脂质体介导的hBMP-2基因转染兔骨髓间充质干细胞的实验研究

目的 观察脂质体介导的人骨形态发生蛋白-2(human bone morphogenetic protein-2,hBMP-2)基因转染兔骨髓间充质干细胞 (bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)后mRNA及其蛋白的表达.方法 采用脂质体介导的真核细胞转染技术,将含hBMP-2编码序列的真核表达质粒转染兔BMSCs,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫组化及免疫印迹法(Western blot)等手段检测转染后hBMP-2 mRNA及其蛋白的表达.结果 通过脂质体介导的真核转染方法能成功将外源hBMP-2基因转入兔BMSCs,并经RT-PCR、免疫组化和蛋白印迹法证实,转染pcDNA3.1-hBMP-2 后的兔BMSCs内有大量hBMP-2 mRNA 的转录和蛋白的表达.结论 通过脂质体介导的真核转染方法可以将外源hBMP-2基因转染BMSCs,并使其获得较为稳定的表达.     

hBMP7瞬时转染对兔骨髓间充质干细胞生物学行为的影响

[目的]运用人骨形成蛋白hBMP7(human bone morphogenetic protein-7,hBMP-7)基因体外转染兔骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),观察瞬时转染对兔MSCs生物学行为的影响.[方法]密度梯度离心法培养兔MSCs,在体外分别转染pcDNA1.1/AMP-hBMP7和pcDNA1.1/AMP并留置空白对照.检测转染基因的转录和表达,观察细胞形态和生长情况,检测碱性磷酸酶、钙结节和骨钙素等成骨细胞表型.[结果]hBMP-7基因存在于转染后的骨髓间充质干细胞中并表达相应的mRNA.目的基因表达后细胞形态略有变化,生长曲线与未诱导组无明显变化,钙结节形成,碱性磷酸酶增加,骨钙素表达增强.电镜见胞质中有钙质成分.[结论]hBMP-7基因可促进兔MSCs向成骨细胞表型转化.hBMP-7基因转染的MSCs有望成为组织工程化骨理想的种子细胞.     

hBMP-2基因转染的MSC与藻酸钙凝胶的生物相容性研究

目的探讨人类骨形态发生蛋白-2（human bone morphogenetic protein-2，hBMP-2）基因转染的兔骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells.MSC）与藻酸钙凝胶的生物相容性，为骨组织工程中生物材料的选择提供依据。方法应用脂质体介导的方法将真核表达载体pCDNA3介导的质粒pCDNA3-hBMP-2导入体外培养的兔MSC中，免疫组织化学和RT-PCR检测转染后hBMP-2基因的表达；将G418筛选获得的阳性克隆继续扩增培养，与藻酸钙凝胶复合作为实验组，单纯转染的细胞为对照组，在不同的时间行扫描电镜、四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法、碱性磷酸酶（ALP）、台盼蓝染色检查。结果免疫组织化学和RT-PCR均证实基因转染成功，4周时仍有表达；转染的MSC与藻酸钙复合良好，并能在其中保持活性，活力未受影响。结论hBMP-2基因转染的MSC能够获得瞬时及稳定表达，是一种新型的种子细胞；其与藻酸钙凝胶复合用于骨缺损的修复具有较强的可行性。     

hBMP—4瞬时转染对家兔骨髓基质干细胞生物学行为的影响

目的：应用兔骨髓基质干细胞（bone marrow stromal cells，MSCs）作为基因治疗的靶细胞，体外转染人骨形成蛋白4(human bone morphogentic protein-4，hBMP-4)基因，观察瞬时转染对兔MSCs生物学行为的影响。方法：贴壁法培养兔MSCs，分别在体外转染pEGFP-hBMP-4和pEGFP基因并留置空白对照。检测转染效率及目的基因的转录和表达，观察细胞形态及生长情况，检测碱性磷酸酶、钙结节及骨钙素等成骨细胞表型。结果：基因转染效率达到20％-30％，RT-PCR显示MSCs本身有目的基因的少量转录，转染pEGFP-hBMP-4后转录增强。目的基因转染后细胞形态略有变化，生长曲线与对照组相似，碱性磷酸酶阳性染色面积增加（P=0.0016），钙结节增多（P=0.0001），骨钙素表达增强（P=0.03）。结论：优化的条件下取得了较高的转染效率，hBMP-4基因转染可以增强目的基因的转录，加速MSCs向成骨细胞表型转化。HBMP-4转染的MSCs可望成为组织工程化骨理想的种子细胞。     

