微小RNA-146a 上调cyclin D1 表达诱导大鼠血管平滑肌细胞的增殖

目的:采用基因芯片技术研究小分子RNA-146a(miR-146a)促进血管平滑肌细胞增殖的作用靶点并进行验证。方法:原代培养大鼠血管平滑肌细胞,分成mimics 组、inhibitor 组、control 组、sham 组,分别体外转染miR-146a mimics(50nmol/ L)、miR-146a inhibitor(50 nmol/ L)、miR-146a 错义链(50 nmol/ L)、PBS,Real time PCR 测定转染后miR-146a 水平,CCK8法检测转染后血管平滑肌细胞增殖情况。采用基因芯片检测inhibitor 组和control 组基因表达谱,通过生物信息学技术筛选出差异基因和调控的信号通路。对筛选出来的信号通路用Real time PCR 和Western blot 进行验证。结果:转染48 h后,inhibitor 组血管平滑肌细胞的miR-146a 水平明显低于control 组和sham 组(P<0.01),inhibitor 组血管平滑肌细胞的OD 值明显低于control 组、sham 组(P<0.05)。通过对基因表达谱分析发现,p53 信号通路被miR-146a 上调。用Real time PCR 和Western blot进行检测发现,p53 信号通路中关键分子p53、caspase3、PTEN 的mRNA 和蛋白水平无明显变化(P>0.05),而mimics 组VSMC中cyclin D1 的mRNA 和蛋白水平增加(与sham 相比,P<0.05),inhibitor 组VSMC 中cyclin D1 的mRNA 和蛋白水平下降(与sham相比,P<0.05)。结论: miR-146a 可能通过上调细胞周期蛋白cyclin D1 的表达促进大鼠血管平滑肌细胞的增殖。     

miR-129抑制鼻咽癌细胞系CNE2增殖

目的检测miR-129对鼻咽癌细胞系CNE2细胞生物学功能的影响。方法人工合成miR-129模拟物(mimics)和抑制物(inhibitor),转染至鼻咽癌CNE2细胞中,RT-qPCR检测细胞miR-129表达;CCK8法检测细胞增殖;Transwell小室侵袭实验检测细胞侵袭能力;流式细胞仪检测细胞凋亡能力。结果与对照组相比,转染miR-129 mimics组的miR-129表达水平明显升高(P0.05);转染miR-129 inhibitor组的miR-129表达水平均明显降低(P0.05);与对照组相比,转染miR-129 mimics组CNE2细胞增殖能力、侵袭能力显著下降(P0.05),凋亡显著增多(P0.05);与对照组相比,转染miR-129 inhibitor组CNE2细胞增殖能力、侵袭能力显著升高(P0.05),凋亡显著下降(P0.05)。结论 miR-129抑制鼻咽癌细胞系CNE2的增殖和迁移能力,促进细胞凋亡。     

miR-146a对小鼠巨噬细胞IL-18表达的影响

目的:探讨miR-146a对小鼠单核-巨噬细胞株RAW264.7以及小鼠原代腹腔巨噬细胞Thl/Th2类细胞因子表达的影响。方法:体外培养的小鼠单核-巨噬细胞系RAW264.7细胞和腹腔新鲜分离的巨噬细胞分别瞬时转染miR-146a mimics、阴性对照mimics(NC mimics)、抑制性miR-146a(miR-146a inhibitor)和抑制性miR-146a阴性对照(NC in-hibitor)。转染后,利用real time PCR定量检测IL-18、IL-5和IL-10的表达情况。结果:RAW264.7细胞和原代腹腔巨噬细胞在转染miR-146a mimics后IL-18的表达水平明显降低(P<0.05),转染miR-146a inhibitor后IL-18的表达水平明显升高(P<0.05),但对IL-5和IL-10的表达,两种转染形式均没有影响。结论:巨噬细胞RAW264.7及原代巨噬细胞表达的miR-146a能够负向调控Thl类细胞因子IL-18的表达,但是不能调控Th2类细胞因子IL-5及IL-10的表达。     

