同种抗原特异性T淋巴细胞克隆方法的建立

目的 建立抗原特异性T淋巴细胞克隆的方法。方法 以供体脾细胞作同种抗原,刺激受体外周血单个核细胞,用有限稀释法进行T淋巴细胞克隆。结果 获得3个T淋巴细胞株。经免疫组化分析,有2个细胞株为CD3^ CD4^-CD8^ 。另一个细胞株为CD3^ CD4^-CD8^-。后者经流式细胞仪分析纯度为97％。抗原特异性检测表明：用供体细胞刺激,克隆T细胞发生增殖作用;用无关个体细胞刺激,无增殖作用。结论 成功地建立了抗原特异性T淋巴细胞克隆方法。     

人外周血T淋巴细胞亚群的克隆培养与分析研究

人T细胞克隆培养始于70年代末,目前国内尚未见报告。本文是简化的一步法获得成功。培养体系中,PHA 2μl/ml,2-ME 5×10~(-5)M/ml,SRBC 0.1%为最佳条件。在 T 克隆中,E-玫瑰花结形成细胞数为90.9%,OKT-4阳性率51.3%,OKT-8为44.1%,OKT-4:OKT-8之比为1.2:1。培养7例淋巴瘤细胞(T 淋巴瘤3例,B 淋巴瘤4例),均可获得克隆成功。这一克隆体系将应用于 T 细胞系的建株,评价各类病人及婴幼儿的 T细胞功能以及用于研究中药对细胞免疫功能的影响等。     

慢性肝炎患者外周血单个核细胞Fas抗原及T淋巴细胞亚群的检测意义

[目的 ]探讨Fas抗原系统和T淋巴细胞亚群在慢性肝炎发病机制中的作用及意义。 [方法 ]提取患者外周血单个核细胞 ,应用流式细胞术检测Fas抗原、CD3 、CD4 、CD8 ,进行统计学方差分析。共检测 2 5例慢性肝炎患者 ,其中慢性乙型肝炎 (CHB)患者 1 6例 ,脂肪性肝炎患者 9例。[结果 ]2 5例慢性肝炎患者总的Fas抗原及 1 6例慢性乙型肝炎和 9例脂肪肝患者的Fas抗原阳性率分别为 (4 7.35± 6 .1 4 ) %、(4 8.31± 6 .6 8) %和 (4 7.1 9± 8.71 ) % ,明显高于对照组 (2 5 .0±7.0 7) % ,P均 <0 .0 1 ,有显著性差异。各组慢性肝病之间Fas抗原含量无显著性差异。对T淋巴细胞亚群的分析 ,慢性乙型肝炎组CD3 与对照组呈显著性差异 (P <0 .0 1 ) ,其余均无差异。 [结论 ]慢性肝炎患者 ,包括CHB及脂肪性肝炎 ,外周血单个核细胞Fas抗原表达明显增高 ,同时外周血T淋巴细胞数量 (CD3 )有明显下降     

人类白细胞抗原-抗原肽复合物特异性细胞毒性T细胞的诱生及克隆

为建立一种有效诱导及克隆人类白细胞抗原(HLA)-抗原肽复合物特异性细胞毒性T细胞(CTL)的方法.用EB病毒转化的B淋巴母样细胞系细胞作为刺激细胞,采用长期混合淋巴细胞培养法诱导自身外周血T细胞库中抗原肽-HLA复合物特异性CTL增殖、分化,并用有限稀释法对之进行克隆.通过细胞毒实验证实获得的CD3+、CD8+T细胞克隆具有高度抗原特异性并受某些HLA型别的限制.     

