野生基因p53联合TNF-α对Hep3B凋亡作用的研究

  目的 研究补充外源性的野生型p53（wt-p53）基因联合应用小剂量TNF-α对人肝癌Hep3B细胞的凋亡作用。方法 采用lipofectAMINE 和Plus介导的脂质体转染技术将人wt-p53质粒pCEP4wtp53和空载体pCEP4导入人肝癌细胞系Hep3B内, 于转染p53 基因12 h后，在培养基中加入肿瘤坏死因子-α（20 μg／ml）。免疫荧光法检测p53蛋白定位表达。DNA片断分析法、原位末端标记（TUNEL）法观察细胞的凋亡情况。结果 TNF-α可导致细胞凋亡，与阴性对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；wt-p53组及wt-p53+TNF-α组的Hep3B细胞内有p53表达，并且能促进凋亡；TNF-α与wt-p53二者联用凋亡作用更加显著。结论 wt-p53与小剂量TNF-α联用对Hep3B肿瘤细胞有协同促进凋亡的作用。     

反义端粒酶RNA基因对肝癌细胞的抑制作用

目的：研究逆转录病毒载体介导的反义端粒酶RNA基因对肝癌细胞的抑制作用，探讨通过抑制端粒酶活性治疗肝细胞癌的有效途径。方法：采用电穿孔法将携带正反义端粒酶RNA基因的逆转录病毒载体导入PT67包装细胞，G418筛选获得稳定产病毒细胞株，收集逆转录病毒上清并感染人肝癌HepG2细胞，G418筛选获得稳定转染细胞克隆并扩增培养，经PCR鉴定后，通过MTT法分别检测转染正反义端粒酶RNA基因组肝癌细胞（HepG2-hTR—EcoRⅠ和HepG2-hTR—BamHⅠ）以及未转染端粒酶RNA基因组细胞（HepG2）的生长，免疫荧光化学检测肝癌细胞增殖，TRAP—PCR—ELⅠSA法检测细胞的端粒酶活性，流式细胞术检测各组细胞所处的细胞周期及凋亡率。结果：基因转染后经PCR扩增可于约500bp处检测到目的基因的表达。转染反义端粒酶RNA基因的HepG2一hTR—BamHⅠ组细胞生长受到明显抑制；抗中性粒细胞核增殖抗原（PCNA）表达减少；实验组端粒酶活性为（2．31±0．16），较HepG2-hTR—EcoRⅠ组（3．24±0．20）及HepG2组细胞（3．22±0．17）明显下降（P〈0．01）；流式细胞术检测显示实验组细胞的凋亡率为（9．58±1．38）％，与对照组相比差别具有显著性（P〈0．01）；实验组细胞出现G2／M期阻滞。结论：端粒酶RNA是端粒酶活性表达的一个重要组成部分，通过反义技术下调其表达能够抑制肝癌细胞生长增殖，并诱导其凋亡。     

突变p53基因的反义拯救研究

目的研究p53基因的个体性反义RNA联合野生型p53（wt-p53）对乳腺癌细胞的增殖抑制作用，探讨体外双重基因治疗的意义。方法将wt-p53重组质粒pC53-SN3转染人乳腺癌MDA—MB-231细胞，G418筛选稳定表达wt—p53的细胞克隆（WTp53—231细胞）；体外构建针对MDA—MB-231细胞p53基因突变外显子8（exon8）的反义表达载体[pGEM3zf（＋／-）p53exon8]，并制备其反义RNA（ASp53exon8＇RNA）；以MDA—MB-231细胞为对照，阳离子脂质体介导下ASp53exon8’RNA转染wTp53—231细胞；转染48h后，用MTT法检测细胞生长活性，TUNEL法检测细胞凋亡情况，免疫细胞化学LSAB染色法检测p53蛋白的表达。结果ASp53exon8’RNA转染wTp53—231细胞与ASp53exon8’RNA转染MDA—MB-231细胞比较，前者可进一步抑制肿瘤细胞增殖和诱导凋亡。结论p53基因的个体性反义RNA联合wt—p53共转染可协同抑制乳腺癌细胞增殖，达到“反义拯救”基因治疗目的。     

