卡氏肺孢子虫体外无细胞培养的建立

目的建立卡氏肺孢子虫(Pneumocystis carinli，Pc)的体外无细胞系培养体系。方法建立Wistar大鼠卡氏肺孢子虫肺炎模型，Pereoll不连续密度梯度离心方法分离、纯化卡氏肺孢子虫。用添加s-腺苷甲硫氨酸(SAM)、N-乙酰氨基葡萄糖苷、腐胺等辅助剂的IMDM培养基体外培养虫体，用四胺银染色和姬姆萨染色方法计数虫体生长增殖情况，并以透射电镜观察培养虫体的超微结构形态。结果添加s-腺苷甲硫氨酸(SAM)等辅助剂的IMDM培养基(在37℃，pH8．0，5％CO2、95％O2条件)能支持Pc的体外生长。Pc包囊原代培养10天可增殖8～9倍，滋养体可增殖11～12倍。原代与传代培养、新鲜分离的与冻存复苏的虫体在培养基内的生长增殖有差别。结论建立了一个比较稳定的Pc体外无细胞系培养体系。     

鸦胆子与补骨脂对大鼠卡氏肺孢子虫肺炎疗效的电镜观察

用鸦胆子和补骨脂合剂2 ml （鸦胆子0.12 mg+补骨脂1.0 mg） 分别治疗经地塞米松皮下注射诱导的卡氏肺孢子虫肺炎（Pneumocystis carinii pneumonia， PCP）的SD大鼠7天和14天，同时设阳性对照组和正常对照组。分别于治疗后剖杀各组大鼠，取肺组织制成切片。透射电镜下观察到治疗组大鼠受损肺组织病变减轻，肺间质、Ⅰ型和Ⅱ型肺泡上皮细胞形态结构修复。说明鸦胆子和补骨脂合剂对卡氏肺孢子虫肺炎病鼠有一定的疗效。     

中药鸦胆子与补骨脂素对卡氏肺孢子虫病大鼠免疫调节的影响

目的 探讨中药鸦胆子和补骨脂素合剂对卡氏肺孢子虫肺炎(PCP)大鼠的免疫调节及杀虫作用。方法 地塞米松皮下注射SD大鼠(2.5mg/只,每周2次,连续6周),建立PCP大鼠模型。药物治疗剂量,每鼠每天口饲中药鸦胆子0.12mg与补骨脂素1mg,连续7d或14d。同时设PCP阳性不治疗对照组及正常大鼠对照组。制作肺组织病理切片观察肺组织病变,制作肺组织印片计数肺孢子虫包囊数观察中药合剂杀虫效果。检测血液中CD4⁺T细胞、CD8+T细胞和α肿瘤坏死因子(TNF-α)的变化,观察中药合剂对PCP大鼠的免疫调节作用。结果 治疗组大鼠,受损的肺组织病变减轻或修复,体重明显回升,肺组织包囊数明显低于阳性对照组(P<0.05)。血液中CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞和TNF-α均较阳性对照组升高(P<0.05)。结论 中药鸦胆子和补骨脂素合剂治疗PCP大鼠,可增强免疫调节作用,并可抑制及杀灭卡氏肺孢子虫。     

补骨脂与鸦胆子对感染卡氏肺孢子虫大鼠IL-2水平和NK细胞活性的影响

中药补骨脂（10.0 mg/kg）、鸦胆子（1.2 mg/kg）及两药合剂（补骨脂5.0 mg/kg，鸦胆子0.6 mg/kg）治疗PCP卡氏肺孢子虫肺炎（PCP）大鼠。通过检测脾NK细胞活性和血清IL-2水平，探讨两药对PCP大鼠的免疫调节作用。结果表明，与PCP模型对照组比较，补骨脂治疗组血清IL?鄄2诱生水平（526.1±5.5） pg/ml和脾NK细胞活性（27.1%±0.8%）均显著升高（P<0.01），两药合剂组其次［（314.7±6.7) pg/ml， (22.9%±0.9%）（P<0.05）］，鸦胆子组较低［（285.4±6.1） pg/ml， （20.7%±1.0%） （P<0.05）］。补骨脂和鸦胆子具有增强PCP大鼠免疫调节的作用。     