hBMP-7基因瞬时转染绝经后骨质疏松大鼠骨髓基质细胞的表达及对其生物学活性的影响

目的观察hBMP-7基因瞬时转染对去卵巢（OVX）大鼠的骨髓基质细胞（BMSCs）生物学特性的影响。方法通过去除双侧卵巢构建SD大鼠绝经后骨质疏松模型后,全骨髓法培养大鼠BMSCs,通过重组腺病毒将hBMP-7基因转染入OVX大鼠BMSCs。观察转染后细胞形态及生长情况以及碱性磷酸酶（ALP）变化。结果荧光显微镜下,转染24h后即可见大量绿色荧光蛋白表达阳性的细胞,基因转染效率高于70%。转染后细胞形态无明显改变,细胞增殖能力没有明显改变,ALP活性明显增高。免疫细胞化学染色结果表明,hBMP-7基因在OVX大鼠BMSCs中得到了有效的表达。结论重组腺病毒能够有效地将hBMP-7基因转染到OVX大鼠BM-SCs中,且hBMP-7能有效表达。基因转染对OVX大鼠BMSCs的增殖无明显影响,转染可促进OVX大鼠BMSCs向成骨细胞分化。     

hBMP-4瞬时转染对兔骨髓基质干细胞生物学行为的影响

目的应用兔骨髓基质干细胞(bonemarrowstromalcells,MSCs)作为基因治疗的靶细胞,体外转染人骨形成蛋白4(humanbonemorphogeneticprotein-4,hBMP-4)基因,观察瞬时转染对兔MSCs生物学行为的影响。方法贴壁法培养兔MSCs,分别在体外转染pEGFP-hBMP-4和pEGFP基因并留置空白对照。检测转染效率及目的基因的转录和表达,观察细胞形态及生长情况,检测碱性磷酸酶、钙结节及骨钙素等成骨细胞表型。结果基因转染效率达到20%～30%,RT-PCR显示MSCs本身有目的基因的少量转录,转染pEGFP-hBMP-4后转录增强。目的基因转染后细胞形态略有变化,生长曲线与对照组相似,碱性磷酸酶阳性染色面积增加(P=0.0016),钙结节增多(P=0.0001),骨钙素表达增强(P=0.03)。结论优化的条件下取得了较高的转染效率,hBMP-4基因转染可以增强目的基因的转录,加速MSCs向成骨细胞表型转化。hBMP-4转染的MSCs可望成为组织工程化骨理想的种子细胞。     

LIM矿化蛋白-1对间充质干细胞成骨分化影响的实验研究

目的：构建LIM矿化蛋白-1（LIM mineralization protein-1,LMP-1）的真核表达质粒,并在兔骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）内表达,研究LMP-1对体外培养BMSCs成骨分化的影响。方法：RT-PCR克隆hLMP-1和骨形态发生蛋白－２（bone morphogenetic protein-2,BMP-2）,并构建pIRES2-EGFP-LMP－1及pIRES2-EGFP-BMP－2重组质粒。分离培养BMSCs,脂质体介导下将pIRES2-EGFP-LMP－1、pIRES2-EGFP-BMP－2和pIRES2-EGFP质粒转染BMSCs。7 d后收集细胞,RT-PCR比较hLMP-1、hBMP-2及Ⅰ型胶原的表达,检测碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性,免疫组化染色比较骨钙素表达。结果：pIRES2-EGFP-LMP-1和pIRES2-EGFP-BMP-2重组质粒构建成功。重组质粒成功转染BMSCs,RT-PCR证实表达目的基因,hLMP-1和hBMP-2转染组可以明显促进细胞分泌ALP的活性,诱导Ⅰ型胶原和骨钙素的表达。结论：LMP-1可以促进BMSCs向成骨细胞分化。     