p73基因过量表达对人肺癌细胞A549凋亡及其化疗敏感性的作用

背景与目的：部分非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）表达野生型p53基因（wild-type p53,wt-p53）,因此在基因治疗中克服这些NSCLC对wt-p53的抵抗机制就非常重要。P53基因家族的新成员p73是p53的同源体,本研究旨在探讨对wt-p53基因治疗抵抗的人肺腺癌细胞A549在外源p73基因转染或联用化疗药后凋亡程度和对化疗药物敏感性的变化。方法：将真核表达重组质粒pcDNA3-HA-p53或pcDNA3-HA-p73α转染入A549细胞,G418筛选,Western blot检测P53或P73α的表达。MTT法分析转染细胞对顺铂和阿霉素的敏感性,用流式细胞术、TUNEL法和DNA片段法分析化疗药作用下转染细胞的凋亡变化,克隆形成实验观察细胞生物学性状的改变。结果：转染p53或p73α基因的A549细胞可以稳定高表达p53或p73α蛋白。转染p73α的A549细胞在原本没有明显抑制和杀伤作用的药物浓度（6．25μmol／L的顺铂或0．25μmol／L的阿霉素）作用下生长明显受到抑制。顺铂的IC50值从22．65μmol／L降至3．75μmol／L,阿霉素的IC50值从4．20μmol／L降至0．06μmol／L。p73能使A549细胞受顺铂和阿霉素诱导的细胞凋亡增加。而p53没有明显作用。流式细胞术显示p73α基因转染后,顺铂诱导的细胞凋亡率从10．6％升高到36．8％（P〈0．01）,阿霉素诱导的细胞凋亡率从13．0％升高到41．1％（P〈0．01）。克隆形成实验显示．p73α基因转染能明显降低顺铂和阿霉素作用后A549细胞的克隆形成数（P〈0．01）。对顺铂和阿霉素的化疗增效倍数分别为2．0和2．4倍。结论：外源性p73基因的导入增加了wt-p53型A549细胞对顺铂和阿霉素等化疗药的敏感性。该作用可能与p73基因能不依赖于p53基因诱导细胞凋亡有关。p73基因可用于治疗wt-p53不能发挥作用的恶性肿瘤。     

人p53/GFP融合基因在高转移人肝癌细胞中的表达与定位

通过将野生型p53(wt-p53)基因与荧光蛋白(GFP)基因的融合,导入高转移肝癌细胞中,并利用荧光蛋白的示踪作用,观察p53基因在肝癌细胞中的正常表达及定位情况.根据野生型p53基因的编码顺序,PCR方法扩增突变的wt-p53基因,使其3’端的终止密码TGA突变为TGG;用基因重组技术将其与GFP融合,通过真核表达质粒-脂质体介导,导入人高转移肝癌细胞系MHCC97(PCR检测有p53基因突变)中.用荧光显微镜观察p53的表达情况.实验表明,     

氧化铁磁性纳米颗粒介导wt-p53基因对肺腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的：探讨氧化铁磁性纳米颗粒介导野生型p53基因（wild type p53,wt-p53）对耐顺铂人肺腺癌细胞A549/DDP增殖抑制和凋亡诱导的作用。方法：氧化铁磁性纳米颗粒介导wt-p53转染肺腺癌细胞A549/DDP作为实验组,以纳米颗粒介导空载体pcDNA3转染作为阴性对照组,脂质体介导wt-p53转染作阳性对照组。MTT法和绘制生长曲线观察基因转染对A549/DDP细胞增殖抑制作用,荧光显微镜、流式细胞术观察其对A549/DDP细胞诱导凋亡作用,RT-PCR检测其对A549/DDP细胞Bax mRNA表达的影响。结果：氧化铁磁性纳米颗粒介导wt-p53对人肺腺癌细胞A549/DDP增殖有持续的抑制作用,而以脂质体介导wt-p53对增殖抑制作用持续时间短暂;纳米颗粒介导wt-p53对人肺腺癌细胞A549/DDP诱导凋亡作用明显强于以脂质体载体;同时介导wt-p53上调Bax mRNA表达水平的作用也明显强于以脂质体载体。结论：氧化铁磁性纳米颗粒介导wt-p53转染对人肺腺癌细胞A549/DDP有持续的增殖抑制和诱导凋亡的作用。     

