shRNA沉默多药耐药胃癌细胞7901/VCR MDR1基因表达的实验研究

目的利用RNAi技术干扰胃癌多药耐药细胞（7901/VCR）多药耐药基因（MDR1）的表达,为临床肿瘤的基因治疗奠定基础。方法根据MDR1的碱基序列设计并合成两对短发夹RNA,构建重组载体,用阳离子脂质体法体外转染7901/VCR;采用MTT法检测转染胃癌细胞的生长抑制率,流式细胞术检测细胞周期变化,RT-PCR和Western blot检测转染前后MDR1 mRNA和蛋白表达的变化。结果成功构建RNAi质粒载体,转染后细胞IC50明显降低（P〈0.05）;G1期细胞增加,S期细胞减少（P〈0.05）;MDR1 mRNA转录水平下降（P〈0.05）,P-糖蛋白（P-gp）的表达水平降低（P〈0.05）。结论RNAi能明显抑制胃癌细胞7901/VCR MDR1mRNA和P-gp蛋白的表达,进而对肿瘤细胞多药耐药性有明显的逆转作用,为基因治疗提供了一种新的手段。     

miRNA-200c逆转胃癌SGC7901/DDP细胞对顺铂的耐药性及其相关机制

目的:探讨微RNA-200c (microRNA-200c,miRNA-200c)在逆转胃癌SGC7901/DDP细胞对顺铂(cisplatin,DDP)耐药中的作用及其可能的作用机制.方法:应用实时荧光定量PCR (real-time fluorescence quantitative-PCR,RFQ-PCR)法检测对DDP耐药的胃癌细胞SGC7901/DDP及其亲本细胞SGC7901中miRNA-200c的表达差异,同时检测SGC7901/DDP细胞转染miRNA-200c前体片段后miRNA-200c表达的变化;应用MTT法检测转染后SGC7901/DDP细胞对DDP药物敏感度的改变;Western印迹法检测转染后细胞bax、10号染色体同源丢失性磷酸酶与张力蛋白(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten,PTEN)和E-钙黏蛋白(E-cadherin,E-cad)的表达变化.结果:SGC7901/DDP细胞中miRNA-200c的相对表达量显著低于DDP敏感细胞株SGC7901中的表达量 (P<0.05),SGC7901/DDP细胞转染miRNA-200c前体片段24 h后细胞中miRNA-200c的表达水平比转染阴性对照片段的细胞明显提高(P<0.05).DDP对转染miRNA-200c前体片段细胞的半数抑制浓度(half inhibition concentration,IC50)显著低于转染阴性对照片段的细胞(P<0.05).转染miRNA-200c前体片段后,SGC7901/DDP细胞的bax、PTEN和E-cad的蛋白表达水平明显高于转染阴性对照片段的细胞 (P<0.05).结论:miRNA-200c可能通过上调E-cad、PTEN和bax蛋白表达而逆转SGC7901/DDP细胞对DDP的耐药.     

X射线照射对人鼻咽癌细胞株MDR1及P-gp表达影响的研究

目的:探讨X射线照射前后鼻咽癌CNE-1细胞多药耐药基因(MDR1)及其糖蛋白(P-gp)的表达随时间变化情况,及其照射与鼻咽癌细胞多药耐药的关系.方法:对CNE-1细胞进行X射线照射.利用RT-PCR检测照射前后细胞MDR1的表达;Western blotting检测照射前后P-gp的表达;MTT法检测照射前后顺铂对细胞的半数抑制率.结果:MTT法检测照射前CNE-1细胞的IC28和35天的IG50值均比照射前增高,其值分别为(1.56±0.10)、(2.41±0.11)、(3.24±0.13)、(2.65±0.09)和(1.83±0.15)μg/mL; RT-PCR检测照射前CNE-1细胞MDR1的半定量值为0.47±0.02,照射后第7、14、21、28和35天MDR1的表达比照射前明显增高,其值分别为0.63±0.02、0.86±0.05、0.75±0.07、0.57±0.03和0.58±0.04;Western blotting检测照射前CNE-1细胞P-gp的半定量值为15.55±1.02,照射后第14、21天比照射前明显增高,其值分别为23.29±1.83、28.98V2.14.结论:X射线照射可引起CNE-1细胞MDR1及P-gp表达增强,同时CNE-1细胞对顺铂产生抵抗.     