肺孢子虫肺炎大鼠支气管肺泡灌洗液酶含量变化及大蒜素治疗对其影响

目的 研究卡氏肺孢子虫肺炎(PCP)大鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)酶含量变化以及大蒜素治疗对其影响。 方法 用地塞米松连续肌肉注射Wistar大鼠， 诱导建立PCP大鼠模型。诱导第3、6、9周分别于后腿肌肉深部注射大蒜素治疗（10 mg/kg， 1次/d， 连续5 d）。同时设甲氧苄氨嘧啶(TMP)?鄄磺胺甲基异噁唑(SMZ)治疗对照组(SMZ/TMP组)、 PCP模型对照组和空白对照组。 于最后1次治疗3 d后处死大鼠， 无菌收集BALF， 测定谷草转氨酶(AST)、 谷丙转氨酶(ALT)、 胆碱脂酶(CHE)、 碱性磷酸酶(ALP)、 乳酸脱氢酶(LDH)、 肌酸激酶(CK)及其同工酶(CKMB)、 a?鄄羟丁酸脱氢酶(HBDH)、 a?鄄L?鄄岩藻糖甘酶(AFU)、 5′-核苷酸酶(5′NT)及腺苷脱氨酶(ADA)含量。 结果 PCP模型组ALP含量［（573.41 ± 350.63） U/L］显著高于空白对照组［（210.56 ± 114.41） U/L］（q=4.682， P<0.01）、 大蒜素治疗组［（392.07 ± 217.57） U/L］（q=3.851， P<0.05）以及SMZ/TMP组［（325.21 ± 180.65） U/L］（q=4.380， P<0.01）。 CK、 CKMB及5′NT含量， PCP模型对照组［依次为948.94 ± 403.43、 489.47 ± 254.46及（6.76 ± 3.11） U/L］显著高于空白对照组［426.22 ± 319.00、 213.33 ± 144.54及（3.22 ± 1.20） U/L］（q=4.696， 3.784， 3.812， P<0.05）。AST、 ALT、 CHE、 LDH、 HBDH、 AFU及ADA含量， 4组之间差异均无统计学意义(F=1.852， 0.958， 2.470， 1.423， 1.178， 1.342， 0.611， P>0.05)。 结论 PCP大鼠BALF中ALP、 CK、 CKMB及5′NT含量显著升高, 大蒜素治疗可使ALP含量显著降低。     

感染卡氏肺孢子虫大鼠血清中可溶性细胞黏附分子-1（sICAM-1）变化的研究

目的 检测卡氏肺孢子虫肺炎(PCP)大鼠血清中可溶性细胞黏附分子-1（sICAM-1）水平, 以及经复方磺胺甲噁唑（TMP-SMZ）治疗后对sICAM-1含量的影响。 方法 纯系Wistar大鼠50只, 随机分为 PCP模型组（P组18只）、TMP?鄄SMZ治疗组（S组18只）及正常对照组（N组14只）。P组及S组于大鼠后腿肌肉注射地塞米松（1 mg/只，每周2次、间隔3 d），诱导建立PCP大鼠模型。N组同法注射生理盐水。镜检确认PCP诱导成功后，S组从第3周起灌胃TMP-SMZ[每天1次, 250 mg/（kg·d）］，5 d为1 疗程，间隔2周，共3个疗程。分别于第0、3、6、9及12周取血, 检测血清中sICAM-1水平，观察肺脏、肝脏病理及病原学变化。 结果 血清sICAM-1水平，P组第3周的(1.847±0.50)ng/ml显著低于第0周的（2.407±0.81) ng/ml(P<0.05)； S组第3周的(1.787±0.59) ng/ml显著低于第0周的（2.478±0.59) ng/ml(P<0.01), 以后逐渐上升。P组第9周的（3.233±0.83) ng/ml、 12周（3.984±0.87) ng/ml显著高于第0周的（2.407±0.81) ng/ml(分别为P<0.05, P<0.01)； S组第12周的（3.621±1.62) ng/ml显著高于第0周的（2.478±0.59) ng/ml(P<0.05)。P组与S组第9、12周[分别为(2.697±0.78) ng/ml及(3.621±1.62) ng/ml] 均显著高于N组(分别为P<0.05、P<0.01)。S组与P组间差异无统计学意义(P>0.05)。 结论 大鼠血清中sICAM-1含量较低，但在诱导PCP后其含量显著增高。     