miR-126对EA.hy926细胞血管内皮生长因子表达的调控作用

 目的：探讨miR-126对EA.hy926细胞血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响。方法：选用EA.hy926细胞株作为研究对象,采用阳离子介导的转染方式,将miR-126 inhibitor 和miR-126 mimics 进行细胞转染,分析miR-126对血管内皮细胞功能的影响。采用转染negative control作为阴性对照,转染36 h后提取细胞总RNA,利用 real-time PCR和Western blotting分别检测EA.hy926细胞 VEGF  mRNA 和蛋白水平的表达。结果：转染miR-126 inhibitor 50 nmol/L 36 h后,EA.hy926细胞的VEGF mRNA及蛋白水平各组间差异有统计学意义（P<001）,与阴性对照组相比,miR-126 inhibitor 使EA.hy926细胞的VEGF mRNA及蛋白水平显著上调（P<001）;转染miR-126 mimics 50 nmol/L 36 h后,EA.hy926细胞的VEGF mRNA及蛋白水平各组间有显著差异（P<001）,与阴性对照组相比,miR-126 mimics 使EA.hy926细胞的VEGF 在mRNA及蛋白水平显著下调（P<001）。结论：miR-126 能够抑制VEGF的表达,VEGF有可能是其调节的靶基因之一。     

miR-150在胎盘表达与复发性流产的关系研究

目的探讨miR-150通过靶向血管内皮生长因子(VEGF)表达调控胎盘血管生成参与复发性流产的关系。方法选择华中科技大学同济医学院附属梨园医院妇产科单胎晚期妊娠分娩的产妇40例为对照组(年龄23~29岁,平均年龄26.72岁),同期选择于该院妇产科3次或更多次自然流产的妇女40例为病例组(年龄23~29岁,平均年龄26.18岁)。测定两组胎盘组织miR-150 mRNA表达水平及VEGF表达水平。设立HTR-8/SVNEO细胞组、miR-150mimics组、miR-150 inhibitor组,测定3组细胞活力、凋亡水平、血管形成水平、miR-150 mRNA表达水平及VEGF表达水平。建立正常小鼠组、miR-150 mimics小鼠组、miR-150 inhibitor小鼠组模型,测定3组小鼠平均流产数、胎鼠质量、胎盘质量、胎盘毛细血管数目、miR-150 mRNA及VEGF表达水平。结果病例组胎盘组织miR-150 mRNA表达水平高于对照组胎盘组织,VEGF表达水平低于对照组胎盘组织(P <0.05)。miR-150 mimics组光密度(OD)值、细胞存活率、相对总血管长度、相对总血管数目、VEGF表达水平低于HTR-8/SVNEO细胞组(P <0.05);miR-150 inhibitor组OD值、细胞存活率、相对总血管长度、相对总血管数目、VEGF表达水平高于HTR-8/SVNEO细胞组和miR-150 mimics组(P <0.05)。miR-150 mimics组细胞凋亡率、miR-150 mRNA表达水平高于HTR-8/SVNEO细胞组(P <0.05),miR-150 inhibitor组细胞凋亡率、miR-150 mRNA表达水平低于HTR-8/SVNEO细胞组和miR-150 mimics组(P <0.05)。miR-150 mimics小鼠组平均流产数、miR-150 mRNA水平高于正常小鼠组(P <0.05),胎鼠质量、胎盘质量低于正常小鼠组(P <0.05)。miR-150inhibitor小鼠组平均流产数、miR-150 mRNA水平低于正常小鼠组和miR-150 mimics小鼠组(P <0.05),胎鼠质量、胎盘质量高于正常小鼠组和miR-150 mimics小鼠组(P <0.05)。miR-150 mimics小鼠组平均胎盘毛细血管数目水平、VEGF表达水平低于正常小鼠组(P <0.05),miR-150 inhibitor小鼠组平均胎盘毛细血管数目、VEGF表达水平高于正常小鼠组和miR-150 mimics小鼠组(P <0.05)。结论复发性流产患者胎盘组织中miR-150表达水平升高,VEGF表达水平降低;miR-150靶向抑制胎盘中VEGF表达水平进而抑制胎盘中血管的生成可能是复发性流产的发病机制之一。     