汉滩病毒核蛋白T细胞表位的鉴定及其特异性T细胞应答规律的初步探讨

目的：鉴定引起肾综合征出血热（HFRS）的汉滩病毒核蛋白（HTNV—NP）的T细胞表位，并探讨其特异性T细胞应答的规律。方法：合成覆盖HTNV—NP全长序列的全套部份重叠15肽，用ELISPOT方法筛选能刺激HFRS患者外周血单个核细胞（PBMC）产生IFN-γ的15肽，并测定其特异性T细胞的频率．结果：47例HFRS患者中，有18例可对HTNV—NP产生特异性T细胞应答，并发现在病程的早期就已开始产生T细胞应答．     

FasL反义RNA抑制人T淋巴细胞致凋亡作用的研究

目的：探讨反义RNA抑制活化T淋巴细胞FasL的表达及其对Fas阳性细胞的致凋亡作用。为FasL反义RNA的应用提供实验依据。方法：获得FasL反义RNA重组逆转录病毒，调整感染滴度后转染活化人外周血单个核细胞(HPBMC)。采用流式细胞仪检测转染细胞表面FasL的表达以及对Fas^ IL-60细胞的致凋亡能力。结果：空病毒载体的重复转染上调活化HPBMC FasL的表达，但转染重组病毒能有效抑制活化HPBMC表达：FasL，表达率由13．93％下降至7．19％；FACS检测HL-60细胞的凋亡显示，转染重组病毒使活化：HPBMC对IL-60细胞的致凋亡作用明显下降，凋亡率由33．48％降为17．28％。结论：FasL反义RNA能有效抑制活化淋巴细胞表达FasL及由其介导的凋亡作用，但究竟采用何种载体转录FasL的反义RNA有待研究。     

自噬小体疫苗能够检测人外周血抗原特异性T细胞

目的:探讨自噬小体疫苗DRibbles是否可用于检测人外周血中抗原特异性T细胞.方法:制备表达CEF蛋白的HEK293T细胞及表达CMV pp65蛋白的LT3细胞,从中提取DRibbles,用HEK293T CEFDRibbles及LT3 pp65 DRibbles刺激人外周血单个核细胞(PBMCs),通过流式细胞术检测分泌IFN-γ的T细胞占总T细胞的百分比.结果:与阴性对照HEK293T GFP DRibbles相比,HEK293T CEF DRibbles刺激组分泌IFN-γ+的CD8+T细胞比例显著增高(3.38％ vs0.05％),分泌IFN-γ+的CD4+T细胞比例亦显著增高(0.46％ vs0.06％);LT3 pp65 DRibbles刺激组分泌IFN-γ+的CD8+T细胞平均百分数为0.21％,阴性对照LT3 GFP DRibbles刺激组仅为0.05％(P＜0.01);与LT3pp65细胞裂解产物相比,LT3 pp65 DRibbles能诱导更多的CD8+T细胞分泌IFN-γ(P ＜0.05),在诱导CD4+T细胞分泌IFN-γ方面,DRibbles与细胞裂解产物类似(P＞0.05).结论:包含病毒抗原的DRibbles能够有效激活人PBMCs中的病毒抗原特异性CD8+T细胞及CD4+T细胞.     

人胃癌细胞RNA转染树突状细胞诱导特异性抗肿瘤免疫的实验研究

目的：观察人胃癌细胞株RNA转染的树突状细胞（DC）所诱导的行异性抗肿瘤免疫效应，探讨肿瘤细胞RNA直接转染DC进行胃癌生物治疗的可能性。方法：胃癌细胞株AGS体外培养，提取RNA；正常人外周血，进行体外DC的培养扩增；胃癌RNA直接转染DC，MTT法检测胃癌RNA活化DC所诱生的淋巴细胞对胃癌AGS、视网膜母细胞瘤SoRb-70的体外杀伤效应。结果：正常人外周血来源的DC，经胃癌AGS细胞株RNA直接转染后，成功诱导特异性抗肿瘤免疫反应，AGS RNA组CTL在靶效比为20：1时对AGS、SoRb-70的杀伤率分别为84．54％、1．53％，而对照组对这两种细胞的杀伤率分别为1．34％和1．70％。结论：肿瘤RNA转染DC可以诱导特异性抗肿瘤免疫，是一种有前景的胃癌治疗手段，有进一步研究的价值。     