蒿甲醚用于卡氏肺孢子虫肺炎大鼠的治疗及其对IL-6影响的研究

目的 从病理学和细胞因子角度探讨蒿甲醚对大鼠卡氏肺孢子虫肺炎（Pneumocystiscarinii Pneumonia POP）的治疗效果和作用机理。方法 给SD大鼠皮下注射地塞米松磷酸钠建立卡氏肺孢子虫肺炎动物模型，治疗组给予蒿甲醚治疗。ELISA双抗夹心法分别检测血清和支气管肺泡灌洗液中1L-6水平。结果 与感染对照组比较，蒿甲醚治疗组症状显著改善、肺印片中卡氏肺孢子虫包囊数目显著减少、肺组织炎症明显减轻、血清和肺泡灌洗液中IL-6水平明显下降。结论 蒿甲醚具有一定抗大鼠卡氏肺孢子虫肺炎作用，能够降低PCP大鼠IL-6。     

大鼠支气管肺泡灌洗液中肺孢子虫的超微结构观察

目的观察大鼠支气管肺泡灌洗液中肺孢子虫的超微结构。方法Wister大鼠皮下注射地塞米松8周,诱导建立肺孢子虫肺炎的动物模型。乙醚麻醉下处死大鼠,收集大鼠的支气管肺泡灌洗液,浓缩病原体,扫描电镜下观察肺孢子虫的超微结构。结果扫描电镜下可见Wister大鼠源肺孢子虫有两种形态一种虫体表面光滑,近球形,大小3~5μm,且部分光滑型虫体表面有2~3个脐形凹陷,凹陷上可见数个微孔;另一种虫体表面粗糙,形态近球形或不规则形,大小5~9μm,虫体表面可见不同形态的突起、伪足、微孔、凹陷等。结论扫描电镜下大鼠源肺孢子虫有光滑型及粗糙型两种形态,认为前者是包囊后者为滋养体。     

卡氏肺孢子虫肺炎大鼠模型的比较研究

目的　比较用SpragueDawley(SD)大鼠和Wistar大鼠建立卡氏肺孢子虫肺炎 (PCP)模型的差异。 方法　选用SD大鼠和Wistar大鼠 ,随机分为实验组和对照组 ,免疫抑制诱导建立动物模型 ;收集肺组织和支气管肺泡灌洗液 (BALF) ,分别制成肺印片和BALF涂片 ,作Giemsa染色 ,镜检卡氏肺孢子虫滋养体和包囊。结果　共收集实验组SD大鼠和Wistar大鼠的肺组织及BALF标本各 2 8份 ,经Giemsa染色后 ,在肺印片中查见Pneumocystiscarinii(Pc)虫体的阳性率分别为 89.2 9%和10 0 % ,两者之间无显著性差异 (P >0 .0 5 ) ;BALF阳性率分别为 6 0 .71%和 78.5 7% ,两者之间亦无显著性差异 (P >0 .0 5 )。而同种大鼠的肺印片与BALF涂片 ,其阳性率之间有显著性差异 (P <0 .0 5 ) ,且肺印片的检出率均显著高于BALF涂片。同种大鼠不同肺叶的肺印片 ,其阳性率之间无显著性差异 (P >0 .0 5 )。结论　SD大鼠与Wistar大鼠作为PCP模型动物无明显差别     

双氢青蒿素对大鼠体内卡氏肺孢子虫作用的超微结构研究

目的 研究双氢青蒿素（DHA）治疗对大鼠体内卡氏肺孢子虫（PC）超微结构的影响。方法 以地塞米松磷酸钠对Wistar大鼠进行皮下注射，建立卡氏肺孢子虫肺炎（PCP）动物模型，用60mg／kgDHA治疗实验大鼠，杀鼠取肺，用透射和扫描电镜观察大鼠肺内PC的超微结构变化，并与感染对照组进行比较。结果 透射电镜发现PC滋养体表膜和核膜破裂，胞质中出现大量空泡和高电子密度颗粒，PC包囊中也出现空泡，囊内小体变性坏死；扫描电镜发现PC滋养体丝状伪足和微绒毛稀疏、变短甚至脱落，表膜出现缺损。结论 DHA可破坏PC滋养体和包囊。     

Genotypes of clustered cases of Pneumocystis carinii pneumonia

Reports of outbreaks of Pneumocystis carinii pneumonia (PCP) among human immunodeficiency virus-negative immunocompromised patients have suggested a person-to-person transmission of P. carinii. In this study, 17 bronchoalveolar lavage isolates from patients in 3 PCP outbreaks were genotyped, 2 in renal transplant recipients and 1 outbreak among patients with haematological disorders. Genotypes in the P. carinii sp. f. hominis (P. carinii f.sp. hominis) mt large subunit ribosomal RNA site 85 were detected by 2 methods: direct sequencing and 3 different allele-specific polymerase chain reaction assays. Although limited data on patient contacts were available, the detected P. c. hominis genotypes do not support person-to-person transmission as the predominant transmission route of P. carinii in humans.     

