星状细胞活化及其作用研究进展

肝星状细胞（HSC）是启动肝纤维化（HF）整个事件的开端，在HF过程中扮演着重要的角色。活化的HSC在肝损伤部位移行、增殖，表达各种细胞外信号转导通路蛋白，产生大量细胞外基质（ECM）成分和细胞因子（CK），是HF形成的中心环节；在HF的恢复期，有与肝脏疤痕降解一致的广泛性的HSC凋亡。因此，诱导活化HSC的凋亡可使HF发生逆转。目前，活化HSC已被看作抗HF治疗的主要靶点。现就HSC活化与HF的关系作一综述。     

大豆异黄酮对实验性肝纤维化大鼠肝星状细胞活化的影响

<正>大豆异黄酮(soybean isoflavones,SI)主要存在于大豆中,具有多种生物学活性,在防治疾病中已得到广泛应用,近年来在肝病防治中的应用也越来越受关注。肝纤     

大鼠转化生长因子β3基因的克隆及其转染肝星状细胞后的表达

目的:克隆大鼠转化生长因子β3(TGFβ3)基因并研究其转染肝星状细胞(HSC)后的表达情况。方法:采用逆转录—聚合酶链式应(RT-PCR)从大鼠成骨细胞中扩增出特异性片段,经酶切鉴定证实为大鼠TGFβ3cDNA,将此片段插入pcDNA3.1(+)表达载体,构建得到pcDNA3.1(+)-TGFβ3重组质粒。应用阳离子脂质体介导的基因转移技术将TGFβ3表达载体导入大鼠HSC,24 h、48 h、72 h后用荧光定量PCR法进行瞬时表达的检测。结果:重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-TGFβ3经限制性内切酶NheI、XbaI酶切,电泳后显示的TGFβ3目的片段和5.4 kb的pcDNA3.1(+)载体片段,测序证实酶切片段与GenBank中登记的TGFβ3全长序列相同,证实pcDNA3.1(+)-TGFβ3真核表达载体构建成功,转染48 h后,肝星状细胞的表达明显增高(P0.05)。结论:重组TGFβ3真核表达载体构建正确,并在转染大鼠HSC48 h后获得高效表达,为转基因治疗肝纤维化疾病提供理论依据。     

HBx蛋白促进纤维化相关因子在人肝星状细胞中的表达

目的研究转染HBx基因的肝细胞在体外促进纤维化相关因子在肝星状细胞中的表达,进而探讨HBx促肝纤维化的机制。方法首先以表达HBx蛋白的肝细胞（QSG7701-HBx）与Lx-2细胞（人肝星状细胞株）共培养,并以转染pcDNA3空载体的肝细胞（QSG7701-pcDNA3）和母细胞QSG7701为对照;共培养后应用RT-PCR检测LX-2细胞α-SMA、TGF．[31、CTGF和Col Ⅰ（I型胶原）的mRNA表达;应用Western blot检测共培养后LX-2细胞α-SMA、TGF．131和CTGF蛋白表达;同时应用酶联免疫吸附法（ELISA）检测共培养后细胞上清液中ColⅠ浓度。结果（1）RT-PCR结果显示,与QSG7701-HBx细胞共培养的LX-2细胞的α-SMA、TGF-β1、CTGF和Col Ⅰ的mRNA表达明显高于两对照组QSG7701-pcDNA3和QSG7701（P〈0．05）。（2）Westem blot分析显示,与QSG7701-HBx细胞共培养的LX-2细胞的α-SMA、TGF—p1和CTGF蛋白表达也明显高于两对照组（P〈0．05）。（3）ELISA检测Lx·2细胞分别与QSG7701、QSG7701-pcDNA3和QSG7701-HBx细胞共培养的上清液colⅠ其浓度分别为（191．2±20．8）ns／ml、（200．2±21．6）ng／ml和（500．5±43．4）ng／ml,QSG7701-HBx明显高于两对照组（P〈0．05）,这表明HBx蛋白能促进LX．2细胞分泌colⅠ有助于肝纤维化的形成。结论与QSG7701-HBx细胞共培养后,肝星状细胞中的纤维化相关蛋白表达明显增强,体外实验证实HBx具有诱导肝纤维化的作用。     