膀胱肿瘤T24／ADM多药耐药细胞株的建立及耐药机制的研究

目的建立人类膀胱肿瘤多药耐药（MDR）细胞株并研究其耐药机制。方法以人类膀胱肿瘤细胞株T24为研究对象，用多柔比星（ADM）浓度梯度递增诱导法，建立人类膀胱肿瘤细胞多药耐药模型（简称T24／ADM）。用MTT法检测肿瘤细胞的MDR特性；RT—PCR检测膀胱肿瘤耐药细胞株MDR基因的表达情况。流式细胞术检测耐药细胞P-糖蛋白（P—gP）的表达。结果T24／ADM对多种化疗药物产生耐药，对ADM的耐药性提高了16-3倍。RT—PCR检测发现T24／ADM中MDR基因和P—gp的表达明显增强。结论T24／ADM细胞具有MDR特性，其耐药性与MDR基因和P—gP的过表达有关。     

胃癌多药耐药细胞株的建立及其生物学特征

胆囊癌的CEA免疫病理研究胆囊癌的CEA免疫病理研究胆囊癌的CEA免疫病理研究胆囊癌的CEA免疫病理研究胆囊癌的CEA免疫病理研究胆囊癌的CEA免疫病理研究胆囊癌的CEA免疫病理研究胆囊癌的CEA免疫病理研究胆囊癌的CEA免疫病理研究胆囊癌的CEA免疫病理研究胆囊癌的CEA免疫病理研究胆囊癌的CEA免疫病理研究胆囊癌的CEA免疫病理研究胆囊癌的CEA免疫病理研究胆囊癌的CEA免疫病理研究胆囊癌的CEA免疫病理研究胆囊癌的CEA免疫病理研究胆囊癌的CEA免疫病理研究胆囊癌的CEA免疫病理研究胆囊癌的CEA免疫病理研究胆囊癌的CEA免…     

三氧化二砷逆转人胃癌细胞SGC7901/ADR耐药性的作用机制

目的：探讨三氧化二砷(As_2O_3)对胃癌细胞SGC7901/ADR阿霉素(ADM)耐药性的逆转作用及其逆转机制。方法：采用MTT法检测As_2O_3的非细胞毒性浓度和SGC7901/ADR细胞对ADM的敏感性,用流武细胞仪检测细胞内药物浓度和P-gp功能,免疫组织化学法检测细胞GST-π和TPPOⅡ的表达。结果：0．4～0．8μmol/L As_2O_3对耐药细胞SGC7901/ ADR无明显毒性,0．8μmol/L的As_2O_3可抑制P-gp功能,下调GST-π表达,显著提高SGC7901/ADR细胞内ADM浓度,增加SGC7901/ADR细胞对ADM的敏感性。结论：As_2O_3可部分逆转SGC7901/ADR细胞对ADM耐药性,其机制可能与抑制P-gp功能及下调GST-π表达有关。     

47例原发性乳腺癌多药耐药MDR1基因表达及其临床意义

[目的]探讨原发性乳腺癌多药耐药MDR1基因的表达及其临床意义.[方法]采用荧光定量RT-PCR法检测47例乳腺癌组织及15例正常对照(包括5例乳腺纤维腺瘤、10例癌旁组织)MDR1基因的表达.[结果]乳腺癌MDR1基因表达阳性率为46.8%,与病人年龄、肿瘤大小、淋巴结转移与否、ER、PR状况、绝经与否无关.对照组中无MDR1基因表达.[结论]乳腺癌MDR1基因的表达可作为乳腺癌化疗耐药的评价指标,能否作为判断预后的独立指标尚需进一步研究.     