PCR检测大鼠卡氏肺孢子虫的研究

目的探讨PCR技术检测大鼠卡氏肺孢子虫的应用价值。方法SD大鼠和Wistar大鼠均随机分成实验组和对照组,实验组每周两次皮下注射醋酸可的松,诱导产生卡氏肺孢子虫;8week后,收集肺组织和支气管肺泡灌洗液(BALF),用PCR技术检测卡氏肺孢子虫DNA,并与Giemsa染色法比较。结果实验组两种大鼠肺组织卡氏肺孢子虫DNA阳性率分别为9643%和100%,BALF阳性率亦分别为9643%和100%,它们之间均无显著性差异(P>005);BALF的PCR阳性检出率显著高于Giemsa病原染色法,肺组织的两种方法检出率无显著性差异。结论PCR是一种检出率较高的方法,可作为早期诊断PCP的常规方法,特别适用于BALF检测卡氏肺孢子虫DNA。     

Rapid detection of dihydropteroate polymorphism in AIDS-related Pneumocystis carinii pneumonia by restriction fragment length polymorphism

Sulpha agents, which act by inhibiting the enzyme dihydropteroate synthase (DHPS), are used widely for the treatment and prophylaxis of Pneumocystis carinii pneumonia (PCP). Recently, we have shown that mutations in the dihydropteroate synthase (DHPS) gene of Pneumocystis carinii f.sp hominis are associated with failure of sulpha prophylaxis and increased mortality in HIV-1 positive patients with PCP, suggesting that DHPS mutations may cause sulpha resistance. To facilitate detection of DHPS mutations we developed a restriction fragment length polymorphism (RFLP) assay, detecting mutations at codon 55 and 57 of the P. carinii DHPS gene. The RFLP-assay was compared with direct DNA sequencing on 27 PCP isolates from HIV-1 positive patients with a mixture of wildtype and mutant DHPS types. In all samples the RFLP-assay correctly identified wildtype or DHPS mutation at codon 55 or 57. Combined with DNA extraction by a Chelex-based method, this method can be performed within 1 d and allows a fast, cost-efficient and reliable method of detection of DHPS mutations in P. carinii.     

免疫抑制不同时间血液及BALF中细胞成分的变化与卡氏肺孢子虫及炎性细胞反应之观察

目的实验观察GC免疫抑制对卡氏肺孢子虫肺炎的发病影响。方法采用清洁级Wistar大鼠31只,26只大鼠每w 2次皮下注射地塞米松建立PCP模型,阴性对照组(5只),在第2、4、6、8w分别杀死大鼠,采集血液及BALF进行细胞计数并涂片分析血液和BALF中细胞成分。结果PCP大鼠血液中白细胞总数为(35.8±4.35)×109/L,淋巴细胞比例为(23.4±8.2)%,巨噬细胞数为(8.4±1.09)%,中性粒细胞比例为(68.2±8.35)%。PCP大鼠BALF中白细胞细胞总数为(35.24±8.10)×106/L,巨噬细胞比例为(84.9±2.49)%,淋巴细胞比例为(10.0±2.56)%,中性粒细胞比例为(5.1±1.73)%。结论PCP组中淋巴细胞减少是导致大鼠发生卡氏肺孢子虫感染的最关键的原因。大鼠BALF中巨噬细胞减少和功能减弱对卡氏肺孢子虫感染发生起主要帮助作用。中性粒细胞增加,推测和肺损伤有关。     