hBMP-7基因转染对骨髓间充质干细胞增殖和碱性磷酸酶合成的影响

目的探讨逆转录病毒介导的人骨形态发生蛋白7(humanbonemorphogeneticprotein7,hBMP-7)基因转染对兔骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcell,BMSc)增殖和向成骨细胞分化的影响。方法构建hBMP-7逆转录病毒载体,使用含目的基因的病毒液感染BMSc,免疫组织化学方法检测hBMP-7蛋白的表达,MTT法检测细胞增殖能力,使用流式细胞仪检测细胞周期,NPP法检测碱性磷酸酶合成情况。结果经BMP-7基因转染的兔BMSc有hBMP-7的阳性表达,增殖能力无明显改变(P>0.05),但其合成碱性磷酸酶的能力得到显著提高,与空载体病毒液转染、未经转染的BMSc相比差异有显著性(P<0.01)。结论经BMP-7基因转染的BMSc能够表达外源BMP-7,hBMP-7基因转染能够促进体外培养的BMSc向成骨细胞转化,可用于以BMSc为种子细胞的组织工程化骨组织的构建。     

BMSCs胶原刮膜对松质骨缺损的修复

目的 研究成骨蛋白-2(hBMP-2)基因转染骨髓间充质千细胞(BMSCs)胶原刮膜对兔股骨髁松质骨缺损的修复能力。方法 应用影像学、组织学、形态计量学和生物力学等方法,观察未经诱导、OS液诱导和hBMP-2基因转染BMSCs胶原刮膜植入兔股骨髁部直径6 mm、深12 mm松质骨缺损后的修复情况。结果 未经处理的兔股骨髁缺损不能自行愈合;细胞刮膜植入对股骨髁松质骨缺损的修复能力,在8和12周时hBMP基因转染BMSCs组>OS液诱导BMSCs组>未诱导BMSCs组(P<0.05),12周时hBMP基因转染BMSCs组的骨缺损区生物力学强度接近正常松质骨。结论 hBMP基因转染BMSCs胶原刮膜是治疗大块松质骨缺损的理想修复材料。     

经转染人骨形态发生蛋白7基因后骨髓间充质干细胞mRNA的表达

目的 构建人骨形态发生蛋白（human bone morphogenetic protein7，hBMP－7）逆转录病毒载体并检测经逆转录病毒介导基因转染的兔骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cell,MSCs)mRNA的表达。方法 构建hBMP-7逆转录病毒载体后利用脂质介导的基因转移技术转染包装细胞PT67，制备含目的基因的重组逆转录病毒液并感染兔骨髓间充质干细胞，采用原位杂交、RT－PCR检测hBMP－7mRNA在MSCs中的表达。结果 成功构建了hBMP-7逆转录病毒载体，经hBMP－7基因转染的MSCs可表达外源性BMP－7mRNA。结论 采用逆转录病毒介导的方法可以将hBPM－7转染至MSCs中并表达外源性基因。     

陶瓷样异种骨对骨髓基质细胞生长及附着影响的实验研究

目的：探讨陶瓷样异种骨(CXB)与骨髓基质细胞的生物相容性，为CXB复合骨髓移植修复骨缺损提供依据．方法：将理化处理制得的陶瓷样异种骨(CXB)与兔骨髓基质细胞体外复合培养，用倒置相差显微镜及扫描电镜观察CXB对骨髓基质细胞的形态、生长、附着及增殖的影响．结果：CXB对骨髓基质细胞的形态、生长、附着及增殖均无不良影响，显示出良好的生物相容性．结论：CXB具有良好的生物相容性，可望与骨髓复合移植修复骨缺损．     