含MDR基因的人乳腺癌MCF 7/pZMDR多药耐药细胞株的构建

目的：肿瘤细胞的多药抗药性（ＭＤＲ）是化疗失败的主要原因之一，Ｐ－糖蛋白高表达是ＭＤＲ的主要机制，逆转ＭＤＲ成为肿瘤治疗亟待解决的问题。目前用于研究抗药性和筛选逆转抗药性药物的模型较少，本实验拟构建多药抗药性细胞株。方法：采用基因工程技术，重组ＭＤＲ１基因ｃＤＮＡ于逆转录病毒载体ｐＺＩＲ－ＮｅｏＳＶ（Ｘ）的克隆位点，并用脂染胺（ｌｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ）介导的ＤＮＡ转移技术，将其转入包装细胞ＰＡ３１７中，收集含病毒子的培养上清液感染对药物敏感的人乳癌细胞株ＭＣＦ－７，经筛选培养基筛选，ＰＣＲ、免疫组化及阿霉素在细胞内的分布等实验。结果：含ＭＤＲ基因的逆转录病毒载体ｐＺＭＤＲ的构建方法证明是正确的，ＭＤＲ１ｃＤＮＡ已整合在染色体基因组中并表达Ｐ－糖蛋白。结论：建立的ＭＣＦ－７／ｐＺＭＤＲ细胞为一特异表达Ｐ－糖蛋白的多药抗药性转基因细胞株     

直肠癌组织中多药耐药基因表达的临床研究

目的：探讨多药耐药基因1(multidrug resistance gene 1，MDR1)表达产物P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)在直肠癌组织中表达的临床意义及对预后的影响。方法：用SABC法免疫组化染色检测62例直肠癌组织中P-gp表达情况，并与癌组织分化程度、临床分期(Duke’s分期)及预后进行相关性分析。结果：MDR1表达产物P—gp的阳性表达与直肠癌组织病理分化程度差异有统计学意义．临床分期方面差异无统计学意义．且与预后有关。P—gp高表达者5年生存率为43．2％，P-gp阴性表达者5年生存率为71．6％，两者差异有统计学意义，P=0．0344。结论：直肠癌组织MDR1的阳性表达具有先天耐药性，这是直肠癌术后辅助化疗效果不佳的主要原因，并影响生存率，癌组织中P-gp高表达音较阴性表达音预后差。     

热疗对人喉癌Hep-2顺铂耐药细胞株生物学行为的影响

目的:探讨热疗对人喉癌Hep-2顺铂耐药（Hep-2/CDDP）细胞株生物学行为的影响和可能机制。方法:采用高浓度冲击联合浓度递增法诱导建立Hep-2/CDDP细胞株。采用细胞计数法检测Hep-2亲代细胞株组（未发生顺铂耐药的Hep-2细胞,采用无顺铂的RPMI 1640培养液培养）、Hep-2/CDDP细胞组、Hep...     

甲基莲心碱逆转人胃癌细胞株多药耐药性

目的:研究新的钙阻断剂甲基莲心碱(Nef)对耐长春新碱(VCR)人胃癌细胞多药耐药性(MDR)的逆转作用及其机制。方法:采用MTT比色法测定药物的细胞毒作用,SP法免疫细胞化学及流式细胞术检测Nef对人胃癌细胞多药耐药性相关蛋白(MRP)表达的影响。结果:①在10μmol/L的浓度下,Nef对SGC7901及SGC7901/VCR无显著细胞毒作用;②2.5、5、10μmol/LNef能使VCR对SGC7901/VCR细胞的IC50从2.32μg/ml依次下降至0.340、0.128、0.053μg/ml,逆转倍数分别为6.8、18.1、43.8。在浓度为10μmol/L时,逆转活性较VRP为高(P<0.01);③SGC7901/VCR细胞较SGC7901细胞高表达MRP,经Nef处理后,SGC7901/VCR细胞MRP表达明显下降。表明Nef能下调SGC7901/VCR细胞MRP的表达。结论:甲基莲心碱在体外能逆转耐长春新碱人胃癌细胞(SGC7901/VCR)的多药耐药性。其机制可能与下调MRP的表达有关。     