转化生长因子β在肝纤维化发病和治疗中的意义

转化生长因子β(transforming growth factor_β,TGF_β)是一种具有多种生理功能的细胞因子,它与肝纤维化的发生发展及治疗密切相关。TGF_β与肝纤维化的早期诊断及抗纤维化治疗的关系是近年来的研究热点。本文就TGF_β与肝纤维化的形成、诊断及治疗等方面进行综述。     

肝纤维化形成的机制——信号转导通路TGF-β／smad的作用概论

肝纤维化是各种慢性肝病的共同病理基础，其发生与各种致病因子、炎性因子以及细胞因子等作用有关。转化生长因子-β1(transforming growth factor beta 1,TGF-β1)是TGF-β超家族的主要成员，能抑制肝细胞、内皮细胞、上皮细胞的增殖，诱导细胞外基质的形成。Smads介导TGF-β超家族受体到核基因的信号传递，smad4为其通用型smad蛋白，为TGF-β信号传递通路所必须的下游中介分子。本文主要就目前研究的热点TGF-β／smad信号转导通路在肝纤维化形成、发展中的作用进行综述。     

硫普罗宁注射液干预大鼠肝星状细胞致肝纤维化形成作用的研究

目的 探讨硫普罗宁注射液抗肝纤维化的作用及其机制。方法 肝星状细胞的分离采用胶原酶循环灌流法。硫普罗宁注射液（25mg／ml、50mg／ml、100mg／ml、200mg／ml、400mg／ml）作用不同时间（24h、48h、72h）后，采用MTT法OD值检测细胞活化增殖情况。硫普罗宁注射液（200mg／m1）作用24h和48h后，流式细胞术检测细胞增殖周期。采用溴乙锭／吖啶橙荧光染色法结合显微镜下形态学观察及流式细胞术检测硫普罗宁注射液对活化的肝星状细胞凋亡的影响。结果 硫普罗宁注射液各浓度组OD值较对照组明显降低（P〈0.05），硫普罗宁注射液200mg／ml组作用24h和48h流式细胞术检测出C2-M期的细胞数均明显高于正常对照组（P〈0．01），硫普罗宁注射液各浓度组荧光染色法和流式细胞术均未检测到肝星状细胞凋亡。结论 硫普罗宁注射液主要是通过抑制肝星状细胞增殖的C2-M期而产生抗肝纤维化作用的。     

神经生长因子诱导肝星状细胞凋亡及其相关机制的研究

目的观察神经生长因子（nerve growthfactor,NGF）对大鼠肝星状细胞（hepatic stellatecell,HSC）凋亡的影响,并探讨其可能的作用机制。方法体外培养大鼠肝星状细胞株HSC—T6,将HSC—T6与100ng／mlNGF孵育24h后,流式细胞术检测细胞凋亡;细胞免疫化学法检测HSC中凋亡相关基因P^53、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达的情况;免疫荧光法检测NGF、神经生长因子低亲和力受体p75NTR表达的情况。结果NGF作用HSC后凋亡率较对照组明显增高[（22．364±9．51）％VS（5．88±1．36）％,P〈0．05]。凋亡相关蛋白P^53、Caspase-3的阳性细胞百分率与对照组比较明显增高[（78．41±4．00）％、（39．26±1．57）％VS（34．96±3．84）％、（9．27±1．01）％,P〈0．05],而Bcl-2表达实验组阳性细胞百分率较对照组降低[（18．12±1．38）％vs（91．53±2．98）％,P〈0．05]。NGF作用HSC后NGF表达增多（6．53±1．40vs1．77±0．17,P〈0．05）,而p75NTR表达无明显变化（3．52±0．36VS4．24±0．38,P〉0．05）。结论NGF可能通过使凋亡相关基因p、Caspase-3表达上调、Bcl-2表达下调,而诱导HSC凋亡。NGF作用HSC后可作为始动因子和效应因子增加NGF的表达,而对p75NTR表达无影响。     