IL-10和TNF-α在人外周血单个核细胞体外感染卡介苗中的表达及相关性研究

目的探讨白细胞介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子(TNF-α)在人外周血单个核细胞(PBMCs)体外感染卡介苗(BCG)中的表达及相互作用。方法 PBMCs体外感染BCG后,分别于3、6、8、24h收集细胞应用荧光定量PCR法检测细胞内IL-10和TNF-α的mRNA含量;此外,分别于8、20、32、48h加入anti-IL-10的抗体孵育,收集细胞培养上清,用ELISA法检测上清中IL-10和TNF-α的蛋白含量。结果 PBMCs体外感染BCG后,相对于空白对照组,IL-10和TNF-α在mRNA和蛋白水平的表达量均增高,差异具有统计学意义(P<0.05),两者表达量呈现负相关趋势;当加入anti-IL-10的抗体后,TNF-α的蛋白表达量要高于未加抗体组,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 IL-10和TNF-α在人PBMCs体外感染卡介苗中的表达量增加,IL-10对TNF-α的表达可能具有抑制作用。     

人外周血富集白细胞层来源的树突状细胞的培养与鉴定

目的 探讨从人外周血富集白细胞层(白膜)分离、培养树突状细胞(dendritic cell,DC)的方法.方法 用PBS液与白膜1∶1稀释,采用Ficoll淋巴细胞分离液对稀释后的白膜进行淋巴细胞分离,2h后弃悬浮细胞,加入重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重组人白细胞介素-4(rhIL-4)和DMEM完全培养液培养,体外培养第6天,加入肿瘤坏死因子(TNF-α)促进其分化成熟.用流式细胞仪(flow cytometer,FCM)检测细胞表型.在倒置显微镜下观察细胞形态.结果 显微镜下观察,细胞呈不规则形状,膜表面向外伸出许多树枝样细长突起;成熟DC细胞表面CD83、CD86、CD1a、HLA-DR分子表达明显增高;平均每份白膜(200mL全血)可以获得(3.87±0.31)×107个成熟DC.结论 作者建立了一种从白膜中分离、培养树突状细胞的方法,可获得数量较多、纯度较高的DC,为DC瘤苗的来源开创了一条新途径,并为血液的合理利用找到了一个新方式.     

外周血内皮祖细胞改善肢体缺血的研究

目的:研究人外周血来源内皮祖细胞(EPC)移植对改善肢体缺血的作用. 方法:人外周血单个核细胞在体外诱导扩增6 d和14 d后,分别检测其EPC特异性标志的表达,并将荧光染料标记后的培养第6日的贴壁细胞通过缺血局部多点注射移植到后肢缺血的裸鼠动物模型体内,以评价其治疗效果. 结果:人外周血单个核细胞经体外诱导分化,培养第6日的贴壁细胞表达KDR, CD133, CD34和vWF,流式细胞仪检测其阳性率分别为(46.4±9.3)%, (33.8±11.7)%, (73.5±6.3)%和(38.9±8.2)%;培养第14日的贴壁细胞KDR, CD34和vWF的表达阳性率均增高,而CD133表达阳性率明显降低,流式细胞仪检测其阳性率分别为(81.5±7.6)%, (88.9±5.4)%, (78.3±13.6)%和(3.8±8.7)%;移植EPC后裸鼠缺血后肢的坏死情况和毛细血管密度均较对照组明显改善(P＜0.05);移植EPC后缺血后肢肌肉石蜡切片中可见分散不均的红色和黄绿色双色荧光的细胞掺入. 结论:从人外周血单个核细胞中可诱导出EPC,而且移植的EPC可以定向整合到后肢缺血局部,明显改善裸鼠后肢缺血.     