不同mRNA差异显示法筛选胃癌细胞耐药相关基因的研究

 目的　比较银染和放射自显影mRNA差异展示方法在分离、克隆胃癌细胞耐药相关基因过程中的优缺点。方法　长春新硷诱导人胃癌SGC790 1细胞 ,建立稳定的耐药细胞亚系SGC790 1/VCR。同时应用银染和放射自显影的mRNA差异展示方法筛选胃癌SGC790 1细胞和耐药细胞亚系SGC790 1/VCR之间mRNA表达的差异。结果　显示银染法省时 ,花费少 ,操作方便 ;在获得差异条带方面放射自显影法明显优于银染法 ,且其能得到较多低丰度的差异表达基因 ;而两者在二次PCR扩增 ,克隆 ,测序 ,杂交鉴定及假阳性率方面无明显差异。结论　银染mRNA差异展示法适合于高丰度差异表达基因的快速筛选 ,而放射自显影mRNA差异展示则能较彻底地显示两种细胞中多数mRNA的差异     

下调EZH2基因对胃癌细胞株SGC7901增殖作用的影响

目的 探讨下调EZH2基因对胃癌细胞株SGC7901的增殖作用,研究EZH2基因在胃癌发生发展中的作用.方法 针对EZH2基因序列设计合成小干扰RNA片段(siRNA)及无效序列片段,将EZH2 siRNA转染至胃癌细胞株SGC7901中作为干扰组,以转染无效序列片段作为阴性对照组,以未作任何处理组作为空白对照组,采用荧光定量PCR(qRT-PCR)检测EZH2基因下调后EZH2 mRNA的表达,采用Western blot法检测EZH2蛋白表达量,采用CCK-8法检测细胞增殖的活性.结果 成功转染EZH2 siRNA至胃癌SGC7901细胞,干扰组的EZH2 mRNA和蛋白相对表达量较阴性对照组及空白对照组下降,且干扰组细胞增殖受到抑制.结论 下调EZH2基因的表达,使胃癌细胞增殖受到抑制,说明EZH2基因在胃癌细胞的增殖发展进程中有很重要的意义,为深入研究胃癌基因治疗提供一定的理论依据.     

Reversion of multidrug resistance by SKI-II in SGC7901/DDP cells and exploration of underlying mechanisms

In order to investigate whether SKI-II could reverse drug resistance and its possible mechanisms, we treated SGC7901/DDP cells with SKI-II or SKI-II in combination with DDP. Then cell growth, apoptosis, micro- morphological changes, and expression of SphK1, P-gp, NF-kB, Bcl-2 and Bax were assessed by MTT assay, flow cytometry, electron microscopy, immunocytochemistry and Western blot assay respectively. SGC7901/DDP cells were insensitive to cisplatin 2.5 mg/L, but when pretreated with SKI-II, their proliferation was inhibited by cisplatin 2.5mg/L significantly, the inhibition rate increasing with time and dose. The apoptosis rate was also significantly elevated. Expression of SphK1 and P-gp was decreased significantly, Pearson correlation analysis showing significant correlation between the two (r=0.595, P<0.01). Expression of NF-kB and Bcl-2 was decreased significantly, while that of Bax was increased, compared to the control group. There were significant correlations between SphK1 and NF-kB(r=0.723, P<0.01), and NF-kB and Bcl-2(r=0.768, P<0.01). All these data indicated that SKI-II could reverse drug resistance of SGC7901/DDP to cisplatin by down-regulating expression of P-gp and up-regulating apoptosis through down-regulation of SphK1. The increased apoptotic sensitivity of SGC7901/ DDP to cisplatin was due to the decreasing proportion of Bcl-2/Bax via down-regulating NF-kB.     