反义miR-196a对人胰腺癌PANC-1细胞侵袭和迁移的抑制作用

目的:探讨微小RNA-196a(miR-196a)在胰腺癌细胞系中表达状况及反义miR-196a对人胰腺癌PANC-1细胞生物学行为的影响。方法:miR-196a采用实时荧光定量PCR检测。人工化学合成反义miR-196a并转染PANC-1细胞。CCK-8法检测细胞增殖。流式细胞术检测细胞凋亡情况。通过划痕损伤实验和Transwell小室细胞侵袭、迁移实验检测PANC-1细胞侵袭和迁移能力。构建野生型及突变型核因子κB抑制蛋白α(NFKBIA)3'UTR的萤光素酶报告载体,检测海肾萤光素酶的相对活性以验证miR-196a对NFKBIAmRNA的作用靶点。结果:人胰腺癌细胞系中miR-196a呈高表达;转染反义miR-196a后,PANC-1细胞miR-196a表达下降,其细胞增殖和凋亡无显著改变(P>0.05);而转染反义miR-196a组中通过Transwell小室的细胞数明显低于各对照组(P<0.01)。与各对照组相比,共转染野生型NFKBIA的3'UTR和反义miR-196a可使海肾萤光素酶相对活性显著提高。结论:miR-196a可能是癌微RNA(oncomiR)之一,有望成为人胰腺癌基因治疗的候选靶点。     

MicroRNA-155 通过调节CXCR4 / PI3K / AKT 途径影响滋养细胞的侵袭与迁移

目的:以人绒毛膜滋养层细胞系JEG-3 细胞为研究对象,结合该细胞侵袭和迁移能力的变化情况,研究转染miR-155 mimics 和miR-155 inhibitor 之后CXCR4 的表达变化及其对下游PI3K/ AKT 信号通路的影响作用,从而探讨miR-155参与子痫前期发生发展的分子机制。方法:设计miR-155mimics 和miR-155 inhibitor,对JEG-3 进行转染,通过Transwell 侵袭实验、划痕实验,观察转染后细胞的侵袭和迁移能力的变化;利用Real-time PCR 检测CXCR4 mRNA 的表达;利用Western blot检测CXCR4 及下游p鄄AKT 蛋白的表达水平。结果:Real-time PCR 结果显示,miR-155 mimics 转染组CXCR4 mRNA 相对表达量(0.589依0.096)明显低于空白对照组(1.503依0.090)和阴性对照组(1.146依0.153),差异有统计学意义(P<0.05);miR-155 inhibitor 转染组CXCR4 mRNA 相对表达量(1.739依0.083)与两组对照组相比差异也有统计学意义(P<0.05)。Western blot 结果显示miR-155 mimics 转染组CXCR4 蛋白和下游p-AKT 蛋白表达水平均明显降低,而miR-155 inhibitor 转染组CXCR4 和p-AKT 蛋白水平则升高,与空白对照组和阴性对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。Transwell 侵袭实验结果显示,与空白对照组(63郾46依2郾37)和阴性对照组(49.29依5.81)侵袭细胞数相比,miR-155 mimics 转染组侵袭细胞数(22.89依9.42)明显减少,差异有统计学意义(P<0.05);同时,miR-155 inhibitor 转染组侵袭细胞数(81.50依11.25)明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。划痕实验结果显示,转染miR-155 mimics 后,JEG-3 细胞相对迁移距离(0.159依0.058)低于空白对照组(1.080依0.045)和阴性对照组(0.823依0.201),差异有统计学意义(P<0.05);而miR-155 inhibitor 转染组,JEG-3 细胞相对迁移距离(1.640依0.078)明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:miR-155 可能通过抑制CXCR4 的表达进而抑制其下游PI3K/AKT 信号通路的活化,从而影响滋养细胞的侵袭及迁移能力,最终导致子痫前期的发生发展。     