转化生长因子β1小干扰RNA对肝星状细胞生物学特性的影响

目的 观察转化生长因子β1小干扰RNA（TGFβ1 siRNA）对肝星状细胞增殖、活化、胶原合成的影响.方法 利用脂质体将TGFβ1 siRNA表达质粒转入肝星状细胞中,培养72 h后,收集肝星状细胞和上清液,采用Western blotting和RT-PCR法分别检测细胞TGFβ1和a-SMA蛋白表达、Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达;MTT法检测细胞增殖活性和放射免疫法检测培养上清液中IV型胶原和透明质酸含量.结果 与无关对照siRNA组相比,TGFβ1和a-SMA蛋白表达分别下调（79±5）%和（55±4）%（均P〈0.01）;细胞增殖活性降低（25±4）%（P〈0.01）;Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达分别下调（63±6）%和（57±4）%（均P〈0.01）;培养上清中IV型前胶原和透明质酸含量分别降低（53±8）%和（46±8）%（均P〈0.01）.结论 TGFβ1 siRNA能显著下调TGFβ1的表达,抑制肝星状细胞活化、增殖及细胞外基质的合成和分泌.     

兴奋性氨基酸递质系统在乐果诱导星形胶质细胞活化中的作用

目的 探讨兴奋性氨基酸递质系统在乐果染毒后皮层星形胶质细胞活化中的作用.方法 新生大鼠皮层神经细胞传代3次后获得纯化的星形胶质细胞,分别加入终浓度为10-6、10-5、10-4mol/[的乐果,并用50和100 μmol/LN-甲基-N-天门冬氨酸(NMDA)受体非竞争性拮抗剂MK801对10-4mol/L乐果染毒组进行干预.染毒后48 h收获细胞,高效液相色谱-荧光检测系统(HPLC-FLD)方法测定细胞内兴奋性氨基酸递质含量,反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测NMDA受体NR2B亚基、谷氨酸(Glu)、谷氨酸转运体(GLT-1)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸/天冬氨酸转运体(GLAST)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)及S100β mRNA表达的变化,免疫荧光染色半定量检测GFAP以及S100β的蛋白表达.结果 各剂量染毒组GLASTmRNA表达下降为对照组的67.8%、68.6%和76.2%,差异有统计学意义(P＜0.05);10-4 mol/L染毒组Glu、Asp含量与对照组相比明显下降,差异有统计学意义(P＜0.01);与对照组比较,10-4mol/L染毒组GFAP和10-5mol/L染毒组S100βmRNA表达,10-5、10-4mol/L染毒组GFAP蛋白表达,10-4mol/L染毒组S100β蛋白表达明显上升,差异有统计学意义(P＜0.01),有剂量依赖趋势.对10-4mol/L染毒组给予50和100 μmol/L MK801干预后,GLT-1、GLAST mRNA表达水平较10-4 mol/L染毒组明显上升,差异有统计学意义(P＜0.01),NR2B mRNA表达进一步升高,与未干预前相比,差异无统计学意义(P＞0.05),但均明显高于对照组水平,差异有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01);100 μmol/L MK801干预后,Glu的含量升高为10-4mol/L染毒组的1.81倍,差异有统计学意义(P＜0.01);50和100μmol/LMK801干预后,GFAP转录及蛋白水平较未干预前明显下降,差异有统计学意义(P＜0.01),50 μmol/L干预组S100β蛋白表达水平仍然高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 乐果对兴奋性氨基酸递质系统的影响参与了星形胶质细胞的活化;NMDA受体阻断剂MK801有助于控制星形胶质细胞胶质化.