P13-K抑制剂LY294002逆转P-gP介导的白血病和胃癌细胞耐药

背景与目的：磷脂酰肌醇3-激酶／蛋白激酶B[phosphatidylinositol-3-kinase（P13-K）／proteinkinaseB（Akt）,P13-K／Aktl通路是调控细胞生存的重要信号转导通路之一。本研究旨在探讨P13-K抑制剂LY294002对P-gP过表达的人类白血病K562／DNR和胃癌SGC7901／ADR细胞多药耐药性的逆转作用。方法：将细胞分为单纯药物组和LY294002预处理组,单纯药物组分别以柔红霉素（daunorubicin,DNR）、阿霉素（adriamycin,ADR）、长春新碱（vincristine,VCR）和依托泊甙（etoposide,VP-16）处理,LY294002预处理组在加药前以LY294002进行预处理。用台盼蓝拒染法及MTT法检测药物敏感性及LY294002对细胞耐药性的影响。Westernblot检测K562／DNR和SGC7901／ADR细胞中P．gP及p-Akt的表达。流式细胞术检测细胞内药物浓度。结果：2．5μmol／LLY294002预处理显著降低DNR、ADR、VCR和VP-16对K562／DNR细胞的IC50,相对逆转效率分别为72．4％、64．9％、60．4％和52．8％。此外,LY294002部分逆转SGC7901／ADR对ADR的耐药性,相对逆转效率为31．0％。LY294002预处理可部分抑制p-Akt和P-gP的表达。随着处理时间的延长．K562／DNR、SGC7901／ADR细胞内DNR、ADR的蓄积效应有增强的趋势。结论：LY294002通过抑制P13-K／Akt信号转导通路,部分逆转P-gp介导的白血病和胃癌细胞的多药耐药。     

下调RPL23对胃癌耐药细胞SGC7901/ADR药物敏感性的影响

目的:检测人胃癌细胞系SGC7901及其阿霉素（ADR）耐药细胞系SGC7901/ADR中RPL23的表达差异,探讨胃癌细胞中RPL23表达对ADR耐药的影响。方法:qPCR检测RPL23在SGC7901/ADR与SGC7901两种细胞系中的表达差异;MTT法检测下调RPL23后SGC7901/ADR细胞对ADR的敏感性;流式细胞仪检测下调RPL23后对细胞凋亡的影响;Western Blot检测凋亡相关分子Bcl-2和Caspase-3蛋白的表达。结果:qPCR结果显示,RPL23在 SGC7901/ADR细胞系中的表达高于其在SGC7901细胞系中的表达(P＜0.001)。MTT法结果显示,下调RPL23后,在SGC7901/ADR细胞系中ADR的IC50明显升高(P＜0.001)。凋亡检测结果显示,下调RPL23后,SGC7901/ADR细胞凋亡率明显增加(P＜0.001)。Western Blot结果显示,下调RPL23后,细胞中Caspase-3表达明显升高,Bcl-2表达明显降低。结论:RPL23在SGC7901/ADR中的表达高于SGC7901细胞,下调RPL23表达可提高其对ADR的敏感性并促进细胞凋亡,提示RPL23可能通过作用于Bcl-2调节细胞凋亡。     

下调PHLDB3对胃癌耐药细胞系SGC7901/ADR药物敏感性的影响

目的:探讨下调PHLDB3对胃癌耐药细胞系 SGC7901/ADR 药物敏感性的影响。方法:采用实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）和蛋白免疫印迹技术（Western blot）的方法检测胃癌及癌旁正常组织中PHLDB3的表达（分别是20对和10对）;qRT-PCR和Western blot检测PHLDB3在胃癌细胞系 SGC7901以及胃癌耐药细胞系SGC7901/ADR和SGC7901/VCR中的表达;MTT法检测SGC7901、SGC7901/ADR及转染PHLDB3 siRNA后 SGC7901/ADR的半数抑制浓度（IC50）值;流式细胞仪检测细胞凋亡。结果:qRT-PCR和Western blot结果显示:PHLDB3在胃癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织（P<0.000 1）;PHLDB3在耐药细胞系SGC7901/ADR和SGC7901/VCR中的表达明显高于其亲本细胞系SGC7901（P<0.000 1和P<0.05）。Western blot结果显示:相对于转染 PHLDB3 negative control（NC）组,转染 PHLDB3 siRNA组的SGC7901/ADR细胞中PHLDB3的表达降低（P<0.005）。MTT结果显示:SGC7901与 SGC7901/ADR的IC50值分别为（1.5±0.1） μg/ml与（5.5±0.2） μg/ml（P<0.000 1）;SGC7901/ADR 转染 PHLDB3 siRNA 后对顺铂的IC50值明显下降（P<0.05）。流式细胞术（flow cytometry,FCM）检测凋亡,结果显示:下调PHLDB3的表达后,SGC7901/ADR细胞的凋亡率明显增加（P<0.05）。结论:PHLDB3能够促进胃癌细胞系 SGC7901/ADR产生多药耐药。