏感还是耐药的结核分枝杆菌自发或诱导形成稳定L型后,都能够在含0．2ptg／ml异烟肼的非高渗液体培养基内生长和传代培养。结核分枝杆菌稳定L型katG基因PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳,可见形成与其亲代细菌型一致的DNA条带。PCR-DS分析结果显示,结核分枝杆菌稳定L型katG基因扩增产物具有与其细菌型相同的核苷酸序列。结论无论是自发形成的还是异烟肼诱导形成的结核分枝杆菌稳定L型都可形成异烟肼耐药性,但其katG基因的核苷酸序列并没有发生改变。提示结核分枝杆菌稳定L型的异烟肼耐药性与katG基因突变无关,细胞壁缺失也是导致结核分枝杆菌形成异烟肼耐药性的一个重要机制。     

结核分枝杆菌异烟肼耐药基因katG点突变的快速检测

目的：探讨快速检测结核分枝杆菌异烟肼（INH）耐药基因型的分子药敏方法。方法：用聚合酶链反应－单链构象多态性（PCR－SSCP）检测了30株INH敏感菌株及30株耐药株的katG基因，随后用SSCP方法鉴定扩增产物有无突变，以结核分枝杆菌H37Rv作对照。结果：所有INH敏感株均观察到katG基因扩增产物，30株INH耐药株中28株观察到katG基因扩增产物。以H37Rv标准株为对照，30株敏感株SSCP带谱与对照相同；28株INH耐药株中13株与对照相同，15株有不同程度的差异。与药敏试验比较，PCR－SSCP检测INH耐药结核菌的敏感性为57%，特异性为100％。结论：多数结核分枝杆菌耐INH是由于katG基因突变所致，用PCR－SSCP筛选突变株可达到快速检测结核分枝杆菌INH耐药基因型的目的。     

结核分枝杆菌KatG基因突变与对异烟肼耐药的关系

目的探讨结核分杖杆菌KatG基因突变与对异烟肼耐药程度的关系。方法对临床分离的6I株结核分枝杆菌异烟肼耐药株（其中高浓度耐药株49株．低浓度耐药株12株）和42株结核分枝杆菌异烟肼敏感株进行DNA序列分析。结果61株异烟肼耐药株中，检测到50株存在KatG S315T（AGC→ACC）基因突变、1株存在Ser315Arg（AGC→AGA）的突变，1株发生Val319Asp（GTC→GAC）突变，突变率为185．2％（52／61）。其中高浓度耐药株中有46株检出发生S315T突变，1株发生Val319Asp突变，突变率为95．9％（47／49）；低浓度耐药株中有4株检出发生S315T突变，1株发生Sex315Arg（AGC→AGA）的突变，突变率为41．7％（5／12）；42株异烟肼敏感株DNA序列分析均没有检测到KatG基因突变。结论KatG基因突变是结核分枝杆菌耐异烟肼的主要分子机制，异烟肼高浓度耐药株的KatG基因突变率远高于低浓度耐药株的基因突变率。     

用分子生物学技术快速检测耐多药结核分枝杆菌

目的：用PCR—SSCP技术检测耐INH、RFP、SM结核分枝杆菌分离株KatG、rpoB、rpsL基因突变，评价其在快速检测结核分枝杆菌耐药性方面的临床价值。方法：以结核分枝杆菌H；vRv为对照，20株耐多药菌株和20株敏感株，分别用PCR—SSCP方法检测KatG、rpoB、rpsL基因突变，并将SSCP结果与药敏试验结果作对照分析。结果：PCR—SSCP方法检测20株敏感株SSCP带语均与H37RV标准株相同，而20株耐多药结核分枝杆菌KatG、rpoB、rpsL基因突变的阳性率分别为70％，100％和75％。发现20株耐多药菌株中有11株(55％)共INH、RFP、SM3种耐药遗传标志均发生突变，7株(35％)有2种耐药遗传标志突变，2株(10％)只有RFP耐药标志突变。结论：PCR—SSCP方法敏感、特异，可快速检测结核分枝杆菌KatG、rpoB、rpsL耐药基因突变，有利于耐多药结核分枝杆菌耐药性的快速检测。     