miR-183在人乳腺癌中表达及意义

目的:研究miR-183在人乳腺癌组织和细胞株中表达状况及其对乳腺癌细胞生物学行为的影响。方法:使用实时定量PCR方法检测miR-183在人乳腺细胞株和临床乳腺病变组织中表达;使用脂质体介导的miRNA转染技术,检测转染miR-183后对乳腺癌细胞增殖、侵袭和迁移活力的影响。结果:高度侵袭力的乳腺癌细胞株miR-183表达较低侵袭乳腺细胞株显著下调(P<0.01);临床人乳腺癌组织中miR-183表达较乳腺良性病变组织显著下调(P<0.01);使用miR-183抑制物和模拟物分别转染乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-231后,乳腺癌细胞侵袭和迁移活力分别上调和下调(P<0.05),而细胞增殖活力改变不明显(P>0.05)。结论:乳腺癌中miR-183表达出现失调。miR-183可能参与了乳腺癌细胞侵袭和迁移过程。     

层流剪切力作用下miR-21对内皮细胞Caveolin-1基因表达的影响

目的探讨层流剪切力(SS)作用下miR-21对内皮细胞Caveolin-1基因表达的影响。方法采用Lipofectamine2000将miR-21 mimics和miR-21 inhibitor分别转染到人主动脉内皮细胞,将转染后的内皮细胞分别加载低[0.4 Pa(4 dyn/cm~2)]和高[1.5 Pa(15 dyn/cm~2)]SS,并作用24 h。采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blot技术检测Caveolin-1 m RNA和Caveolin-1蛋白的表达。结果对照组、低SS+miR-21 mimics组、低SS+miR-21 inhibitor组、高SS+miR-21 mimics组及高SS+miR-21 inhibitor组Caveolin-1 mRNA/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)表达分别为1.08±0.17、0.44±0.16、1.19±0.34、0.93±0.27及1.70±0.39,Caveolin-1/β-actin蛋白分别为1.02±0.24、0.44±0.24、0.98±0.34、1.01±0.35及1.51±0.48。低SS+miR-21 mimics组Caveolin-1蛋白表达显著低于对照组(P0.05),高SS+miR-21 inhibitor组Caveolin-1蛋白表达显著高于其他4组(P0.05),低SS+miR-21 inhibitor组及高SS+miR-21 mimics组Caveolin-1蛋白表达显著高于低SS+miR-21 mimics组(P0.05)。结论 miR-21对层流SS作用下内皮细胞的Caveolin-1基因的表达可能具有重要的调控作用。     

下调miR-18a和miR-328抑制肺腺癌A549细胞的侵袭和迁移

目的分析miR-18a和miR-328在肺腺癌A549细胞中的表达,并探讨下调miR-18a或miR-328的表达对其侵袭和迁移能力的影响。方法用荧光定量PCR检测A549细胞中miR-18a和miR-328的表达;通过转染miR-18a抑制物(miR-18a inhibitor)或miR-328 inhibitor,下调miR-18a或miR-328的表达,采用TranswellTM侵袭、迁移实验分析A549细胞侵袭和迁移能力的变化。结果 A549细胞中miR-18a和miR-328均呈高表达;而转染相应抑制物后miR-18a、miR-328表达下降,A549细胞的侵袭、迁移能力均明显降低。结论下调A549细胞miR-18a或miR-328水平可有效抑制肿瘤细胞的侵袭、迁移。     