微创采血结合多色流式细胞术分析小鼠外周血记忆T细胞亚群

目的 为实现序贯多时间连续采血监测小鼠外周血记忆T细胞亚群的变化情况,建立并优化微创采血结合多色流式细胞术分析的方法体系。方法 经隐静脉进行微创采血,使用荧光补偿微球进行多色荧光补偿矩阵的建立,在BD Calibur双激光流式细胞仪上分析小鼠外周血记忆T细胞亚群（初始T细胞、中心记忆T细胞、效应记忆T细胞）,评估采血体积、全血是否离心、抗体孵育浓度、红细胞裂解后是否洗涤等参数对多色流式分析结果的影响。随后采用优化的流式细胞分析方法动态评估C57和动脉粥样硬化（AS）易发载脂蛋白E基因敲除（apoE^-/-）小鼠在从常规饮食切换至高脂饮食过程中记忆T细胞的演变过程。结果 （1）经小鼠隐静脉可实现10～50 μL采血,该采血可无需对实验动物进行麻醉,能够实现多次重复采血,且10 μL全血即可满足多色流式细胞术分析的需要,并减少抗体用量。（2）联合高速离心分离血细胞进一步缩小抗体孵育体积,则可进一步节省抗体的用量。（3）对抗体浓度的优化能在保证检测结果准确性和可重复性好的基础上进一步降低抗体用量和背景荧光的干扰。（4）红细胞裂解后加用洗涤可进一步降低背景荧光,但延长操作时间;也可裂解后直接上机检测。（5）使用上述流式细胞学分析方法揭示：apoE^-/-小鼠在常规饮食基线水平其体内的效应记忆T细胞水平即高于对照C57小鼠（P<0.05）,给予高脂饮食3周后基本达到平台,而C57小鼠在高脂饮食2周即达到平台,表明apoE^-/-小鼠在AS斑块进展早期即出现免疫调节紊乱。结论 采用隐静脉采血结合优化流式细胞术抗体孵育流程可实现序贯连续采血,完成对小鼠体内记忆T细胞亚群的动态观察。     

兔外周血内皮祖细胞的分离、培养和鉴定

目的:研究新西兰大白兔外周血内皮祖细胞(EOCs)的分离、培养和鉴定方法,为后续实验研究做好准备.方法:通过耳中央动脉采集兔外周血,密度梯度离心法分离单个核细胞(MNCs),在EGM-2培养基的诱导分化下,获得EOCs.通过标记的乙酰化低密度脂蛋白(DiI-ac-LDL)摄取试验、荆豆凝集素(FITC-UEA-1)结合实验、CD34与Ⅷ因子免疫组化染色、flk-1免疫荧光染色、体外血管形成实验以及细胞NO分泌功能测定,从细胞表面标记和细胞功能两方面对细胞进行鉴定.结果:新西兰大白兔外周血MNCs在体外培养可成功获得EOCs,EOCs能稳定摄取ac-LDL并与UEA-1结合,一致表达CD34、flk-1和Ⅷ因子相关抗原.EOCs能分泌NO,并能在matrigel凝胶上形成稳定的血管腔样结构.结论:密度梯度离心法分离的兔外周MNCs在一定的培养条件下能诱导分化成为EOCs.     

儿童患者外周血干细胞采集的影响因素分析

目的探讨血细胞分离机采集儿童患者外周血干细胞的方法和经验.方法对10例儿童患者在经化疗 生长因子方案动员后使用CS-3000 Plus血细胞分离机(Baxter公司)、儿童专用SVCH分离夹并选择儿童单个核细胞收集程序进行外周血干细胞采集.结果所有病例均采集成功,采集次数2～4次,平均2.3次,单个核细胞数(MNC):5.4(3.6～7.8)×108/kg,CD34 细胞为6.1(3.1～18.5)×106/kg,CFU-GM为3.3(1.6～5.1)×105/kg,台盼蓝拒染率:98.5(97～100)%,副作用小.结论由于儿童自身的特殊性,外周血干细胞采集较成人不同,为确保采集成功应选用专用器械和程序,做好采集前准备、控制血液总量、抗凝剂比例并积极处理并发症.     

猪外周血内皮祖细胞的分离培养及生物学特性

目的从小型猪外周血中分离、培养内皮祖细胞(EPCs),并进行相关鉴定,分析其生物学特性。方法采用密度梯度离心法获得小型猪外周血单个核细胞并进行体外传代培养,分别采用倒置相差显微镜观察、免疫荧光染色、流式细胞仪分析及Matrigel实验和DiI-acLDL摄取实验,对其细胞表型及功能进行相关鉴定。结果外周血单个核细胞在培养过程中出现梭形贴壁和铺路石样形态;培养第14天,约80%的细胞DiI-acLDL吞噬实验阳性,且CD133、CD34、flk-1、CD31、CD144的表达阳性率分别达到25.1%、55.9%、97.7%、82.0%和95.4%;细胞培养于凝固的Matrigel表面7 d后,形成特征性的网格状结构。结论该实验成功从小型猪外周血单个核细胞中分离培养出EPCs,在其体外扩增诱导的过程中,表达EPCs和成熟内皮细胞的特征性标志。     