顺铂对宫颈癌HeLa细胞端粒酶活性和凋亡及p53和bcl-2 表达的影响

目的观察顺铂对 HeLa 细胞端粒酶活性、凋亡及其 p53、bcl-2 表达的影响,以揭示顺铂抗宫颈癌的机理.方法运用体外细胞培养技术,以不同浓度的顺铂作用于培养的 HeLa 细胞 72 h,通过端粒酶重复序列扩增-酶联免疫吸附法(TRAP-ELISA)检测细胞端粒酶活性,以及流式细胞术观察细胞凋亡及 p53、bcl-2 的表达.结果顺铂能以浓度依赖方式下调端粒酶活性并诱导细胞凋亡,使其 bcl-2 基因的表达显著降低,而 p53 基因的表达则增强.端粒酶活性下调与细胞凋亡及其 p53、bcl-2 基因表达紧密相关,P＜0.01.结论顺铂能下调端粒酶活性,诱导细胞凋亡,使 bcl-2 表达降低和 p53 表达增强,这可能是顺铂抗癌作用的重要机制之一.     

反义端粒酶RNA对SMMC7721肝癌细胞系的作用

目的　观察反义端粒酶RNA对SMMC 772 1肝癌细胞系的作用 ,探讨抗端粒酶治疗在原发性肝癌治疗中的意义。方法　采用脂质体介导的方式将潮霉素抗性的反义端粒酶RNA真核表达载体PBBS2 12 /hTR转入SMMC772 1肝癌细胞中 ,经潮霉素筛选 ,克隆细胞株扩增鉴定后 ,采用TRAP PCR ELISA及FCM、电镜检测反义端粒酶RNA对SMMC 772 1细胞端粒酶活性和细胞凋亡的影响。结果　TRAP PCR ELISA法检细胞端粒酶活性的检测结果为 :实验组吸光度值为 0 .482 ,对照组吸光度值为 2 .86 1;FCM检测细胞凋亡结果为 :实验组 13 .8% ,对照组未见有凋亡峰形成 ,电镜观察发现转染反义端粒酶RNA的SMMC772 1细胞具有典型的凋亡细胞形态 ,细胞发生较多的凋亡。结果表明反义端粒酶RNA显著抑制SMMC772 1肝癌细胞的端粒酶活性 ,并且对其有显著的促凋亡作用。结论　反义端粒酶RNA能有效地抑制肝癌细胞端粒酶活性 ,同时显著促进癌细胞凋亡。借助抑制细胞端粒酶活性的手段来达到阻止肿瘤生长的目的 ,为肝癌的治疗提供了新的途径。     

核酶对食管癌EC9706细胞端粒酶活性及凋亡的影响

目的：观察针对人端粒酶RNA模板区的核酶对食管癌细胞端粒酶活性和细胞凋亡的影响。方法：利用脂质体Lipofectamine介导，将已构建好的带有端粒酶核酶基因的重组质粒pBBS212Rz及空载质粒pBBS212转染食管癌EC9706细胞，采用TRAP—ELISA法检测端粒酶活性，用倒置相差显微镜及流式细胞仪观察细胞生长和凋亡情况。结果：重组质粒pBBS212Rz转染的食管癌EC9706细胞的端粒酶活性明显下降，细胞生长速度明显变慢，凋亡加速。结论：端粒酶核酶对食管癌细胞端粒酶活性和细胞生长有抑制作用，可望成为食管癌基因治疗的新方法。     