Continuous axenic cultivation of Pneumocystis carinii

Continuous axenic culture of Pneumocystis carinii has been achieved. A culture vessel is used that allows for frequent medium exchange without disturbance of organisms that grow attached to a collagen-coated porous membrane. The growth medium is based on Minimal Essential Medium with Earle's salt supplemented with S-adenosyl-L-methionine, putrescine, ferric pyrophosphate, N-acetyl glucosamine, putrescine, p-aminobenzoic acid, L-cysteine and L-glutamine, and horse serum. Incubation is in room air at 31 degrees C. The pH of the medium begins at 8.8 and rises to approximately 9 as the cells grow. Doubling times calculated from growth curves obtained from cultures inoculated at moderate densities ranged from 35 to 65 hours. With a low-density inoculum, the doubling time is reduced to 19 hours. The morphology of cultured organisms in stained smears and in transmission electron micrographs is that of P. carinii, and P. carinii-specific mAbs label the cultured material. Cultured organisms are infective for immunosuppressed rats and can be stored frozen and used to reinitiate culture.     

聚合酶链反应方法检测诱导排痰标本对卡氏肺孢子虫肺炎的诊断价值

目的 评价聚合酶链反应方法检测诱导排痰标本中卡氏肺孢子虫DNA对卡氏肺孢子虫肺炎（PCP）的诊断意义。方法 分别用姬姆萨和六胺银（GMS）两种染色方法和mt-rRNA-PCR方法检测痰液中的卡氏肺孢子虫。结果 化学染色法检测16例临床拟诊PCP的患者痰标本。结果 8例阳性,20例非PCP患者痰标本均为阴性,化学染色方法的敏感性和特异性分别为50％和100％。PCR方法检测16例临床拟诊PCP患者痰液中卡氏肺孢子虫,14例阳性,20例非PCP患者痰标本均为阴性,mt-rRNA-PCR方法的敏感性和特异性分别为88％和100％。结论 姬姆萨和GMS两种细胞化学染色方法联合检测痰标本卡氏肺孢子虫,特异性高,但敏感性偏低。mt-rRNA-PCR检测痰标本中卡氏肺孢子虫DNA方法敏感性高于化学染色法且特异性高,更适于临床应用。     

大鼠卡氏肺孢子虫的三个基因序列分析

目的 分析我国大鼠源卡氏肺孢子虫的基因序列特征。方法：以Wistar大鼠建立肺孢子虫肺炎动物模型,收集鼠肺,抽提DNA,以PCR方法扩增卡氏肺孢子虫的5SrRNA基因、线粒体rRNA大亚基基因（mtLSU rRNA）、胸腺嘧啶核苷酸合成酶基因（TS）。纯化扩增产物,直接测序。检索基因库（GenBank）,进行序列比较。结果 三个基因的PCR扩增呈阳性。感染Wistar大鼠的卡氏肺孢子虫5S rRNA基因与gb|S78185|S78185、gb|M28193|PMCRAA两个序列同源性分别为93.3%和91.7%;mtLSU rRNA基因与gb|U20173|PCU20173 、gb|U20169|PCU20169两个序列同源性分别为76.2%和55.2%;TS基因与gb|M25415|PMCTHYSY、gb|S77510|S77510两个序列同源性均为90.9%。结论 Wistar大鼠感染的卡氏肺孢子虫的三个基因与GenBank内的相应基因序列同源性较高。     

Development and characterization of a molecular viability assay for Pneumocystis carinii f sp hominis

Pneumocystis carinii pneumonia (PCP) remains the most common opportunistic infection among human immunodeficiency virus-infected persons. Despite this, little is known concerning the transmission dynamics of this infection. In the absence of a reliable method to isolate and culture P. carinii from environmental samples, it has not been possible to assess the importance of person-to-person transmission in the epidemiology of PCP. A molecular viability assay was developed for the human form of P. carinii (P. carinii f sp hominis) that is applicable to both clinical specimens and environmental samples. This assay will enable the evaluation of the spread and persistence of viable human P. carinii in the environment.     

双氢青蒿素对卡氏肺孢子虫超微结构的影响

目的　观察双氢青蒿素对卡氏肺孢子虫超微结构的影响。方法　以醋酸可的松皮下注射 Wistar大鼠 6周 ,诱导建立肺孢子虫肺炎动物模型 ,用双氢青蒿素治疗大鼠 ,并用电镜观察大鼠肺切片中肺孢子虫超微结构。结果　双氢青蒿素可使肺孢子虫滋养体胞浆及包囊内出现空泡 ,线粒体肿胀、核膜破裂、内质网肿胀 ,囊内小体溶解破坏等超微结构改变。结论　双氢青蒿素主要对卡氏肺孢子虫膜系结构产生破坏作用