应用单链探针反向杂交试验检测结核分枝杆菌耐药性分析

目的探讨单链探针反向杂交试验检测结核分枝杆菌耐药性,评价此方法在耐药性检测中的临床应用价值。方法采用聚合酶链反应-单链探针反向杂交试验技术,PCR扩增50株结核分枝杆菌rpoB、katG、rpsL、rrs、embB耐药基因,将标记生物素的基因扩增产物与固定在硝酸纤维膜上的核酸探针杂交,通过链亲和素碱性磷酸酶,BICP/NBT显色系统检测分析基因突变,同时与传统药物敏感实验比对分析。结果 PCR-LiPA方法分析50株结核分枝杆菌临床分离株,耐RFP菌株中检出4株,耐INH菌株中检出5株,耐SM菌株中检出7株,SM敏感株检出1株,50株rrs基因均未检测到相应位点的突变;耐EMB菌株1株、EMB敏感株1株检测到embB基因突变。结论应用PCR-LiPA可快速、简便地检出部分结核分枝杆菌耐药株,可作为临床辅助诊断手段。     

华南地区380株结核分枝杆菌异烟肼耐药基因突变情况分析

目的探讨华南地区异烟肼耐药结核分枝杆菌临床分离株katG、mabA-inhA、oxyR-ahpC、kasA和ndh基因的突变特点。方法在广州地区分枝杆菌菌株库中, 选择异烟肼耐药性测定结果明确的380株来自华南地区结核病患者的结核分枝杆菌临床分离株, 其中异烟肼耐药株236株和异烟肼敏感株144株, 对380株结核分枝杆菌临床分离株的5种异烟肼耐药基因片段进行序列测定分析。描述性分析各基因突变出现的频率。结果在INH耐药株和敏感株中分别发现26个位点29种突变类型、16个位点17种突变类型, 均以katG基因315AGC(S)→ACC(T)、mabA-inhA基因-15T→C最为常见, 发生率分别为48.73%(115/236)、17.37%(41/236)和9.72%(14/144)、9.72%(14/144);在katG、mabA-inhA、oxyR-ahpC、kasA和ndh中分别发现3个位点5种突变、5个位点5种突变、11个位点13种突变、6个位点6种突变和11个位点11种突变, 在INH耐药株和敏感株中5个基因突变的发生率分别为52.12%(123/236)、22.46%(5...     

基因芯片技术检测结核分枝杆菌耐药性的临床价值

目的探讨基因芯片技术检测结核分枝杆菌耐药性的临床价值。方法回顾性分析685例结核病临床疑似病例的临床资料,采用晶芯结核分枝杆菌生物芯片技术进行检测。结果本组685例临床疑似病例中,阳性135例,阳性率为19．7％,基因芯片检测结果显示结核131例,非结核4例,阳性率为19．1％。耐药基因检测68例,利福平和异烟肼基因突变12例。总突变率为17．6％,其中11例为利福平和异烟肼均耐药,双重基因突变率为16．2％,另1例只耐利福平。利福平总突变率为17．6％,异烟肼总突变率为16．2％,耐多药率为16．2％。结论晶芯结核分枝杆菌生物芯片技术用于临床诊断结核病及其耐药性,能够缩短诊断时间,提高临床时效性,值得推广应用。     