诱导兔骨髓基质细胞向神经干细胞分化的初步实验研究

目的：观察兔骨髓基质细胞体外培养的生长行为及增殖、分化情况，探讨由骨髓分离培养神经干细胞的可行性和有效性。方法：无菌条件下行骨穿术，密度梯度离心分离获取骨髓基质细胞，利用多种增殖、分化诱导因子和神经干细胞培养液进行培养、分化诱导，用免疫细胞化学方法进行鉴定。结朵：骨髓基质细胞在体外培养中能形成NESTIN抗原阳性的细胞克隆团，进一步分化，部分细胞胞体增大并出芽，逐渐发育成为较成熟的长突起细胞，长突起相互连接、交织成网并建立纤维联系。结论：骨髓基质细胞具有较强的自我更新能力和多向分化潜能，易于取材、体外培养和增殖，在一定诱导条件下可以生成神经干细胞。     

血管内皮细胞生长因子基因转染诱导大鼠骨髓基质干细胞分化为内皮细胞

目的：评价经腺病毒介导的血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因转染后的大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)诱导成内皮细胞的可行性。方法：从大鼠骨髓中分离培养获取BMSCs，分别经Adv-VEGF、Adv-GFP转染，Western印迹分析检测VEGF蛋白的表达情况．细胞生长曲线测定BMSCs增殖特性．同时进行免疫表型鉴定．并与未转染细胞组比较。结果：Adv-VEGF转染组BMSCs可分泌VEGF蛋白，而其杂两组不分泌VEGF蛋白。转染VEGF基因后,BMSCs生长速度变快．向内皮细胞分化。与Adv-VEGF转染组BMSCs相比．Adv-GFP转集细胞组、未转染细胞组的BMSCs生长速度较慢．未有向内皮细胞分化的证据。结论：腺病毒介导的VEGF基因转繁可诱导BMSCs分化成内皮细胞。     

骨形态反应蛋白-2对骨髓基质干细胞与软骨细胞共培养向软骨细胞分化的影响

目的研究细胞因子骨形态反应蛋白-2(BMP-2)与软骨细胞共同诱导骨髓基质干细胞(BMSCs)向软骨细胞分化是否有协同作用,并检测BMP-2对BMSCs和软骨细胞共培养诱导分化为软骨细胞的最佳浓度。方法将体外分别培养扩增的兔BMSCs和软骨细胞按相同的比例(7∶3)混合后,均以5.0×107.mL-1的细胞浓度接种混合培养,根据不同的BMP-2浓度分为以下几组,5、10、20、30、40、50 ng/mL组,以单独培养的软骨细胞作为阳性对照组,以单独培养的BMSCs作为阴性对照组,以混合培养后不加BMP-2作为0 ng/mL组。通过MTT、Ⅱ型胶原蛋白表达以及糖胺聚糖蛋白表达的检测,确定BMP-2与软骨细胞共同作用于BMSCs是否有协同作用及促进BMSCs向软骨细胞转化的最佳BMP-2浓度。结果单独培养BMSCs的阴性对照组向软骨细胞分化的倾向不明显,而与软骨细胞混合培养的0 ng/mL组软骨细胞增多,添加BMP-2的5、10、20、30、40、50 ng/mL组向软骨细胞分化更加明显。结论 BMP-2与软骨细胞共同作用于BMSCs对于其向软骨细胞分化有协同作用,BMP-2的最佳作用浓度为20 ng/mL。     

促血小板生成素基因转染小鼠骨髓基质细胞体外表达的实验研究

目的探讨促血小板生成素(thrombopoietin,TPO)基因修饰的小鼠骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)体外表达TPO的变化特点。方法以脂质体介导法将TPO cDNA真核表达质粒转染BMSCs,RT-PCR方法检测TPO mRNA的表达,免疫组化法及Western blot测定TPO蛋白的表达。结果转染TPO基因的BMSCs其TPO mRNA及TPO蛋白表达量明显高于空载体组(P<0.01)及未转染组(P<0.01)。结论阳离子脂质体能有效介导TPO cDNA真核表达质粒转染BMSCs,且转染后BMSCs中TPO mRNA及TPO蛋白的表达显著上调。     