Abstract：

Objective To study the involvement of excitatory amino acid system in astrocytes activation caused by dimethoate. Methods Pure-cultured astrocytes were gained by three passages from primary cultured rat nerve cells, then treated with 10-6,10-5,10-4 mol/L dimethoate for 48 h, 50 μmol/L and 100μmol/L MK801, a NMDA receptor blocker, was used to intervene the effects induced by 10-4 mol/L dimethoate.HPLC-FLD was utilized to measure the concentrations of excitatory amino acid (EAA), RT-PCR was used to detect the expression levels of NR2B, GLT-1, GLAST, GFAP and S100β mRNA, and immunofluresence staining method was applied to measure the expression levels of GFAP and S100β proteins. Results The expression levels of GLAST mRNA in all exposure groups were 67.8% ,68.6% and 76.2% of control level,respectively, which were significantly lower than that of control group (P＜0.05); The concentrations of EAA significantly decreased in 10-4 mol/L dimethoate group, as compared with control group (P＜0.01); the expression levels of GFAP mRNA in 10-4 mol/L dimethoate group, of S100β mRNA in 10-5 mol/L dimethoate group, of GFAP protein in 10-4 mol/L and 10-5 mol/L dimethoate groups and S100β protein in 10-4 mol/L dimethoate group were significantly higher than those in control group (P＜0.01). The expression levels of GLT-1 and GLAST mRNA in 10-4 mol/L dimethoate plus 50 μ mol/L or 100 μ mol/L MK801 groups increased significantly, as compared with 10-4 mol/L dimethoate group (P＜0.01), the expression levels of NR2B mRNA in 10-4 mol/L dimethoate plus 50 μ mol/L or 100 μmol/L MK801 groups increased significantly, as compared with control group (P＜0.05 or P＜0.01); the concentration of Glu in 10-4 mol/L dimethoate plus 100 μ mol/L MK801 group increased significantly, as compared with 10-4 mol/L dimethoate group (P＜0.01); the expression levels of GFAP mRNA and protein in10-4 mol/L dimethoate plus 50 μ mol/L or 100 μ mol/L MK801 groups decreased significantly (P＜0.01); S100β protein expression level in 50 μ mol/L MK801 intervention group was significantly higher than thatl in control group (P＜0.01). Conclusion Excitatory amino acid system involved in astrocytes activation caused by dimethoate. MK801 was useful to control astrocytes gliosis.     

福辛普利保护糖尿病肾病及其对肾组织TGFβ1 mRNA表达的影响

目的探讨福辛普利对糖尿病肾小球病变的保护作用与机制。方法建立糖尿病大鼠模型,分为正常对照组(A组)、糖尿病组(B组)、福辛普利治疗组(C组),C组1 w后给予福辛普利灌胃给药。检测各组第1、2、4、12周血糖、24 h尿视黄醇结合蛋白以及尿白蛋白排泄率;分别于第4、12周每组各处死5只大鼠,计算肾脏肥大指数,检测皮质TGFβ1mRNA水平;检查肾小球基底膜、系膜区病理改变。结果第1周B和C组尿白蛋白排泄率与A组差异无统计学意义;第2、4、12周尿白蛋白和视黄醇结合蛋白排泄率,B组均显著高于A组;第4、12周,B组大鼠肾皮质TGFβ1mRNA表达较A组显著增加,C组TGFβ1mRNA表达明显低于B组,但较A组表达量仍然增加;B组肾小球毛细血管基底膜增厚;C组肾小球毛细血管基底膜也有不规则增厚,较同时期B组减轻。结论肾脏TGFβ1mRNA表达的上调可能是糖尿病肾病的发生机制之一,福辛普利对糖尿病肾病具有确切的保护作用。     