p53转染对肝癌细胞系Hep3B的作用

目的：研究野生型和突变型p５３基因cＤＮＡ转染对肝癌细胞系Ｈep３Ｂ的作用。方法：通过采用脂质体介导转染技术,将野生型、突变型p５３的真核表达重组质空载体质粒分别导 入一种p５３和Ｒb基因缺失的肝癌细胞系Ｈep３Ｂ。结果：经Ｇ４１８筛选获得稳定的整合了野生型p５３的克隆（wide-type p53, wt-p53)、突变型p53细胞表达p53细胞的p２１＾wafl/cipl蛋白表达水平升高。wt-p53细胞生长较ＴＤＮ Ｐ５３、pＮeo细胞缓慢,但不出     

野生型p53基因对肝癌细胞多药耐药的逆转作用及其相关机制

背景与目的：细胞凋亡的发生机制在肿瘤多药耐药中起重要作用,野生型p53基因是细胞凋亡的激活剂,与肿瘤多药耐药密切相关。本研究旨在探讨野生型p53基因能否实现对肝癌细胞多药耐药的逆转以及逆转的相关机制。方法：构建野生型P53蛋白表达序列的真核表达载体pCR3．1-p53,用脂质体转染技术建立人肝癌细胞Bel-7402的p53转染细胞株,对转染细胞株进行MTT实验,观察p53基因对肿瘤细胞生长的抑制作用和对肝癌细胞对长春新碱（vincristine,VCR）药物敏感性的影响,姬姆萨染色法观察细胞形态,免疫组织化学SP法检测细胞P糖蛋白（P—glycoprotein,P—gp）的表达,逆转录PCR法检测细胞内mdr1、MRP、GSTπ、TopoⅡ mRNA的表达。结果：转染p53的Bel—p53细胞生长明显慢于未转染的Bel-7402细胞。转染野生型p53的Bel-p53细胞在VCR浓度为0．01μg／ml,0．1μg／ml,1．0μg／ml,10μg／ml,25μg／ml时,其药物敏感性增加;VCR作用最佳浓度为1．0μg／ml。形态学检查转染细胞,在VCR作用下细胞数明显减少,细胞散在不成片、细胞高度水肿、胞体不规则突起,可见核固缩、核裂解、核溶解。p53基因对Bel-7402细胞的mdr1／P—gP的表达有明显的抑制作用．对TopoⅡα基因的表达有上调作用,对GSTπ、MRP基因表达没有影响。结论：p53基因对肝癌细胞多药耐药有逆转作用．其逆转机制可能与降低mdr1／P—gp的表达、上调TopoⅡα的表达．从而增加细胞内VCR药物浓度和VCR药效有关。     

HBV感染与hTERT基因表达在肝细胞癌组织中的相关性研究

目的 :研究hTERT基因在HBsAg阳性与阴性肝细胞癌 (hepatocellularcarcinoma ,HCC)患者组织中表达的差异 ,探讨HBV病毒感染与hTERT基因表达在HCC中的相关性。方法 :应用免疫组化 (SP法 )和半定量逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)分别检测 73例HCC患者组织中hTERT蛋白及其mRNA的表达情况 ,其中HBsAg阳性 5 3例 ,HBsAg阴性 2 0例 ,比较二者表达的差异。结果 :hTERT蛋白在HBsAg阳性HCC组织中的阳性表达为 48/5 3 ,在HBsAg阴性HCC组织中阳性表达为 12 /2 0 ,两组病例hTERT蛋白表达阳性率差异有统计学意义 ,P <0 0 1;hTERTmRNA在HB sAg阳性HCC组织中阳性表达为 46/5 3 ,hTERTmR NA在HBsAg阴性HCC组织中阳性表达为 11/2 0 ,两组病例hTERTmRNA表达阳性率差异有统计学意义 ,P <0 0 5 ;统计学分析显示 ,HCC中HBsAg与hTERTmRNA的表达有显著关联性 ,与hTERT蛋白的表达强度成系统性的线性趋势 ,P <0 0 1。结论 :HBsAg阳性HCC组织中hTERT基因表达的阳性率和阳性强度均明显高于HBsAg阴性HCC组织 ,差异有统计学意义 ,P <0 0 5 ;HCC中HBV病毒感染与hTERT基因表达之间具有相关性 ,提示在HCC发生发展中可能存在二者的相互作用     