miR-221通过下调PTEN促进肺癌A549细胞增殖

目的:探讨微小RNA-221(miR-221)对肺癌A549细胞增殖的影响及其相关作用机制。方法:通过脂质体转染试剂Lipofectamine 2000把miR-221 mimics转染入肺癌细胞A549内,RT-q PCR检测miR-221和PTEN mRNA的表达;Western blot检测PTEN蛋白表达;CCK-8及平板克隆形成实验检测细胞增殖能力。构建含PTEN 3'-UTR的萤光素酶报告载体,检验miR-221对PTEN的靶向调控作用。结果:转染miR-221后肺癌细胞中miR-221表达水平明显高于对照组及空白组(P0.01),PTEN mRNA及蛋白表达均显著下降(P0.05);细胞增殖及集落形成能力明显增强(P0.05);miR-221能抑制PTEN的萤光素酶活性。结论:miR-221能够抑制肺癌A549细胞中PTEN的表达,并促进细胞增殖。     

miR-141表达异常对人肝癌细胞恶性生物学表型的影响

 目的: 研究微小RNA-141(miR-141)在人肝癌细胞和正常胎肝细胞中的表达,同时分析miR-141表达异常对人肝癌细胞恶性生物学表型的影响。方法: 分别提取人肝癌细胞SMMC-7721和正常肝细胞HL-7702的总RNA,采用实时荧光定量PCR法检测miR-141的表达。采用脂质体介导的转染方法分别将miR-141 mimic转染SMMC-7721细胞,将miR-141 inhibitor转染HL-7702细胞;MTS试剂盒和BrdU-ELISA检测细胞增殖能力,流式细胞术检测转染前后细胞周期和凋亡率的变化。Transwell实验检测miR-141表达变化对细胞体外迁移能力的影响。结果: miR-141在SMMC-7721细胞中的表达较HL-7702细胞明显下降。与空白组、脂质体组和阴性对照组相比,转染25 nmol/L miR-141 mimic的SMMC-7721细胞中,细胞增殖速度减慢,S期细胞比例降低,凋亡细胞比例上升,细胞体外迁移能力下降;转染50 nmol/L miR-141 inhibitor的HL-7702细胞中,细胞增殖速度加快,S期细胞比例上升,凋亡细胞比例下降,细胞体外迁移能力增强。结论: miR-141在人肝癌细胞中表达下降,上调miR-141表达可抑制肝癌细胞体外增殖活性和迁移能力,影响细胞周期和凋亡。在肝癌发病进程中,miR-141可能扮演抑癌基因的角色。     

miR-140在人胃癌组织中的表达及对SGC-7901胃癌细胞功能的影响

 目的: 研究microRNA-140(miR-140)在人胃癌和正常胃组织中的表达水平,以及调控miR-140表达后对SGC-7901胃癌细胞功能的影响。方法: 采用实时荧光定量PCR检测miR-140在人胃癌和正常胃组织中的表达水平;将miR-140 mimics(miR-140上调表达)和miR-140 inhibitors(miR-140下调表达)分别通过脂质体转染至人胃癌SGC-7901细胞中,同时设置未转染对照组(control组)和miRNA无义序列转染对照组(NC组)。实时荧光定量PCR检测转染后各组细胞中miR-140的表达变化;MTT方法检测各组细胞的生长活力和顺铂(DDP)作用下的生长抑制率;流式细胞术检测各组的细胞周期和凋亡率;Transwell实验检测各组细胞侵袭能力;Western blot检测各组细胞中组蛋白脱乙酰酶4(HDAC4)蛋白表达。结果: miR-140在人胃癌组织中表达水平显著低于正常胃组织(P<0.05)。与control和NC组相比,miR-140 mimics组中SGC-7901细胞活力和侵袭能力下降,细胞周期被阻滞,DDP作用下细胞生长抑制率和凋亡率上升,且HDAC4蛋白表达下调,差异均有统计学意义(P<0.05);而miR-140 inhibitors组中SGC-7901细胞活力和侵袭能力上升,细胞周期被促进,DDP作用下细胞生长抑制率和凋亡率下降,且HDAC4蛋白表达上调,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论: miR-140在胃癌组织中低表达,可作为抑癌因子调控胃癌细胞活力、细胞周期变化、凋亡、侵袭并通过下调HDAC4发挥作用。miR-140可能作为胃癌诊断和治疗的新靶点。     