TGF-β1和TGF-βⅡ型受体酵母表达载体构建

  目的  研究截短型人肝细胞生长因子突变体（tvNK1）对转化生长因子β1（TGF-β1）诱导人肝星状细胞LX-2纤维化的影响。  方法  把经PCR和双酶切的小分子泛素相关修饰蛋白（SUMO）和tvNK1的融合基因SUMO-tvNK1插入原核表达载体pET28a,诱导表达和Ni²⁺亲和层析纯化SUMO-tvNK1;进一步经SUMO蛋白酶Ulp1水解和Ni²⁺亲和层析纯化tvNK1,MTT法观察其对TGF-β1诱导LX-2纤维化细胞增殖的影响,qPCR及蛋白印迹（WB）检测其对I型胶原蛋白（col1α1）和α – 平滑肌球蛋白（α-SMA）蛋白表达的影响。  结果  宿主菌Rosetta/pET28a-SUMO-tvNK1在37 ℃经1 mmol/L IPTG诱导5 h获得SUMO-tvNK1的可溶性表达,将超声破碎后上清液经Ni²⁺亲和层析成功获得SUMO-tvNK1,进一步经Ulp1水解和Ni²⁺亲和层析纯化tvNK1,SDS-PAGE鉴定其分子量约为22.0 kDa,MTT显示20和40 ng/mL的tvNK1能明显抑制TGF-β1活化的人肝星状细胞LX-2增殖,qPCR及WB显示20和40 ng/mL的tvNK1能显著抑制活化的LX-2细胞中Col1α1和 α-SMA在mRNA和蛋白水平表达。  结论  SUMO蛋白可用于制备tvNK1,其能抑制TGF-β1活化的LX-2细胞增殖并具有抗纤维化作用,为进一步体内外功能研究打下基础。     

TGF-β1对人腹膜间皮细胞转分化影响的探讨

目的探讨TGF-β1刺激对人腹膜间皮细胞(HPMCs)转分化的影响机制。方法用5ng/m l TGF-β1刺激第三代HPMCs培养细胞,采用免疫组化法观察细胞内磷酸化Sm ad-2(p-Sm ad-2)的蛋白表达,W estern b lot法观察细胞内α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、I型胶原(COL-1)和p-Sm ad-2的蛋白表达,ELISA观察上清液纤维连接蛋白(FN)的蛋白表达,以及RT-PCR观察α-SMA、FN和COL-1A1的mRNA表达水平。结果刺激组α-SMA、FN和COL-1A1的mRNA及α-SMA、FN、COL-1和p-Sm ad-2蛋白的表达显著增加,且均呈时间依从。结论TGF-β1能诱导HPMCs转分化为肌成纤维细胞,其可能的机制与激活了Sm ad信号通路有关。     

人肾系膜细胞Smad-7稳定表达细胞系的筛选及其拮抗TGF-β1作用

目的构建Smad-7基因真核表达载体并筛选获得其稳定表达细胞系，观察Smad-7拮抗TGF-β1对人肾系膜细胞（HMC）的影响。方法用PCR方法从胎肝cDNA文库扩增Smad-7编码序列，将其构入真核表达载体pcDNA3．1／myc-his-B（-），酶切及测序鉴定重组质粒。重组质粒转染HMC细胞，G418筛选获得Smad-7的稳定表达细胞克隆，运用Western Blotting验证目的基因表达。运用MTT和流式细胞术检测稳定表达Smad-7对TGF-β1诱导的拮抗作用。结果酶切和测序证实目的基因被克隆入表达载体，Western Blotting证实目的基因成功表达，获得稳定表达Smad-7的细胞克隆；Smad-7过表达可明显缓解TGF-β1对HMC细胞的生长抑制、细胞周期G1阻滞作用，并可降低TGF-β1对HMC细胞的凋亡诱导作用。结论成功构建Smad-7真核表达载体并获得其稳定表达细胞克隆，过表达Smad-7可拮抗TGF-β1对HMC细胞的影响。     