骨形态发生蛋白-7基因转染骨髓基质细胞后的表达

为了观察重组人骨形态发生蛋白-7(rhBMP-7)基因转染骨髓基质细胞（BMSCs）后的表达及表达产物对BM-SCs增殖的影响，用脂质体介导法将rhBMP-7基因转染BMSCs，用逆转录PCR技术和免疫组化SABC法分别检测其瞬时表达和稳定表达；再用^3H-TdR掺入法检测基因表达产物对正常培养的BMSCs增殖的影响。结果表明：转基因细胞能高效表达外源基因，且表达时间长达4周；基因表达产物能明显促进BMSCs的增殖。该结果为基因增强的组织工程技术用于关节软骨缺损的修复提供了理论依据。     

龟鹿二仙胶汤含药血清对兔骨髓基质干细胞增殖的影响

目的：观察龟鹿二仙胶汤对骨髓基质干细胞（BMSCs）增殖的影响,确定影响BMSCs增殖的最佳中药血清浓度。方法：经前期体外分离、纯化、培养获得兔BMSCs,运用不同浓度的龟鹿二仙胶汤中药含药血清对获得的兔BMSCs进行药物干预24、48、72h后,采用MTT、免疫组化、流式细胞仪等方法,研究龟鹿二仙胶汤对BMSCs增殖的影响。结果：MTT比色实验显示,龟鹿二仙胶各浓度组均能不同程度地促进BMSCs的能量代谢,促进BMSCs增殖,与空白对照组相比有显著差异（P〈0．01）,而且以15倍药物浓度组为最佳。免疫组化结果证实,龟鹿二仙胶汤含药血清可通过促进PCNA表达来控制DNA复制,以15倍龟鹿二仙胶汤药物浓度血清培养时BMSCs表达致密的棕褐色颗粒最多,其他浓度组及TGF—β3组较多,空白对照组则最少。FCM结果显示,二仙胶汤药物血清能显著提高BMSCs增殖指数,且以15倍药物浓度龟鹿血清培养时最明显。结论：龟鹿二仙胶汤刺激BMSCs增值与药物浓度有关,低浓度龟鹿二仙胶汤就能显著刺激BMSCs增殖,无论是48h、72h测验均为15倍药物浓度时具有显著的增值作用,而更高浓度龟鹿二仙胶汤则表现为促进BMSCs增殖作用减弱。     

腺病毒介导的BMP-2基因转染兔骨髓基质干细胞及对其增殖、成骨分化的影响

目的: 用骨形态发生蛋白-2(BMP-2)腺病毒表达载体(Ad-BMP-2)转染兔骨髓基质干细胞(BMSCs),研究转染对其增殖、成骨分化的影响.方法: 用Ad-BMP-2转染兔BMSCs,利用免疫细胞化学法、原位杂交染色和蛋白印迹法检测转染后细胞BMP-2的表达.流式细胞仪观察细胞周期的变化,分析转染对BMSCs增殖的影响.酶标法检测ALP活性;免疫荧光检测骨钙素(OCN)、Ⅰ型胶原表达,分析转染对BMSCs成骨分化的影响.结果: BMP-2基因在转染细胞内mRNA水平和蛋白水平均有较高表达,蛋白印迹法检测到培养液中有BMP-2蛋白阳性表达.流式细胞仪检测G1期、S期细胞比例与空白对照组无差异.ALP活性明显增高,骨钙素、Ⅰ型胶原免疫荧光检测,见胞浆内有大量显绿色荧光的阳性物质.结论: 在腺病毒载体介导下BMP-2基因成功导入BMSCs,细胞增殖未因转染而受影响,并可持续表达基因产物,向成骨细胞分化.     

兔骨髓基质细胞与聚DL-乳酸/羟基磷灰石生物相容性的实验研究

目的检测聚DL-乳酸/羟基磷灰石（PDLLA/HA）复合材料的特性,探讨骨髓基质细胞（BMSCs）与PDLLA/HA的生物相容性,为筛选骨组织工程的支架材料提供依据.方法将BMSCs与PDLLA/HA复合体外培养,通过形态学的观察、细胞增殖率及ALP活性的测定,观察PDLLA/HA对培养细胞的影响.结果复合培养时BMSCs能在PDLLA/HA上贴附、繁殖,其生长及功能不受影响.结论 PDLLA/HA具有良好的细胞相容性,能作为骨组织工程种子细胞的支架材料.