肝细胞癌端粒酶活性及hTERT mRNA表达与术后早期复发的关系

目的：研究肝细胞癌端粒酶活性及人端粒酶逆转录酶（hTERT）mRNA表达与肝细胞癌术后早期复发的关系。方法：采用ELISA—TRAP法检测60例肝癌组织及其癌旁组织端粒酶活性，RT—PCR法检测hTERT mRNA表达，5例正常肝脏组织作为对照。分析端粒酶活性及hTERT mRNA表达与临床病理之间的关系。结果：肝癌组织端粒酶活性及hTERT mRNA表达阳性率分别为86．7％（52／60）及90％（54／60），癌旁组织端粒酶活性及hTERT mRNA表达阳性率分别为40％（24／60）及43．3％（26／60）。正常肝脏组织均未检测到端粒酶活性及hTERT mRNA表达。癌旁组织端粒酶活性及hTERT mRNA表达与术后早期复发及包膜浸润、门静脉侵犯、肝内转移等恶性肿瘤的恶性生物学行为有关。结论：癌旁组织端粒酶活性及hTERT mRNA表达可能是肝细胞癌术后早期复发的预后指标。     

基因转染法建立bcl-2稳定表达的肝癌细胞株

目的与方法：为了建立稳定表达 bcl-2蛋白的肝细胞癌（简称肝癌）细胞株,用脂质体介导的基因转染法将含有人 bcl-2,CDNA的逆转录病毒表达载体pDOR-SB质粒导入bcl-2蛋白阴性的肝癌细胞系HCC－9204细胞中,经G－418筛选后获得转 bcl-2基因的细胞克隆。细胞扩大培养后用免疫细胞化学法检测bcl-2表达情况,有限稀释法连续克隆化直至获得100％稳定表达bcl-2蛋白的单克隆细胞株,并进行流式细胞仪检测,结果：转染了pDOR-SB的HCC－9204细胞大部分为bcl-2蛋白表阳性,而转染了pDOR空载体或未转染的HCC－9204细胞均为bcl-2蛋白阴性,经过连续3次克隆化后,流式细胞仪检测表明所获得的单克隆细胞 100％表达bcl-2蛋白,结论：用基因转染法成功地建立了稳定表达bcl-2蛋白的肝癌细胞株。     

HBX蛋白对正常肝细胞增殖及端粒酶活性的影响

目的:观察乙型肝炎病毒X(hepatitis B virus X,HBX)蛋白对L02肝细胞的转化作用及其对端粒酶活性的影响。方法:构建PEGFP-N1-HBX质粒,脂质体介导转染L02细胞,倒置荧光显微镜观察EGFP的表达。稳定转染后Western blotting检测L02细胞中HBX蛋白的表达,电子显微镜观察L02细胞的形态,MTT法检测细胞的增殖,RT-PCR检测L02细胞端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA的表达,TRAP-PCR银染法检测L02细胞端粒酶活性的变化。结果:成功构建了PEGFP-N1-HBX质粒,稳定转染后L02细胞中有HBX蛋白的表达,且细胞形态明显幼稚化,有恶性变趋势,细胞增殖能力明显增加(P0.05),细胞hTERT mRNA表达明显增加,端粒酶被激活。结论:HBX蛋白可诱导正常肝细胞的恶性转化,上调hTERT mRNA的表达并能激活端粒酶。