miR-210对肾透明细胞癌血管生成的影响

目的探讨miR-210对肾透明细胞癌血管生成的影响。方法检测40例肾透明细胞癌组织标本中miR-210的表达,并分析其与相应癌组织中微血管密度(MVD)的关系。通过miR-210反义寡核苷酸(miR-210-ASO)技术抑制肾透明细胞癌细胞系786-O细胞中miR-210表达,RT-q PCR检测转染效果。三维培养实验观察对照组、阴性对照组和miR-210-ASO组肿瘤细胞上清液对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)管腔形成数量的影响。建立裸鼠移植瘤模型,应用endomucin免疫荧光染色于激光共聚焦显微镜下观察抑制miR-210对移植瘤生长,血管形成和VEGF表达的影响。结果肾透明细胞癌组织标本中miR-210的表达与微血管密度呈正相关(P0.05),经miR-210-ASO转染的786-O细胞其miR-210表达明显下降(P0.05)。miR-210-ASO组细胞上清液培养的HUVEC细胞管腔形成数量显著少于对照组和阴性对照组(P0.05)。miR-210-ASO组细胞形成的移植瘤体积小于对照组,且微血管数量和VEGF的表达量显著少于对照组(P0.05)。结论抑制miR-210可降低肾透明细胞癌中血管生成数量。     

miR-132-3p过表达对MC3T3-E1细胞增殖分化的影响

文题释义： miRNA：是一类小的非编码RNA,长度约为22个核苷酸,其主要通过结合靶标mRNA的3'UTR区诱导靶标mRNA降解或抑制其翻译,从而在转录及转录后水平调控相关基因的表达。miRNA在细胞增殖、分化及凋亡等多种生物学活动过程中起着非常重要的调控作用,并且发现它是调控骨组织细胞增殖和分化过程的重要因子之一。 MC3T3-E1细胞：是新生C57BL/6小鼠颅顶骨中分离培养所建立的一株成骨细胞株,它能够展现骨组织中成骨细胞的各个发育阶段和各种生物学特性。作为研究成骨细胞增殖和分化的理想模型,被广泛应用于国内外各种骨组织工程学研究。 背景：机械牵引力能够影响MC3T3-E1细胞的增殖分化过程,并引起细胞内miR-132-3p的差异表达。然而,牵引力是否通过调控miR-132-3p的表达来影响成骨细胞增殖分化仍需进一步研究。 目的：明确12%牵引力作用下MC3T3-E1细胞中成骨分化标志因子及miR-132-3p表达变化,并进一步探讨miR-132-3p对细胞增殖分化的影响。 方法：MC3T3-E1细胞分别加载0%,12%牵张应力,检测应力加载后碱性磷酸酶活性、骨钙蛋白及miR-132-3p mRNA的表达水平;细胞内瞬时转染miR-132-3p模拟物及其阴性对照,qRT-PCR检测转染后碱性磷酸酶、骨钙蛋白、Runt标志转录因子2 mRNA的表达,CCK-8法检测miR-132-3p对细胞增殖能力的影响。 结果与结论：①12%牵张应力作用下,MC3T3-E1细胞中碱性磷酸酶活性、骨钙蛋白mRNA表达水平下调(P < 0.01),miR-132-3p表达水平显著升高(P < 0.05);②细胞内转染miR-132-3p后,miR-132-3p模拟物组成骨分化标志因子碱性磷酸酶、骨钙蛋白、Runt标志转录因子2 mRNA表达水平显著降低(P < 0.05);③相比于阴性对照组,miR-132-3p 模拟物转染24,48,72 h后细胞增殖能力明显降低(P < 0.001),且在转染48 h后降低最明显;④结果说明12%周期性循环牵张应力能够通过过表达miR-132-3p负向调节MC3T3-E1细胞的增殖和成骨分化。 ORCID: 0000-0003-0696-3329(孙芬) 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程