广东地区结核分枝杆菌利福平耐药与基因rpoB突变关系分析

目的 为了解广东地区结核分枝杆菌rpoB基因突变特点,并探讨其与利福平耐药之间的关系.方法 本研究根据结核病诊断细菌学检验规程从临床结核病疑似患者痰液中分离鉴定结核分枝杆菌,采用绝对浓度法对其进行药敏试验,并用PCR-DNA直接测序法对结核分枝杆菌rpoB基因进行序列分析.结果 结果分离得到利福平耐药株27株,其中低浓度耐药8株,高浓度耐药19株.经测序分析,所有利福平敏感株rpoB基因均未发生氨基酸突变 利福平耐药株rpoB基因的突变率为81.5%（22/27）,突变均发生在利福平耐药决定区内,突变位点为526、531及533,以Ser531Leu突变最为常见（55.6%,15/27）,并且高浓度耐药株的突变率明显高于低浓度耐药株.结论 结果表明广东省结核分枝杆菌rpoB基因突变是结核分枝杆菌利福平耐药性产生的主要分子机制,突变位点同国内外研究基本一致,但各位点突变形式所占比例有自身特点.     

The application of gene chip in detecting Mycobacterium tuberculosis resistance to rifampicin and isoniazid

目的 探讨基因芯片技术在检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药性的应用.方法 收集21例临床诊断结核病患者体液标本经培养得到的分离菌液,进行基因芯片检测,包括利福平的rpoB基因位点和异烟肼的KatG和inhA基因位点,从而判断其耐药性.结果 21例样本中,利福平rpoB基因有10例突变,总突变率为47.6%,其中9例为531位点的(C-T)突变,1例526位点的(C-G)突变.与药敏试验的符合率为81.0%.异烟肼基因突变有6例,总突变率为28.6%,其中4例为KatG 315(G-C)突变,2例为inhA-15(C-T)突变.与药敏试验的符合率为90.5%.利福平的11例耐药株中,基因芯片检测8例为突变型,突变率为72.7%,在利福平的10例敏感株中,基因芯片检测2例为突变型,突变率为20.0%.在异烟肼的6例耐药株中,基因芯片检测5例为突变型,突变率为83.3%,在异烟肼的15例敏感株中,基因芯片检测1例为突变型,突变率为6.7%.结论 基因芯片技术检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼的耐药性具有较高的特异性和敏感性,快速准确,可以应用于结核分枝杆菌耐药性的检测.     

结核分支杆菌耐药基因检测结果分析

目的 分析肺结核患者结核分支杆菌获得性耐药情况,比较两种耐药性检测方法的检测效果.方法 用药敏试验(绝对浓度法)检测结核分支杆菌株对利福平(RFP)、异烟肼(INH)、链霉素(SM)、吡嗪酰胺(PZA)和乙胺丁醇(EMB)的耐药情况,采用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)检测结核分支杆菌耐药rpoB、katG、rpsL、pncA和embB基因突变.结果:400例肺结核耐药患者常规药敏试验耐药316例(79.8%);耐药基因检测耐药株288株,突变率72.0%.RFP耐药例数和耐药率明显高于SM、PZA和EMB(耐药例数:F=2.45,2.56,2.69,P＜0.05;耐药率:F=2.55,2.66,2.79,P＜0.05),rpoB突变株和突变率明显高于katG、rpsL、pncA和embB(突变株:F=2.28,2.46,3.19,3.33,P＜0.05～0.01;突变率:F=2.36,2.61,3.25,3.45,P＜0.05～0.01),高浓度药物耐药菌株的突变株和突变率显著高于低浓度药物耐药菌株,随着不规律用药时间的延长,耐药率和突变率均逐渐上升(耐药率:F=2.77,2.88,P＜0.05;突变率:F=2.72,2.85,P＜0.05).结论 PCR-SSCP是一种快速检测结核杆菌rpoB、katG、rpsL、pncA和embB基因突变敏感、特异的方法.     