不同浓度甘草甜素对肝星状细胞增殖的影响及其调控机制的研究

目的探讨不同浓度甘草甜素对肝星状细胞增殖的影响及其调控机制的研究。方法用MTY法检测三组不同浓度甘草甜素对肝星状细胞增殖的抑制率,用免疫细胞化学法检测细胞周期素cyclinE的表达情况。结果MTT法检测不同药物浓度组：空白对照组、0．8mg／L甘草甜素组、1．2mg／L甘草甜素组、1．6mg／L甘草甜素组细胞增殖抑制率分别为0,2．73％,14．75％,25．96％,差异有统计学意义（P〈0．05）;不同浓度甘草甜素组中cyclinE阳性表达细胞数与对照组比较明显减少,且呈浓度依赖性,差异有统计学意义（P〈0．01）。结论甘草甜素能够浓度依赖性的抑制大鼠肝星状细胞增殖;甘草甜素可通过降低细胞周期素cyclinE的表达从而抑制大鼠肝星状细胞增殖。’     

Smad泛素化调节因子2在输尿管梗阻大鼠肾间质损伤中的作用

目的探讨Smad泛素化调节因子2（Smurf2）在输尿管梗阻大鼠（UUO）肾间质损伤中的作用及其机制。方法以Wistar大鼠UUO为模型，采用病理染色、RT-PCR和Western印迹方法检测。结果（1）随着梗阻时间延长，肾间质炎性细胞浸润指数、纤维化指数逐渐加重，Smurf2 mRNA和蛋白、Smad2 mRNA和蛋白逐渐上调（P〈0．01）；TGF-β1mRNA在IJUO后第7天达高峰，此后逐渐下降，但仍明显高于假手术组（P〈0．01）。（2）Smurf2 mRNA和蛋白质与肾间质纤维化指数呈正相关（r=0、911，0．964，P〈0．01），与肾间质炎性细胞浸润指数无相关，与Smad2 mRNA和蛋白呈正相关（r=0．975，0．979，P〈0．01）。结论Smurf2在UUO大鼠肾组织中表达明显增强，它可能通过介导TGF．B1／Smad通路的活化而参与了肾问质纤维化的形成。     

缬草提取物对肺纤维化大鼠转化生长因子-β1的影响

目的探讨缬草提取物对博莱霉素所致肺纤维化大鼠转化生长因子β1（TGF-β1）的影响。方法健康Wistar大鼠气管内一次性注入博莱霉素5mg／kg制造肺纤维化模型,取造模存活大鼠65只,随机分为缬草高剂量组（16只）、缬草低剂量组（16只）、秋水仙碱组（16只）及模型组（17只）4组。造模后第2天始分别灌胃给予缬草提取物100mg／kg、缬草提取物20mg／kg、秋水仙碱100μg／kg及生理盐水10ml／kg,1次／d次。模型组及用药组于第7天各处死大鼠6只,28d处死剩存大鼠。另取8只大鼠,气管内一次性注入生理盐水1．0mL／kg,灌胃给予生理盐水10ml／（kg·d）作为健康对照组,于第28天处死。大鼠处死后,取右下肺叶做HE染色和Masson染色观察肺组织结构的改变;免疫组织化学法检测肺组织中的TGF-β1表达改变。结果模型组鼠观察期内死亡3只（17．65％）,7d肺组织呈现重度肺泡炎改变,合并有TGF-β1表达显著升高,28d肺组织胶原纤维重度增生;缬草组及秋水仙碱组第7天时肺泡炎较模型组减轻,TGF-β1表达较模型组弱（P〈0．05）,第28d缬草组及秋水仙碱组肺纤维化病变较模型组减轻,TGF-β1表达较模型组弱。结论缬草提取物可以有效防治博莱霉素诱导的大鼠肺泡炎及肺纤维化,其机制可能是通过降低TGF-β1的表达来实现。