不同大肠癌细胞裂解物负载健康人外周血DC瘤苗的体外试验研究

目的探讨3种大肠癌肿瘤细胞裂解物负栽的健康人外周血树突状细胞（DC）刺激同体和异体T淋巴细胞增殖活化的作用。方法对血站来源的健康人外周血采用密度梯度离心法,分离获得DC前体细胞,用临床应用药物GM—CSF、TNF—a和试验用试剂rhlL-4联合诱导培养扩增Dc,制备3种大肠癌细胞裂解物,体外致敏DC,显微镜观察Dc形态演化过程,电镜拍摄微观形态特征,流式细胞仪鉴定DC表型,ELlSA法检测肿瘤抗原致敏DC分泌IL-12水平,检测致敏DC刺激T淋巴细胞分泌的IL—lO和IF阿7水平,3H—TdR法检测成熟DC（mDC）诱导同体和异体T淋巴细胞增殖能力。结果DC形态学呈现典型树突状分化特征,mDC表达特征性免疫表型CDla、CD83,共刺激分子CD86、HLA—DR,分泌高水平IL—12,mDC与同体和异体T淋巴细胞共培养均能有效刺激T淋巴细胞增殖活化,T淋巴细胞不分泌IL-10,分泌较高水平IFN-了,3W480细胞株在各项指标上都具优势,3H—TdR法检测提示mDC不仅可以刺激同体淋巴细胞增殖,同样有效激活异体T淋巴细胞。结论来源于血站的健康人外周血是-种方便的DC前体细胞原料。联合细胞因子的培养方法可以成功诱导出成熟的DCl型细胞,引起Thl型细胞免疫反应;3种大肠癌肿瘤细胞裂解物,尤其是Sw480细胞株裂解物抗原性质稳定,能够有效促进DC分化,提高DC成熟度;负载裂解物的DC不仅刺激同体T淋巴细胞增殖,也可有效激活异体T淋巴细胞增殖,因此应用健康人异体来源的DC瘤苗刺激患者T淋巴细胞增殖,从而产生抗肿瘤免疫反应的设想是可行的。     

异基因外周血干细胞移植供者动员后淋巴细胞及造血干细胞的变化

目的:观察异基因外周血干细胞移植供者动员前后淋巴细胞亚群及造血干细胞的变化。方法:粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)动员外周血,直接免疫荧光法标记淋巴细胞和CD34细胞,用流式细胞仪检测其表达情况,甲基纤维素半固体培养基进行CFU-GM培养评价干细胞克隆生成能力。结果:rhG-CSF动员后淋巴细胞亚群与动员前相比无明显变化,CD34 细胞由动员前的0.12±0.08增加到0.83±0.26,CFU-GM有动员前的12±6增加到102±16。结论:正常供者外周血动员后CD34 细胞明显增加,淋巴细胞无明显变化。     

人外周血树突状细胞的诱导与鉴定

目的：体外诱导、培养人外周血单核细胞获得不同成熟阶段的树突状细胞（DCs）。方法：用贴壁法从健康人外周血浓缩白细胞获取单核细胞,第一阶段在GM-CSF+IL-4存在的条件下培养7 d,获得未成熟DCs;第二阶段在GM-CSF+TNF-α联合诱导下培养至14 d,获得成熟的DCs。对DCs的形态进行显微镜下观察,用流式细胞仪检测其表型,用MTT的方法对DCs的功能进行检测。结果：获得的未成熟DCs中度表达CD1a、共刺激分子,高表达HLA-DR分子,在DCs的成熟期共刺激分子、HLA-DR及CD83、CD25分子均高度表达,刺激同种异型T淋巴细胞增殖的能力强。结论：成功地建立了诱导人外周血单核细胞获得不同发育阶段DCs的方法,并获得了大量纯度较高的DCs。