结核分枝杆菌耐药特点分析

目的对西安地区结核分枝杆菌的耐药情况进行统计分析,为今后结核病防治工作提供参考依据。方法对收集疑似结核患者的标本采用美国BD公司BACTECMGIT960全自动快速分枝杆菌培养鉴定药敏仪进行培养鉴定和药敏试验。结果从送检的标本共分离到结核分枝杆菌621株,310株至少对一种药物耐药,总耐药率为49.9%,其中总耐单药率为11.6%,至少同时耐2种药物的总耐药率为38.3%。而在238株同时对多种药物耐药的菌株中,至少同时耐异烟肼和利福平的菌株172株,耐多药率为27.7%。另外,结核菌对4种抗结核药物的耐药率由高到低依次为异烟肼42.7%、链霉素35.4%、利福平28.5%、乙胺丁醇21.7%。结论我市结核病耐药发生率高,并且耐药性发生更趋于对多种一线抗结核药物同时耐药,特别是趋于对异烟肼和利福平同时耐药,即耐多药结核病发生率高,应引起相关卫生部门的足够重视。     

结核分支杆菌耐药基因的杂交检测

目的采用PCR-反向斑点杂交检测结核分支杆菌中rpoB基因、KatG基因和rpsL基因突变。评价该方法检测结核分支杆菌利福平（RFP）、异烟肼（INH）和链霉素耐药性,探讨直接检测结核患者痰标本的可行性。方法用PCR-反向斑点杂交技术分析对75株临床分离株和45例肺结核患者涂阳痰标本进行rpoB、rpsL和KatG基因突变的检测。结果临床耐药株分离株进行rpoB、rpsL和KatG基因突变的检测,其突变率分别为83.9%、62.5%、57.1%。肺结核患者涂阳痰标本中耐药株突变率分别为81.0%、60.0%、52.9%。结论rpoB基因、KatG基因和rpsL基因突变与结核分支杆菌耐利福平、异烟肼和链霉素密切相关,应用PCR-反向斑点杂交技术可快速检测结核分支杆菌对异烟肼、链霉素和利福平耐药性。PCR-反向斑点杂交技术有望成为结核分支杆菌耐药性检测的重要方法之一。     

硝酸盐还原试验、DNA线性杂交检测结核分枝杆菌耐药性的比较

目的比较生物化学检测方法和基因检测方法在结核分枝杆菌耐药性检测中的优劣,以提高耐药性检测方法的准确度。方法以绝对浓度法为“金标准”,对已知耐药浓度的耐药结核分枝杆菌菌株及敏感株采用硝酸盐还原试验（Nitrate Reducrase Assay,NRA）、DNA线性杂交法（Applicating Line Probe Assay LiPA）检测其对利福平（RFP）、异烟肼（INH）、链霉素（SM）和乙胺丁醇（EMB）的耐药性。结果硝酸盐还原试验与绝对浓度法比较,异烟肼（INH）耐药菌株符合率为77．6％,敏感菌株符合率为86．6％;利福平（RPF）耐药菌株符合率为95．8％,敏感菌株符合率为92％;链霉素（SM）耐药菌株符合率为84．1％,敏感菌株符合率为100％;乙胺丁醇（EMB）耐药菌株符合率为94．1％,敏感菌株符合率为85．7％。DNA线性杂交与绝对浓度法比较,异烟肼（INH）耐药菌株符合率为89．6％,敏感菌株符合率为93．3％;利福平（RPF）耐药菌株符合率为98．6％,敏感菌株符合率为100％;链霉素（SM）耐药菌株符合率为78．3％,敏感菌株符合率为100％;乙胺丁醇（EMB）耐药菌株符合率为88．2％,敏感菌株符合率为100％。硝酸盐还原试验与DNA线性杂交比较,异烟肼（INH）耐药菌株符合率为80．6％,敏感菌株符合率为82．9％;利福平（RPF）耐药菌株符合率为100％,敏感菌株符合率为100％;链霉素（SM）耐药菌株符合率为97．2％,敏感菌株符合率为96．7％;乙胺丁醇（EMB）耐药菌株符合率为100％,敏感菌株符合率为83．5％。结论硝酸盐还原试验和DNA线性杂交法检测匀可作为快速结核分枝杆菌耐药性试验方法,两方法具有一致性。